選擇性內(nèi)皮素受體A拮抗劑改善高血壓大鼠腦白質(zhì)病變*

王迪龍， 邱寶山， 林 晶， 蔡 穎， 范玉華

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 廣東 廣州 510030)

腦白質(zhì)病變(white matter lesions，WMLs)是指血管源性的腦白質(zhì)異常，影像學(xué)表現(xiàn)為T2加權(quán)成像中的白質(zhì)區(qū)域高信號(hào)，主要癥狀包括認(rèn)知功能下降、步態(tài)異常和排尿障礙顯著[1]。隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前WMLs在高齡人群中發(fā)現(xiàn)率可達(dá)90%以上[2]。目前多項(xiàng)證據(jù)提示缺血是導(dǎo)致WMLs的重要病因，但由于病理機(jī)制復(fù)雜，缺血與WMLs的具體關(guān)系仍不清楚。內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)是人體內(nèi)最強(qiáng)效的縮血管物質(zhì)[3]，通過結(jié)合血管平滑肌細(xì)胞上的內(nèi)皮素受體A(endothelin receptor A，ETRA)發(fā)揮縮血管作用。近年來動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ET-1與延遲性腦組織損傷有關(guān)[4-6]，而ETRA選擇性和非選擇性ETRA拮抗劑則具有神經(jīng)保護(hù)作用，其中安倍生坦作為一種選擇性ETRA拮抗劑，長(zhǎng)期應(yīng)用可減輕血管源性認(rèn)知功能損害[7]。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察選擇性ETRA拮抗劑的應(yīng)用是否能夠改善腦白質(zhì)病變的嚴(yán)重程度，并探索其機(jī)制。我們采用的易卒中型腎血管性高血壓改良的2VO(stroke-prone renovascular hypertensive rats-modified 2 vessel occlusion，RHRSP-modified 2VO)大鼠模型[8]能夠模擬人WMLs中慢性高血壓繼發(fā)性腦缺血的病理過程，并被證實(shí)存在認(rèn)知功能障礙和相關(guān)病理改變，是適用于研究WMLs的動(dòng)物模型。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

33只4周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重80～90 g,購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(粵)2013-0034，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí)環(huán)境)。隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組(n=9)，治療(treatment)組[RHRSP-modified 2VO+安倍生坦(n=12)]和溶劑對(duì)照(placebo)組[RHRSP-modified 2VO+0.5%羧甲基纖維素鈉(n=12)]，實(shí)驗(yàn)過程全部遵循科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

2 方法

2.1大鼠RHRSP-modified 2VO模型的制作 治療組和溶劑對(duì)照組的幼年大鼠按照雙腎雙夾法[9]制作RHRSP-modified 2VO模型。12周后取造模成功的大鼠(收縮壓>180 mmHg)先進(jìn)行右側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉(5-0縫合絲線先后結(jié)扎遠(yuǎn)、近心端后剪斷頸總動(dòng)脈)，24 h后用同樣方式夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈；假手術(shù)組除了鉗夾和結(jié)扎腎/頸總動(dòng)脈外，其余操作一樣。

2.2給藥方法 安倍生坦溶于0.5%羧甲基纖維素鈉，制備藥物濃度為5 g/L；17周(雙腎雙夾術(shù)后，下同)開始對(duì)治療組灌胃給藥(5 mg·kg-1·d-1)，溶劑對(duì)照組和假手術(shù)組給予相同劑量的0.5 %羧甲基纖維素鈉(5 mL·kg-1·d-1)灌胃，持續(xù)至20周。

2.3血壓測(cè)量 用ML866 Powerlab 4/30 型大鼠血壓計(jì)(ADInstruments Pty Ltd)經(jīng)尾動(dòng)脈測(cè)定各組大鼠收縮壓；12周評(píng)估RHRSP-modified 2 VO造模情況，收縮壓超過180 mmHg定義為造模成功；給藥期間(17～20周)連續(xù)監(jiān)測(cè)血壓變化，每周測(cè)量1次。

