白果越橘組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究

畢海林，楊正松,2，楊洪濤，黃杏娥，和志嬌，木永青，和加衛(wèi)*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199;2.麗江藍(lán)瑪生物科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，云南 麗江 674199)

白果越橘(VacciniumleucobotrysNutt.)，是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)的一種常綠灌木。越橘屬約有450種，分布北半球溫帶、亞熱帶，美洲和亞洲的熱帶山區(qū)。我國(guó)已知91種、24變種、2亞種，主產(chǎn)分布在西南和華南地區(qū)，云南省已知的越橘屬植物有45種、12變種[1]。白果越橘通常附生，高0.5～1.0 m，果實(shí)球形或略扁，綠色至雪白色，果梗紅色，棒狀，花期3～4月，果期5～8月，分布于中國(guó)云南(貢山、碧江、滬水)、西藏(墨脫)，也分布于不丹、印度(阿薩姆)和緬甸(東北部)，生長(zhǎng)于海拔2100～2800 m的常綠闊葉林中，附生樹(shù)上或巖石上[2]。越橘屬果實(shí)基本為藍(lán)果類型，極少數(shù)為紅果類型，如紅豆越橘(Vacciniumvitis-idaea)、蔓越橘(Oxycoccos)、紅果越橘(VacciniumhirtumThunb.)和紅莓苔子(VacciniumoxycoccosLinn.)等，目前培育成的紅果類型越橘栽培品種為紅粉佳人。越橘屬白果類型僅為白果越橘，其果實(shí)雪白色，晶瑩剔透，果實(shí)不但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且十分漂亮，具有較高的觀賞價(jià)值。白果越橘果實(shí)極具特色，因此可在越橘育種工作中發(fā)揮極重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)白果越橘的研究?jī)H限于野生資源分布及其生物學(xué)性狀等，白果越橘資源收集及評(píng)價(jià)、引種馴化、嫁接、根瘤及其菌根真菌、種苗繁育技術(shù)等方面的研究還需要進(jìn)一步加強(qiáng)，以此對(duì)我國(guó)的白果越橘種質(zhì)資源進(jìn)行合理開(kāi)發(fā)利用。研究白果越橘種苗快速繁育技術(shù)，對(duì)保存我國(guó)的越橘種質(zhì)資源和合理開(kāi)發(fā)利用將發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，越橘栽培品種組織培養(yǎng)育苗技術(shù)在我國(guó)已經(jīng)比較成熟。劉慶忠[3]、李麗容[4]、張長(zhǎng)青[5]、朱忠榮[6]、余強(qiáng)波[7]、劉捷[8]等對(duì)兔眼藍(lán)莓和高叢藍(lán)莓進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)研究。和加衛(wèi)等[9]對(duì)野生越橘云南越橘進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，而白果越橘的組培快繁技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)白果越橘進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)研究，摸索出了白果越橘組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，為下一步白果越橘資源的開(kāi)發(fā)利用奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

白果越橘(VacciniumleucobotrysNutt.)的果實(shí)、種子及植株枝條取自云南省麗江高山植物園資源圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒及初代培養(yǎng) 以白果越橘成熟果實(shí)內(nèi)帶果肉的新鮮種子、干種子、嫩枝條莖段作為外植體。8月中旬取白果越橘成熟果實(shí)和枝條進(jìn)行處理，干種子為成熟果實(shí)中洗出并晾干的當(dāng)年種子。外植體消毒和接種:以成熟果實(shí)為消毒材料，將帶果肉的種子作為外植體；以用水浸泡2 d的種子為外植體；以帶1～2個(gè)腋芽的嫩莖段為外植體；將果實(shí)、種子、莖段均用洗衣粉液浸泡5 min，流水沖洗2 h，然后放入超凈臺(tái)，70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞溶液分別消毒15、6和10 min，無(wú)菌水浸洗5次后供接種使用；將消毒后的果實(shí)去除果皮，將內(nèi)部帶著果肉的種子和莖段直接接種在以下4種培養(yǎng)基上。4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L ZT、WPM+1.0 mg/L ZT，培養(yǎng)溫度為25 ℃,光照強(qiáng)度為2000 lx,光照時(shí)間為12 h/d，培養(yǎng)基pH為5.4。1個(gè)果實(shí)接種5瓶培養(yǎng)基，1瓶培養(yǎng)基接種1粒種子，1瓶培養(yǎng)基接種1個(gè)莖段，以12個(gè)果實(shí)、60粒種子、60個(gè)莖段為1個(gè)組合，分別重復(fù)3次，60 d以后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 培養(yǎng)基均為WPM培養(yǎng)基。將初代培養(yǎng)萌發(fā)的種子苗和腋芽剪成1 cm的莖段，接種到含不同激素的8種增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基見(jiàn)表2,培養(yǎng)基pH為5.4。每瓶接10個(gè)莖段，3瓶作為一個(gè)觀察組合，60 d后觀察苗的生長(zhǎng)情況及統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)；將培養(yǎng)基pH值分別設(shè)定為4.2、4.6、5.0、5.4、5.8，培養(yǎng)基中激素均為ZT，濃度為0.5 mg/L，每種pH值接種3瓶，每瓶接10個(gè)莖段，每個(gè)莖段長(zhǎng)1 cm左右，60 d后測(cè)量苗的長(zhǎng)度及統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)及試管外扦插 將試管苗剪去基部愈傷組織，蘸1000 mg/L NAA后分別扦插在松針?lè)?、苔蘚、草炭土和細(xì)腐殖土4種基質(zhì)中，基質(zhì)分別盛放在70孔穴盤中，每種基質(zhì)觀察3個(gè)穴盤，扦插以后放入大棚內(nèi)，觀察生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同白果越橘外植體初代培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

