山柰酚-3-O-蕓香糖苷對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及TGFBR1信號通路活化的影響*

張文通， 李 俊， 吳玉婷， 范慧婕， 謝凌鵬， 譚章斌， 畢藝鳴， 劉 彬, 2△， 周迎春△

(1南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510505; 2廣州醫(yī)科大學(xué)心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)位于動脈血管壁中層，是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞之一。研究表明，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和向內(nèi)膜下遷移是動脈粥樣硬化和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)術(shù)后再狹窄的重要發(fā)病機(jī)制之一[1-3]。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和向內(nèi)膜下遷移促進(jìn)粥樣斑塊的形成和發(fā)展，動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定與血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)[4-5]。PCI術(shù)后，血管內(nèi)皮損傷、功能失調(diào)，血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移、內(nèi)膜增厚，再狹窄形成[6-7]。因此，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移是抗動脈粥樣硬化和預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄中的重要研究方向。

轉(zhuǎn)化生長因子β受體1(transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)的特異性受體，參與TGF-β的生理病理過程。TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，通過TGFBR1信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、基質(zhì)合成、鈣化和免疫應(yīng)答，以上生理病理過程參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8-9]。TGF-β在PCI術(shù)后患者中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)展[10-11]。部分學(xué)者提出了把TGFBR1作為動脈粥樣硬化早期診斷和PCI術(shù)后預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[12-13]。

山柰酚-3-O-蕓香糖苷(kaempferol-3-O-rutinoside，KR)是紅花的提取成分之一。紅花是常用的活血化瘀藥之一，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛的功效，臨床常用于血瘀相關(guān)疾病，近年來常用于治療心血管系統(tǒng)疾病，臨床中常用的紅花注射液即是以紅花作為主要成分的藥物制劑?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，紅花及其多個成分具有抗動脈粥樣硬化作用，如羥基紅花黃色素A、紅花黃色素和紅花酚苷等[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，KR具有降壓、減慢心率和抑制細(xì)胞內(nèi)脂肪合成的作用[16-17]。目前國內(nèi)尚未見KR對VSMC增殖和遷移影響和機(jī)制的報道。本項目將采用VSMC增殖和遷移體外模型，探索KR對VSMC的增殖、遷移及TGFBR1信號通路活化的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要實驗材料

大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞A7R5購自中科院細(xì)胞庫。山柰酚-3-O-蕓香糖苷購自成都曼思特生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清和胰酶購自Gibco；MTT購自碧云天公司；EdU染色試劑盒購自銳博生物公司；兔抗鼠p-TGFBR1抗體購自MyBioSource;兔抗鼠p-Smad2和p-Smad3抗體購自Cell Signaling；兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2和MMP9抗體購自Affinity Biosciences。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) A7R5細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、5×104U/L青霉素和50 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細(xì)胞長至60%～70%左右融合時傳代。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的A7R5細(xì)胞，以每孔5 000個細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔，用不同濃度(10、20和40 μmol/L)KR刺激24 h后，或用40 μmol/L KR刺激細(xì)胞24、48、72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 g/L 的MTT液，繼續(xù)孵育4 h。棄上清，每孔加入200 μL DMSO，脫色搖床震蕩10 min，結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀于570 nm測定吸光度(A)值。

2.3EdU染色檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的A7R5細(xì)胞，以每孔5 000個細(xì)胞接種于96孔板，不同濃度KR刺激24 h后。棄上清，每孔加入含100 μL EdU (50 μmol/L)的培養(yǎng)基孵育2 h，棄上清，PBS洗2次，每次5 min。每孔加入 50 μL 細(xì)胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)室溫孵育30 min，棄上清，每孔加入50 μL甘氨酸(2 g/L)，脫色搖床上孵育5 min，棄甘氨酸溶液，每孔加入100 μL PBS，脫色搖床上清洗5 min，棄PBS；每孔加入100 μL含0.5% TritonX-100的PBS于脫色搖床上孵育10 min，PBS洗1次，5 min；每孔加入100 μL 1×Apollo 染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床上孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；加入100 μL含0.5% TritonX-100的PBS于脫色搖床上清洗2～3次，每次10 min，棄滲透劑；每孔加入100 μL 甲醇清洗1～2次，每次5 min；PBS清洗1次，每次5 min；每孔加入100 μL 1×Hoechst 33342 反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床上孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；每孔每次加入100 μL PBS清洗1～3次；熒光顯微鏡觀察，每孔隨機(jī)選擇3個視野，計算EdU染色陽性細(xì)胞的比例。