2.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 20周對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)流程參照既往研究中的步驟進(jìn)行[7]。大鼠于實(shí)驗(yàn)前 1 天在池中自行游泳 180 s 以適應(yīng)水溫和環(huán)境，第 1～5 天為定位航行實(shí)驗(yàn)(第III象限中間放置平臺(tái)，大鼠按4個(gè)入水點(diǎn)順序放入水池，每只大鼠入水順序相同，入水開始至登入平臺(tái)為逃避潛伏期，如果 60 s 未找到平臺(tái)則引導(dǎo)其登入平臺(tái)，此時(shí)記錄為 60 s)，以每天4個(gè)入水點(diǎn)的逃避潛伏期均數(shù)記錄為每天的逃避潛伏期；第 6 天為空間探索實(shí)驗(yàn)，撤掉平臺(tái)，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)及停留于第III象限的時(shí)間。

2.5腦組織取材 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用灌注取腦術(shù)處死所有大鼠；4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后取出大腦，4%多聚甲醛浸泡24 h以固定蛋白，隨后用20%～30%蔗糖溶液梯度浸泡脫水，于嗅球后方1.5 mm處取4 mm厚腦組織，包埋后制成冠狀面連續(xù)冰凍切片(10 μm)；生理鹽水灌注后取出大腦，于嗅球后方1.5 mm處取4 mm厚腦組織，-80 ℃保存。

2.6Luxol fast blue(LFB)染色 每只大鼠取同一層面切片進(jìn)行LFB染色：冰凍切片水化后放入0.1%LFB 染液于60℃烘箱過夜，先后浸泡 0.05%碳酸鋰和70%乙醇分化，梯度脫水、透明處理后封片，顯微鏡下觀結(jié)果。參照Z(yǔ)eng等[9]分級(jí)方法進(jìn)行WMLs分級(jí)：0級(jí):正常；1級(jí):神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂；2級(jí):明顯空泡形成；3級(jí):有髓神經(jīng)纖維消失。

2.7免疫熒光雙標(biāo)記 為了觀察皮層、胼胝體和尾殼核中ET-1與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscles actin，α-SMA)的共定位，將冰凍切片水化后進(jìn)行免疫熒光染色，封閉液封閉90 min后在4 ℃環(huán)境下孵育 I 抗16 h[小鼠抗大鼠α-SMA(1∶200，Abcam)、兔抗大鼠ET-1(1∶400，Abcam)]，隨后孵育熒光 II 抗1 h[抗兔紅光(1∶500，Cell Signing)、抗小鼠綠光(1∶500, Cell Signing)]，最后用DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

2.8ELISA法測(cè)定ET-1蛋白含量 從上述準(zhǔn)備好的腦組織中分別取皮層、胼胝體和尾殼核組織用于ET-1蛋白含量分析，參照ELISA試劑盒(R&D systems)的說明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期結(jié)果使用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析，WMLs分級(jí)使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性情況下組間比較使用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血壓測(cè)量結(jié)果

術(shù)后16周(基線)治療組和溶劑對(duì)照組的收縮壓明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；給藥期間，17～19周治療組與溶劑對(duì)照組間收縮壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在20周治療組收縮壓低于溶劑對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The systolic arterial pressure in different groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsplacebo group.

圖1各組大鼠動(dòng)脈收縮壓測(cè)量結(jié)果

2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在定位航行實(shí)驗(yàn)中，3組大鼠的逃避潛伏期均呈縮短趨勢(shì)；與溶劑對(duì)照組相比，治療組逃避潛伏期明顯縮短，在第3天和第5天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而與假手術(shù)組相比，溶劑對(duì)照組逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)，見圖2A；在第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，與溶劑對(duì)照組相比，治療組穿越平臺(tái)次數(shù)增多(P<0.05)，而與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2B；與溶劑對(duì)照組相比，治療組在第III象限停留時(shí)間所占比例有增加趨勢(shì)，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與假手術(shù)組相比，溶劑對(duì)照組在第III象限停留時(shí)間所占比例減少(P<0.05)，見圖2C。

Figure 2. The results for water Morris water maze test. A: the changes of escape latency； B: the numbers of crossing platform； C: the ratio of time spend in the target quadrant. Mean±SD.n=6*P<0.05vssham group;#P<0.05vsplacebo group.