由表1可以看出，白果越橘成熟果實(shí)中帶果肉的種子、干種子和植株嫩莖段用0.1%升汞溶液分別消毒15、6、10 min后，污染率均較低。成熟果實(shí)中帶果肉的種子在培養(yǎng)基上2～3 d就開(kāi)始膨大，5 d就開(kāi)始萌發(fā)，萌發(fā)很快，且萌發(fā)率很高，除極細(xì)小的不飽滿種子外基本都能萌發(fā)；而浸泡的干種子萌發(fā)較慢，萌發(fā)率也較低，有些種子一直不萌發(fā)，種皮變褐，說(shuō)明消毒劑對(duì)種子造成了傷害，而且干種子經(jīng)過(guò)儲(chǔ)藏后活力也有所降低；莖段在不同種類培養(yǎng)基上腋芽的萌發(fā)時(shí)間差別較大，WPM培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)較快，MS培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)較慢，而2種培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)率倒是差異不大。成熟果實(shí)中帶果肉的種子、干種子和莖段在4種培養(yǎng)基上苗的生長(zhǎng)速度差異相當(dāng)明顯，WPM培養(yǎng)基上苗生長(zhǎng)較快，MS培養(yǎng)基上苗生長(zhǎng)較慢，加有玉米素ZT的培養(yǎng)基中苗的生長(zhǎng)速度明顯比加有6-BA和NAA的培養(yǎng)基快得多。由此說(shuō)明，加有玉米素ZT的WPM培養(yǎng)基有利于白果越橘種子實(shí)生苗及莖段腋芽的生長(zhǎng)。

另外，白果越橘種子萌發(fā)后，在莖的基部有橢圓形淡綠色的組織形成，在實(shí)生苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中逐漸變成淡黃紅色，并在相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)仍然存在，這種橢圓形組織在發(fā)育過(guò)程中的變化有待進(jìn)一步觀察。該橢圓形組織可能是白果越橘的根瘤，需要進(jìn)一步進(jìn)行成分分析及鑒定。

2.2 白果越橘在不同條件下繼代增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同激素配比對(duì)白果越橘增殖的影響 由表2可以看出，培養(yǎng)60 d后，不同濃度的6-BA和NAA對(duì)白果越橘的增殖影響均不明顯，白果越橘試管苗生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)高較少，有黃綠色愈傷組織形成，但愈傷組織不分化形成叢生芽，說(shuō)明6-BA和NAA對(duì)白果越橘的增殖效果不顯著。而加有玉米素ZT的培養(yǎng)基中，苗生長(zhǎng)較好，增殖系數(shù)均較高，ZT濃度較低時(shí)，試管苗較高，基本上都是單苗，極少形成叢生苗，隨著ZT濃度增高，有較多的苗形成叢生苗，并且隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，試管苗逐漸細(xì)弱。綜合來(lái)看，WPM+0.5 mg/L ZT更有利于白果越橘的長(zhǎng)期增殖及生根培養(yǎng)。

