不同年份普洱茶體外降糖降脂作用及其物質(zhì)基礎(chǔ)

孫世利，劉雅瓊，劉瑾，張靈枝，鄭少烘，孫伶俐，*，陳文品，*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642；3.西雙版納歲月知味茶業(yè)有限公司，廣東東莞523000）

茶（Camellia sinensis）是山茶科山茶屬多年生常綠植物，原產(chǎn)于中國西南邊陲。按照加工工藝分為綠茶、紅茶、烏龍茶、黑茶、白茶和黃茶六大類，不同茶類由于其所含生物活性成分不同，其功效活性也有所不同。其中多酚類化合物被公認(rèn)為是綠茶中對健康有益的最主要成分，茶黃素和茶紅素是紅茶中主要和含量最高的成分[1]。普洱茶屬于六大茶類的黑茶，按照加工工藝及品質(zhì)特征，分為生茶和熟茶兩種類型。生茶是以茶葉鮮葉為原料，經(jīng)殺青、揉捻、日光干燥、蒸壓成型等工藝制成的緊壓茶。熟茶是以云南大葉種曬青茶為原料，采用特定工藝、經(jīng)后發(fā)酵（快速后發(fā)酵或緩慢后發(fā)酵）加工形成的散茶和緊壓茶[2]。普洱生茶和熟茶都可長期貯藏存放，隨著存放時間的推移，后發(fā)酵程度越來越重[3]，其品質(zhì)滋味和香氣越來越優(yōu)異，“越陳越香，紅褐明亮”也是普洱茶最為典型的特征。

普洱茶在加工或貯存過程中，茶葉多酚類在微生物的作用下發(fā)生一系列復(fù)雜的酶促和非酶促氧化反應(yīng)，從而形成比紅茶中更為復(fù)雜的酚性化合物，且茶葉中的氨基酸、可溶性糖等成分含量也會發(fā)生顯著的變化，這些物質(zhì)成分的變化也導(dǎo)致普洱茶品質(zhì)風(fēng)味發(fā)生了改變，同時賦予了普洱茶某些特殊功效[4-6]。目前已報道，普洱茶具有降血糖[7-9]、降血脂[10]、減肥[11-14]、抗病毒[15]、抗癌[16-18]及抗菌活性[19-20]等多種保健功能，陳年普洱也具有顯著的清除自由基活性[21]。其中普洱茶的降血糖和降血脂功效最受關(guān)注。

高血糖是臨床上常見的慢性疾病，近年來其患病率不斷增高，目前，我國糖尿病患病人數(shù)已長時間居世界首位，并預(yù)計仍將持續(xù)較長一段時間[22]。高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝異常的疾病，是引發(fā)心腦血管疾病的主要原因之一[23]。糖尿病和高脂血癥常常會合并發(fā)生，可進(jìn)一步導(dǎo)致心血管病、腫瘤等相關(guān)疾病，復(fù)雜的病因機(jī)制也使其在當(dāng)今多學(xué)科領(lǐng)域受到高度關(guān)注。

本研究以體外活性評價手段，以不同年份的普洱生茶和熟茶為材料，探討陳年普洱茶的體外抗氧化、降血糖、降血脂功效及其物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為普洱茶的收藏與鑒賞提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生普茶樣：2006年、2010年和2015年易武古樹七子餅，由西雙版納歲月知味茶業(yè)有限公司提供；熟普茶樣：2006年、2010年和2015年遠(yuǎn)年七子餅茶，由云南宜良祥龍茶廠提供。乙腈、甲醇、乙酸、乙酸乙酯（色譜純）：美國MREDA TECHNOLOGY公司；α-淀粉酶（α-Amylase，AMS）試劑盒、脂肪酶（Lipase，LPS）試劑盒：南京建成生物工程研究所；三吡啶三吖嗪（2，4，6-Tri（2-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ）、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：美國Sigma公司。1200Series高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 普洱茶樣品提取物的制備

稱取一定量的普洱生茶和熟茶，經(jīng)粉碎后，稱取茶樣5.0 g，加入200mL沸蒸餾水在90℃水浴浸提30min，趁熱抽濾茶湯，共浸提3次，茶湯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來體積的1/10，冷凍干燥得到普洱生茶和熟茶提取物。