圖2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 LFB染色結(jié)果

與假手術(shù)組和治療組相比，溶劑對(duì)照組大鼠腦白質(zhì)神經(jīng)纖維出現(xiàn)疏松、彌散性空泡形成及有髓神經(jīng)纖維的消失，見圖3；WMLs分級(jí)結(jié)果顯示，治療組分級(jí)顯著低于溶劑對(duì)照組(1.75±0.58vs2.25±0.50，P<0.05)，顯著高于假手術(shù)組(1.75±0.58vs0.25±0.50，P<0.05)。

Figure 3. The images of corpus callosum beside lateral ventricle under light microscope with LFB staining (×400). A: sham group; B: treatment group; C: placebo group. * indicated lateral ventricle.

圖3LFB染色觀察側(cè)腦室旁胼胝體

4 免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，假手術(shù)組(圖4 A、B、C)和治療組(圖4G、H、I)均未發(fā)現(xiàn)明顯ET-1與α-SMA共定位，而溶劑對(duì)照組在皮層(圖4 D)、胼胝體(圖4 E)和尾殼核(圖4 F)均發(fā)現(xiàn)有以小血管區(qū)域?yàn)橹鞯墓捕ㄎ弧?/p>

Figure 4. Double-labeled immunofluorescence of ET-1 (red) and α-SMA (green) to observe co-localization in cortex, corpus callosum and caudate putamen. Co-localization were not observed in the sham group (A, B, C, ×200) and the treatment group (G, H, I, ×400), but evidently observed in the placebo group (marked by white triangles, ×200) in areas of cortex (D), corpus callosum (E) and caudate putamen (F).

圖4免疫熒光雙標(biāo)觀察3組大鼠皮層、胼胝體和尾殼核區(qū)域ET-1和α-SMA的共定位情況

5 ELISA結(jié)果

各組大鼠皮層內(nèi)ET-1蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；在胼胝體和尾殼核內(nèi)，與溶劑對(duì)照組相比，治療組的ET-1蛋白含量明顯降低(P<0.05)，與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 5. The protein levels of ET-1 in the cortex, corpus callosum and caudate putamen were measured by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05vstreatment group.

圖5ELISA法測(cè)定各組大鼠皮層、胼胝體和尾殼核內(nèi)ET-1蛋白含量

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)選擇性ETRA拮抗劑安倍生坦能夠減輕高血壓慢性缺血狀態(tài)下的腦白質(zhì)損傷并改善腦白質(zhì)病變大鼠的認(rèn)知功能，而這種增益效果與降低血壓無明顯關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)外少有關(guān)于以ET-1和ETRA作為腦白質(zhì)病變治療靶點(diǎn)的研究，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前關(guān)于內(nèi)皮素系統(tǒng)和腦缺血的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[4-6]，均發(fā)現(xiàn)在缺血狀態(tài)下存在顱內(nèi)內(nèi)皮素系統(tǒng)的活躍，而ETRA選擇性阻滯劑的應(yīng)用可以降低ET-1水平并減輕腦損傷。而與其它短期缺血性實(shí)驗(yàn)不同的是，我們的將皮層、胼胝體和尾殼核分別進(jìn)行觀察，更進(jìn)一步研究了在慢性腦缺血環(huán)境下ET-1的表達(dá)及分布特點(diǎn)，對(duì)內(nèi)皮素受體拮抗劑減輕腦白質(zhì)病變大鼠慢性缺血狀態(tài)下的腦白質(zhì)損傷的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