表1 3種白果越橘外植體初代培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

表2 白果越橘在不同激素配比條件下的增殖情況

2.2.2 不同pH值對(duì)白果越橘增殖的影響 由表3可以看出，不同pH值對(duì)白果越橘增殖影響極大。在試驗(yàn)過(guò)程中，pH值為4.2時(shí)，每升培養(yǎng)基需要加入大量瓊脂粉培養(yǎng)基才能凝固，且培養(yǎng)基顏色不透亮，幾乎沒(méi)有彈性，增殖60 d后，苗幾乎沒(méi)有長(zhǎng)高，苗幾乎沒(méi)有什么變化。pH值為4.6時(shí)，每升培養(yǎng)基也需要加入大量瓊脂粉培養(yǎng)基才能凝固，培養(yǎng)基顏色不透亮，幾乎沒(méi)有彈性，增殖60 d后，苗長(zhǎng)高較少。pH值為5.0時(shí)，每升培養(yǎng)基需要加入較多瓊脂粉培養(yǎng)基才能凝固，且培養(yǎng)基顏色較透亮，稍有彈性，增殖60 d后，苗長(zhǎng)高較多，部分苗基部形成2個(gè)叢生芽。當(dāng)pH值為5.4時(shí)，每升培養(yǎng)基加入較少瓊脂粉培養(yǎng)基就能凝固，且培養(yǎng)基顏色透亮，很有彈性，增殖60 d后，苗長(zhǎng)高最多，部分苗基部形成2～3個(gè)叢生芽，增殖系數(shù)最高。pH值為5.8時(shí)，每升培養(yǎng)基加入少量瓊脂粉培養(yǎng)基就能凝固，且培養(yǎng)基顏色很透亮，有彈性，增殖60 d后，苗長(zhǎng)高較多，部分苗基部也形成2個(gè)叢生芽。綜上所述，較高的pH值有利于白果越橘的增殖，培養(yǎng)基pH值為5.4時(shí)，試管苗增殖系數(shù)最高，白果越橘的增殖效果最好。

2.3 不同基質(zhì)對(duì)白果越橘試管苗瓶外扦插生根的影響

藍(lán)莓組培苗在試管內(nèi)生根效果不佳，生根慢，生根率僅為30%～70%，因此主要采用試管外生根方法[10]。因此，本試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)白果越橘進(jìn)行試管內(nèi)生根培養(yǎng)，而是直接進(jìn)行試管外扦插生根試驗(yàn)。

表3 白果越橘在不同pH值培養(yǎng)基中的增殖情況

由表4可以看出，白果越橘試管苗扦插在4種基質(zhì)中的生根情況均較好。苔蘚和草炭土13 d左右后多數(shù)枝段基部均形成少量愈傷組織，愈傷組織及其稍上方冒出數(shù)目不一的無(wú)色短根，一段時(shí)間后根變白，再變黃，60 d后統(tǒng)計(jì)觀察發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)枝段均長(zhǎng)根，生根率達(dá)到95%左右，且根基本長(zhǎng)滿整孔基質(zhì)，草炭土中的苗長(zhǎng)高較多，苔蘚中的苗長(zhǎng)高較少；細(xì)腐殖土為基質(zhì)的穴盤中，15 d后多數(shù)枝段基部也形成少量愈傷組織，愈傷組織及其稍上方冒出數(shù)目不一的無(wú)色短根，一段時(shí)間后根變白，再變黃，60 d后統(tǒng)計(jì)觀察發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)枝段均長(zhǎng)根，生根率達(dá)到91%左右，根基本長(zhǎng)滿整孔基質(zhì)，苗長(zhǎng)高很多；松針?lè)蹫榛|(zhì)的穴盤中，約16 d后多數(shù)枝段基部也形成少量愈傷組織，愈傷組織及其稍上方冒出數(shù)目不一的無(wú)色短根，一段時(shí)間后根變白，再變黃，60 d后統(tǒng)計(jì)觀察發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)枝段均長(zhǎng)根，生根率稍低，為87%左右，苗長(zhǎng)高也較少。由此可見(jiàn)，苔蘚、草炭土和細(xì)腐殖土均可作為白果越橘試管苗瓶外生根的基質(zhì)。

表4 白果越橘試管苗在4種基質(zhì)中的生根情況

3 討論與結(jié)論

越橘屬白果類型僅為白果越橘，果實(shí)極具特色，具有較高的觀賞價(jià)值，在越橘育種工作中具有極重要的應(yīng)用價(jià)值。研究白果越橘組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，對(duì)保存我國(guó)的越橘種質(zhì)資源和合理開(kāi)發(fā)利用將發(fā)揮重要作用。