1.2.2 FRAP法檢測普洱茶抗氧化活性

鐵離子還原/抗氧化能力分析法（Ferric Reducing/AntioxidantPower，F(xiàn)RAP）：該方法原理為在酸性條件下，受試樣品中的還原性物質(zhì)可將Fe3+-TPTZ還原為Fe2+-TPTZ，且呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，在593 nm處有最大吸光度，檢測藍(lán)色物質(zhì)生成量即可反映受試樣品的還原能力，即樣品的總抗氧化能力。以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)溶液計算標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品反應(yīng)后所測得的吸光值A(chǔ)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)FeSO4濃度，單位為mmol/L，此值定義為FRAP值，所得FRAP值越大，樣品抗氧化活性越強(qiáng)。

1.2.3 普洱茶對α-淀粉酶活性的抑制

淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物濃度已知并且過量的情況下，加入碘液與未水解的淀粉結(jié)合生成藍(lán)色復(fù)合物，根據(jù)藍(lán)色的深淺可推算出水解的淀粉量，從而計算出AMS的活力。將底物緩沖液37℃預(yù)溫5min以上；取預(yù)熱的底物緩沖液0.5mL置于試管中，加入0.1mL超純水，作為空白管；取預(yù)熱的底物緩沖液0.5mL置于試管中，加入0.05mL超純水和0.05mL酶液，作為酶液管；取普洱茶樣水提物溶液0.05mL置于試管中，并加入預(yù)熱的底物緩沖液0.5mL和0.05mL酶液，作為樣品管，做3次重復(fù)；取普洱茶樣水提物溶液0.05mL置于試管中，加入0.05mL超純水和底物緩沖液，作為樣品對照管，做3次重復(fù)；以上溶液混勻，在37℃水浴鍋中準(zhǔn)確反應(yīng)7.5min；每個試管中分別加入0.5mL碘應(yīng)用液和3mL超純水，混勻；分光光度計調(diào)至600 nm處，1 cm光徑玻璃比色皿，以空白管調(diào)零，酶管吸光值記錄為A1，樣本管吸光值記錄為A2，樣本對照管記錄為A3。計算公式：

1.2.4 普洱茶對脂肪酶活性的抑制

甘油三酯和水制成的乳膠對入射光的吸收和散射具有乳濁性狀，膠束中的甘油三酯在脂肪酶（Lipase）作用下發(fā)生水解，使膠束分裂，散射光或濁度因而降低，減低的速率與脂肪酶活力有關(guān)，降低速率越快，脂肪酶活力越高，受試樣品對于脂肪酶的抑制率越低。樣本脂肪酶單位定義：在37℃條件下，每升樣本在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1min，每消耗1μmol底物為一個酶活力單位。分光光度計調(diào)至420 nm處，1 cm光徑玻璃比色皿，用Tris緩沖液調(diào)零；取底物緩沖液2mL加生理鹽水75μL，420 nm處比色，讀取吸光值A(chǔ)S，此AS值相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管（454μmol/L）的濃度的吸光度值；將底物緩沖液37℃預(yù)溫5min以上；取普洱茶樣水提物溶液各50μL，3次重復(fù)，吸取已經(jīng)預(yù)溫好的底物緩沖液2mL，快速混勻并計時；迅速倒入比色皿中，在分光光度計420 nm處比色，30 s時讀取吸光度A1；將此比色液倒入原試管中，37℃準(zhǔn)確水浴10 min，接著迅速倒入比色皿中，10min 30 s時讀取吸光度 A2；求出兩次吸光度差值（ΔA=A1-A2）。

計算公式

1.2.5 普洱茶生化物質(zhì)成分測定

水分測定：103℃恒重法；茶多酚含量：GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；水浸出物測定：GB/T 8305-2013《茶水浸出物測定》；游離氨基酸含量：GB/T 8314-2013《茶游離氨基酸總量的測定》；可溶性糖含量：蒽酮-硫酸比色法；茶黃素、茶紅素、茶褐素總量測定：系統(tǒng)比色法。