1 內(nèi)皮素-1與腦白質(zhì)病變

以往研究證實(shí)ET-1水平的升高與缺血相關(guān)，在局灶性梗死模型中， ET-1的高表達(dá)區(qū)域主要集中在缺血半暗帶，升高的ET-1水平與梗死面積呈正相關(guān)[10]，而在全腦缺血模型中， ET-1則表現(xiàn)為全腦彌散性高表達(dá)[11]。與之前研究一致，本實(shí)驗(yàn)中RHRSP-modified 2VO大鼠模型與正常大鼠相比皮層、胼胝體和尾殼核區(qū)域的ET-1蛋白水平升高。Lehmberg等[4]發(fā)現(xiàn)ET-1升高與全腦缺血后顱內(nèi)微循環(huán)障礙相關(guān)；Murray等[12]的研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后ET-1與神經(jīng)炎癥反應(yīng)共同影響了缺血后組織再灌注機(jī)制。而腦白質(zhì)由于其解剖位置處于供血分水嶺區(qū)域，對(duì)缺血更敏感。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ET-1與α-SMA共定位最明顯的區(qū)域在小血管周圍，尤其是側(cè)腦室周圍的白質(zhì)，而側(cè)腦室周圍白質(zhì)在以往的研究中被證實(shí)是大鼠最常出現(xiàn)腦白質(zhì)病變的區(qū)域[13]。這一結(jié)果提示在慢性缺血的情況下小血管對(duì)ET-1敏感性可能增高。同樣，部分研究認(rèn)為是血流動(dòng)力學(xué)改變而非血管狹窄或梗阻引起了白質(zhì)缺血，并進(jìn)一步導(dǎo)致白質(zhì)損傷[14]。綜上所述，我們認(rèn)為ET-1水平升高并與小血管結(jié)合引起的微循環(huán)障礙可能是腦白質(zhì)病變的病因之一。

2 選擇性內(nèi)皮素受體A拮抗劑與腦白質(zhì)病變

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)安倍生坦治療組較溶劑對(duì)照組逃避潛伏期短，穿越平臺(tái)次數(shù)多，提示腦白質(zhì)病變的認(rèn)知功能得到改善。而進(jìn)一步的組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)治療組的白質(zhì)病變嚴(yán)重程度以及小血管周圍ET-1的表達(dá)量較溶劑對(duì)照組低。然而與溶劑對(duì)照組相比，治療組的收縮壓下降程度不大，這提示安倍生坦的增益效果可能與降低血壓無明顯關(guān)系，這一點(diǎn)與Kalk等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。雖然在部分研究中選擇性ETRA拮抗劑可顯著降低血壓[16]，但這可能與他們使用的高鹽飲食模型有關(guān)。生理狀態(tài)下的ET-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，通過旁分泌的形式作用于平滑肌細(xì)胞，同時(shí)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞參與其合成調(diào)節(jié)。但在病理狀態(tài)下激活的小膠質(zhì)細(xì)胞也可參與調(diào)節(jié)ET-1的合成與分泌[3]，這可能是其水平上升的原因之一。損傷區(qū)域升高的ET-1作用于血管平滑肌加重血流動(dòng)力學(xué)障礙產(chǎn)生延遲性損傷，進(jìn)而導(dǎo)致惡性循環(huán)。而安倍生坦拮抗ETRA后可阻止延遲性損傷，終止惡性循環(huán)，與本實(shí)驗(yàn)中拮抗ETRA后，白質(zhì)和認(rèn)知功能損害減輕及ET-1水平下降的現(xiàn)象一致。然而，選擇性ERTA拮抗劑改善腦白質(zhì)病變的具體機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。多數(shù)關(guān)于急性和亞急性缺血/梗死的研究證明，短期應(yīng)用ETRA選擇性拮抗劑可以改善腦組織供血[4]、抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)[12]、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]，起到神經(jīng)保護(hù)作用。與本研究結(jié)果類似，Mangat等[7]在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型中長(zhǎng)期應(yīng)用安倍生坦發(fā)現(xiàn)可改善血管性癡呆。上述證據(jù)與我們的研究結(jié)果共同提示，選擇性ETRA拮抗劑與降壓藥物聯(lián)合可能可以作為腦白質(zhì)病變的新型治療策略。

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)在RHRSP-modified 2VO模型中應(yīng)用選擇性ETRA拮抗劑安倍生坦能夠減輕腦白質(zhì)病變大鼠慢性缺血狀態(tài)下的腦白質(zhì)損傷，并改善認(rèn)知功能損害，且這種增益效果可能與直接拮抗白質(zhì)區(qū)域小血管平滑肌上的ETRA有關(guān)，而與降低血壓無明顯關(guān)系。提示ET-1水平升高并與小血管結(jié)合引起的微循環(huán)障礙可能是腦白質(zhì)病變的病因之一，ET-1與ETRA可能可以作為腦白質(zhì)病變的新型治療靶點(diǎn)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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