組織培養(yǎng)育苗方法已在藍(lán)莓生產(chǎn)上獲得成功并成為我國(guó)目前藍(lán)莓育苗的一種主要方式。應(yīng)用組培方法繁殖速度快，結(jié)合日光溫室等可以不受季節(jié)限制，并有利于苗木的生長(zhǎng)，適宜于優(yōu)良品種的快速擴(kuò)繁。藍(lán)莓組培苗在試管內(nèi)生根效果不佳，生根慢，生根率僅為30%～70%，因此主要采用試管外生根方法[10]。目前，藍(lán)莓生根扦插基質(zhì)主要為苔蘚和草炭土，一般在扦插13 d后就開(kāi)始生根，生根效果好，生根率高。

本試驗(yàn)嘗試用2種新的扦插基質(zhì)，即松針?lè)酆图?xì)腐殖土，生根效果也較好。其中細(xì)腐殖土生根率較高，而且苗長(zhǎng)根以后，苗生長(zhǎng)明顯較快，主要是因?yàn)楦惩琉B(yǎng)分較足，有利于促進(jìn)苗的生長(zhǎng)，因此，腐殖土是一種很好的白果越橘扦插基質(zhì)。松針也是粉碎后才能作為扦插基質(zhì)，本試驗(yàn)中以其為扦插基質(zhì)，苗的生根率較低，苗長(zhǎng)根以后生長(zhǎng)也較緩慢，但松針的成本較低。以草炭土作為生根基質(zhì)，苗長(zhǎng)根以后生長(zhǎng)也較快，但根部土團(tuán)容易散開(kāi)，不方便運(yùn)輸，只宜就近上缽管理。而以苔蘚、松針?lè)?、?xì)腐殖土為基質(zhì)，根長(zhǎng)好以后，根在這3種基質(zhì)中很好地纏繞形成不易散開(kāi)的團(tuán)塊，方便長(zhǎng)途運(yùn)輸。因此，各地應(yīng)根據(jù)自身實(shí)際，來(lái)選擇白果越橘試管外生根扦插基質(zhì)。

試驗(yàn)表明，白果越橘成熟果實(shí)中的新鮮種子和嫩莖段是白果越橘組織培養(yǎng)適宜的外植體。激素對(duì)于植物組織和器官的形成具有重要作用，植物的每個(gè)生理生化過(guò)程都直接或間接地受到生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)控。[11]本試驗(yàn)表明，幾種激素中，玉米素對(duì)白果越橘種子實(shí)生苗及嫩莖段腋芽萌發(fā)、生長(zhǎng)以及增殖效果最好。WPM+1.0 mg/L ZT最有利于白果越橘種子實(shí)生苗及嫩莖段腋芽萌發(fā)及生長(zhǎng)。WPM+0.5 mg/L ZT有利于白果越橘的大量增殖。培養(yǎng)基pH值對(duì)其增殖有很大影響，pH值為5.4最有利于白果越橘的增殖，試管苗增殖系數(shù)最高。細(xì)腐殖土是一種較理想的扦插基質(zhì)，可以替代苔蘚和草炭土作為白果越橘試管苗的扦插基質(zhì)。

另外，白果越橘種子萌發(fā)后，在莖的基部有橢圓形淡綠色的組織形成，這種橢圓形組織在苗的發(fā)育過(guò)程中隨著實(shí)生苗的長(zhǎng)大而逐漸變大。該橢圓形組織可能是白果越橘的根瘤，需要進(jìn)一步進(jìn)行成分分析及鑒定。如果確實(shí)是根瘤的話，根瘤的形成是菌根真菌侵染的結(jié)果，那就說(shuō)明白果越橘實(shí)生苗中有菌根真菌的存在，這將是一項(xiàng)具有重要意義的研究?，F(xiàn)已確認(rèn)侵染越橘的菌根真菌類型為內(nèi)生菌根真菌,這一類菌根真菌專性寄生杜鵑花科植物,因而統(tǒng)稱為杜鵑花菌根真菌(Ericoidmycorrhiza)[12-16]。在自然條件下，越橘都與菌根真菌共生。本研究主要是對(duì)白果越橘進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)研究，白果越橘的根瘤以及菌根真菌以及其他開(kāi)發(fā)利用還有待于今后更加深入的研究。

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