1.2.6 高效液相色譜法檢測兒茶素與咖啡堿單體含量

色譜柱：phenomenex C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；檢測波長280 nm；檢測溫度28℃；流動相A：含0.5%乙酸、1%乙腈和2%甲醇的水溶液，流動相B：含0.5%乙酸、10%乙腈和20%甲醇的水溶液；洗脫步驟：在30min內(nèi)，A相由72.5%到20%，B相由27.5%到80%，30min后在5min內(nèi)，A相由20%恢復(fù)到72.5%，B相由80%恢復(fù)到27.5%，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL。以外標(biāo)法按峰面積進(jìn)行定量。

1.2.7 感官評價

按照GB/T 23776-2009《茶葉感官審評方法》[24]中的審評方法制備待測茶湯，分別對不同貯存年份普洱茶茶樣進(jìn)行感官評審，由專業(yè)教師密碼審評，用茶葉審評評語反應(yīng)各茶樣的品質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖，數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。用One-way ANOVA進(jìn)行組內(nèi)比較，用Student’s t-test進(jìn)行同一年份不同茶樣之間比較，并進(jìn)行差異顯著性分析，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶的抗氧化能力

不同年份普洱熟茶與生茶的抗氧化能力如圖1所示。

圖1 不同年份普洱茶的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of Pu'er tea in different years

3個生普茶樣的抗氧化能力極顯著強(qiáng)于3個熟普茶樣，3個年份的熟普茶樣間抗氧化能力無顯著差異，生普組以2006年茶樣抗氧化能力最強(qiáng)，顯著高于2010年茶樣（p＜0.05），但與2015年茶樣相比無顯著差異。結(jié)果表明，隨著貯存時間的推移，普洱生茶和熟茶的抗氧化能力變化并不明顯。

2.2 普洱茶的抑制α-淀粉酶活性

α-淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液淀粉酶和胰液淀粉酶活性，阻礙食物中碳水化合物的代謝，降低機(jī)體的血糖和血脂水平，防止餐后高血糖的發(fā)生，對α-淀粉酶抑制作用，可以作為中藥治療糖尿病的酶學(xué)依據(jù)[25]。不同年份普洱茶抑制α-淀粉酶活性如圖2所示。

圖2 不同年份普洱茶對α-淀粉酶的抑制率Fig.2 α-amylase Inhibitory rateof Pu'er tea stored atdifferent years

生普組2006年和2010年樣品相比熟普組2006年和2010年樣品具有顯著的α-淀粉酶抑制活性（p＜0.05），但2015年生普和熟普抑制α-淀粉酶活性無顯著差異；熟普組隨著貯存時間的延長，其抑制α-淀粉酶活性越來越弱，其中2006年樣品與2015年樣品相比達(dá)極顯著差異水平（p＜0.01）。

2.3 普洱茶的抑制脂肪酶活性

胰脂肪酶是一種由胰腺分泌的脂肪分解酶，在消化甘油三酯中起著重要作用，它可以消化食物中50%～70%膳食脂肪類，應(yīng)用脂肪酶抑制劑可有效抑制脂肪酶對脂肪的分解作用，從而達(dá)到減少脂肪吸收、控制和治療肥胖的目的[26]。不同年份普洱茶處理后的脂肪酶活性見圖3。

圖3 不同年份普洱茶處理后的脂肪酶活性Fig.3 Lipaseactivity after Pu'er tea treated in different years

生普組三茶樣與同一年份熟普組茶樣相比，都具有極顯著的脂肪酶抑制活性（p＜0.01）；熟普組三茶樣的抑制脂肪酶活性無顯著差異；生普組以2015年抑制脂肪酶活性最強(qiáng)，其次是2006年茶樣。

2.4 普洱茶的常規(guī)化學(xué)成分含量

貯存不同年份的普洱熟茶和生茶樣品中主要滋味品質(zhì)化學(xué)成分含量結(jié)果見表1。

表1 普洱茶生化成分含量表（M±SD，n=3）Table1 Contentsofbiochem ical composition table in Pu'er tea（M ean ± SD，n=3）