2.4Transwell細(xì)胞遷移實驗 取對數(shù)生長期的A7R5細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，以每孔1×105個細(xì)胞接種于上室，上室每孔加入200 μL純DMEM培養(yǎng)基，下室加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，不同濃度KR刺激24 h后，用棉球抹去上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗2次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗2次，每次5 min，光鏡下觀察遷移到濾膜下室面的A7R5細(xì)胞并計數(shù)。

2.5分子對接 使用分子對接技術(shù)探索TGFBR1與KR之間的關(guān)系。從Protein Data Bank (PDB)蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫獲得TGFBR1(PDB ID：1PY5)的模擬分子結(jié)構(gòu)。從PubChem Compound數(shù)據(jù)庫取得KR(CID: 5318767)的3D分子結(jié)構(gòu)。采用AutoDock 4.2程序?qū)GFBR1進(jìn)行預(yù)處理，去除水分子和原始的配體，添加極性氫原子。采用YASARA軟件對受體蛋白和配體進(jìn)行能量最小化。以已知的TGFBR1抑制劑Quinoline與TGFBR1蛋白的結(jié)合位點為中心設(shè)置對接盒子，盒子大小50×50×50，盒子中心的坐標(biāo)為X=4.44、Y=8.00、Z=4.9，點格間距離為0.375 ?。采用Autodock VINA軟件進(jìn)行分子對接模擬，運用Lamarckian 遺傳算法，對小分子構(gòu)象和位置進(jìn)行全局搜索，依據(jù)最低結(jié)合能來選取最佳的結(jié)合構(gòu)象。采用Pymol 2.7和Chimera 1.8.1軟件進(jìn)行3D作圖。

2.6Western blot檢測蛋白水平 各組細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液提取蛋白。離心定量后蛋白樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫下5% BSA封閉2 h，加入 I 抗，4 ℃，搖床上緩慢搖動，孵育過夜。TBST洗滌3次，每次5 min，II 抗室溫孵育1 h，TBST脫色搖床上清洗3次，每次5 min。加入 ECL發(fā)光液100 μL，在MiniGel成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多個樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KR抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖

將不同濃度的KR刺激A7R5細(xì)胞24 h后，MTT法觀察KR對A7R5細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示，與control組相比，KR呈劑量依賴性抑制A7R5的細(xì)胞活力(P<0.05)，見圖1A。為了探索KR作用的時間效應(yīng)，我們將KR(40 μmol/L)與A7R5細(xì)胞孵育24、48和72 h，MTT法觀察KR對A7R5細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示與control組相比，KR時間依賴性的抑制A7R5細(xì)胞數(shù)量的增加(P<0.05)，見圖1B。EdU染色結(jié)果顯示，與control組相比，KR劑量依賴性的降低EdU陽性細(xì)胞比例(P<0.05)，見圖1C、D。

Figure 1. Kaempferol-3-O-rutinoside (KR) inhibited the proliferation of VSMC. A: the cell viability of VSMC treatment with different concentrations of KR was detected by MTT assay; B: the cell viability of VSMC with 40 μmol/L KR treatment for different time points was measured by MTT assay; C: the representative images of EdU staining (×100); D: the ratio of EdU positive cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1KR抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖

2 KR抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移

用不同濃度的KR刺激A7R5細(xì)胞24 h后，通過Transwell遷移實驗觀察KR對血管平滑肌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，KR劑量依賴性降低A7R5細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)，與control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Kaempferol-3-O-rutinoside (KR) inhibited VSMC migration (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2KR抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移

3 KR抑制VSMC遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)

用不同濃度的KR刺激A7R5細(xì)胞24 h后，Western blot法檢測A7R5細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP2和MMP9的表達(dá)，結(jié)果顯示，與control相比，KR可降低MMP2和MMP9的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Kaempferol-3-O-rutinoside (KR) inhibited expression of migration-associated protein in VSMC. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3KR抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)

4 KR與TGFBR1的分子對接模擬

采用AutoDock Vina分子對接方法評價TGFBR1與KR之間的關(guān)系。TGFBR1與KR的結(jié)合力為-9.804 kcal/mol,TGFBR1與KR結(jié)合的表面模擬模型見圖4A，KR位于TGFBR1抑制劑結(jié)合位點之中。KR與TGFBR1結(jié)合的絲帶模型見圖4B，KR分別與TGBFR1的SER-280、ARG-215和LYS-335氨基酸殘基形成1個氫鍵，氫鍵長度分為2.7、2.6和2.5?，與ASP-290氨基酸殘基形成3個氫鍵連接，氫鍵長度為2.3、2.4和2.6?。