由表1可知，同一年份生普組茶樣的水浸出物、游離氨基酸、茶多酚、茶紅素含量明顯高于同一年份熟普組茶樣，含水量、黃酮類、茶褐素含量顯著低于同一年份熟茶組茶樣。同一茶類組內(nèi)3個不同年份的茶樣相比，隨著貯存時間的延長，茶樣的含水量、茶紅素含量逐漸增加，茶多酚含量逐漸下降，水浸出物、黃酮類、可溶性糖含量變化不大；其中生普組三茶樣隨著貯存時間的延長，游離氨基酸含量顯著下降。熟普組2006年茶樣與2015年茶樣相比，茶多酚、茶紅素、茶褐素含量都極顯著下降（p＜0.01），生普組2006年茶樣與2015年茶樣相比，茶多酚含量極顯著下降（p＜0.01），茶黃素、茶紅素、茶褐素含量都極顯著增加（p＜0.01）。

2.5 普洱茶的兒茶素單體成分含量

HPLC法檢測普洱茶中兒茶素和咖啡堿單體含量，結(jié)果如表2所示。

表2 普洱茶中兒茶素和咖啡堿單體成分含量表（M±SD，n=3）Table2 Contentsof catechin and caffeinem onomer in Pu'er tea（M±SD，n=3）

同一年份的生普組茶樣兒茶素各單體含量幾乎都極顯著高于熟普組，生普組2015年茶樣的各單體成分含量都極顯著高于2006年茶樣。熟普組的表型兒茶素含量以2015年茶樣最高，酯型兒茶素含量以2006年茶樣最高，兒茶素總量、咖啡堿含量以2010年最高；生普組咖啡堿、表型兒茶素、酯型兒茶素和兒茶素總量都以2015年茶樣最高，2006年茶樣最低。

2.6 普洱茶品質(zhì)評價

對不同貯存年份普洱熟茶和生茶的品質(zhì)進(jìn)行了審評，茶餅、干茶、茶湯和葉底的外觀圖如圖4所示，品質(zhì)評價評語如表3所示，隨著貯存年份的延長，茶餅由緊到松，陳香越來越明顯，茶湯湯色也由淺到深，滋味也由稍苦澀逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榇己裉饾櫋?/p>

圖4 不同年份普洱茶品質(zhì)評價外觀圖Fig.4 Quality evaluation of Pu'er tea in differentyears

表3 普洱茶品質(zhì)感官評價表Table3 Quality sensory evaluation of Pu'er tea

3 結(jié)論

本研究采用體外抗氧化、抑制α-淀粉酶和脂肪酶活性法評價了貯存不同年份的普洱熟茶和生茶的降血糖和降血脂功效，并對其品質(zhì)和可能的功效物質(zhì)成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明同一組生普或熟普都以貯存年份久的茶樣苦澀味和刺激性更低，陳香和醇厚甜潤的滋味品質(zhì)也更突出；同一年份的普洱生茶在體外抗氧化、降血糖、降血脂方面的功效均優(yōu)于普洱熟茶，這可能是因?yàn)槠斩柚卸喾宇惡枯^熟茶高，普洱熟茶中的多酚類經(jīng)氧化發(fā)酵衍生為較大分子活性較低的聚合物所致。普洱熟茶隨著貯存時間的延長，其抗氧化、降血脂功效變化不大，而其降血糖作用則顯著下降，普洱生茶隨著貯存時間的延長，其抗氧化、降血糖功效變化不大，而其降血脂作用先減弱再增強(qiáng)，這也說明普洱茶的降血糖作用可能與多酚類、茶褐素密切相關(guān)，其降血脂作用可能與茶多酚、茶色素（茶黃素、茶紅素、茶褐素）含量的變化相關(guān)，除此之外，可溶性糖、游離氨基酸、咖啡堿等成分也具有一定的抗氧化、降血糖、降血脂作用。

普洱茶因其成分十分復(fù)雜，某些衍生成分含量又很低，這些含量低的物質(zhì)成分雖可能具有某些特殊健康功效，但目前尚不能完全解析其結(jié)構(gòu)和功能，降血糖和降血脂之外的其他保健功效也有待于進(jìn)一步研究。

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