5 KR對TGFBR1信號通路活化的影響

用不同濃度的KR刺激A7R5細(xì)胞24 h后，Western blot法檢測TGFBR1及其下游Smad2和Smad3的磷酸化水平，結(jié)果顯示，與control組相比，KR抑制p-TGFBR1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白水平(P<0.05)。

討 論

VSMC增殖和向內(nèi)膜下遷移是動脈粥樣硬化和PCI術(shù)后再狹窄的重要機(jī)制之一[1-3]。抑制VSMC增殖和遷移可以阻止內(nèi)膜新生，延緩動脈粥樣硬化進(jìn)展[18-19]。紅花作為常用的活血化瘀中藥，在動脈粥樣硬化治療中，效果顯著。本研究探索紅花有效成分KR對VSMC增殖和遷移的影響，進(jìn)一步闡明紅花抗動脈粥樣硬化的有效成分和相關(guān)機(jī)制。

既往研究發(fā)現(xiàn)紅花抗動脈粥樣硬化作用，能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[20-22]。KR是紅花的主要成分之一，既往研究證實KR具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、抗糖化、抑制脂肪合成和減輕急性肝損傷的作用[16, 23-25]。本項目探索了KR對血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響，結(jié)果顯示KR劑量及時間依賴性的降低細(xì)胞活力，劑量依賴性的減少EdU染色陽性細(xì)胞數(shù)量，降低遷移細(xì)胞數(shù)量，以上結(jié)果表明KR抑制VSMC增殖和遷移的作用，可能是紅花抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的主要成分之一。

Figure 4. Kaempferol-3-O-rutinoside (KR) docked to transforming growth factor beta receptor 1 (TGFBR1). A: the 3D surfaces model of docking KR into TGFBR1; B: the ribbon model of KR binding with TGFBR1.

圖4KR與TGFBR1分子對接模擬

Figure 5. Kaempferol-3-O-rutinoside (KR) suppressed the activation of TGFBR1 and its downstream proteins Smad2 and Smad3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5KR抑制TGFBR1及其下游Smad2和Smad3的激活

TGFBR1信號通路參與廣泛的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、基質(zhì)合成、鈣化和免疫應(yīng)答，這些生理病理過程均與動脈粥樣硬化和PCI術(shù)后再狹窄相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)抑制TGFBR1可以減少低密度脂蛋白同主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中蛋白聚糖的結(jié)合和預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄[26-27]，可見TGFBR1是防治動脈粥樣化硬發(fā)生發(fā)展的有效靶點。我們先采用分子對接技術(shù)探索KR與TGFBR1抑制的相互關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)KR與TGFBR1發(fā)生分子對接的結(jié)合力為-9.804 kcal/mol，提示KR與TGFBR1具有較好的結(jié)合活性。我們還發(fā)現(xiàn)KR能與TGBFR1的SER-280、ARG-215、ASP-290和LYS-335形成氫鍵連接，這些氨基酸殘基都位于TGFBR1的激酶區(qū)域內(nèi)，這些結(jié)果提示KR可能具有抑制TGFBR1活性的作用。因此，我們進(jìn)一步采用Western blot法檢測血管平滑肌細(xì)胞中TGFBR1的磷酸化水平，結(jié)果顯示KR能劑量依賴性的降低磷酸化TGFBR1的含量，提示KR可能通過抑制TGFBR1抑制VSMC的增殖和遷移。

Smad蛋白質(zhì)家族參與TGF-β、激活素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。參與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要是Smad2和Smad3。在TGF-β信號通路中，Smad2和Smad3被活化的TGFBR1相繼激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核參與目的基因的調(diào)控[28-29]。因此，我們進(jìn)一步檢測了VSMC細(xì)胞中Smad2和Smad3 的激活。結(jié)果顯示，KR劑量依賴性抑制TGFBR1其下游 Smad2和Smad3 的激活，這提示KR可能通過抑制TGFBR1從而抑制Smad信號的激活。既往研究發(fā)現(xiàn)Smad具有調(diào)控MMP2和MMP9表達(dá)作用[30]。本研究發(fā)現(xiàn)KR能夠降低MMP2和MMP9的表達(dá)，這提示KR可能通過抑制TGFBR1及其下游的Smad信號的激活，進(jìn)而抑制MMP2和MMP9的表達(dá)抑制VSMC的遷移。

綜上所述，在本研究中我們明確了KR能抑制VSMC的增殖和遷移，同時發(fā)現(xiàn)KR可能是一個潛在的TGBFR1抑制劑，其抗增殖及遷移的作用與抑制TGFBR1及其下游信號分子密切相關(guān)。本次研究結(jié)果提示抑制TGFBR1可能是KR防治動脈粥樣硬化以及其他心血管疾病的新靶點。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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