HPLC-ICP-MS法測(cè)定牛肝菌中汞的形態(tài)

楊玲春，丁元明，王英，張薇，張銀，殷紅，陳宏仙，李云飛，朱紅玉，陳蕓，陳麗萍

（云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，云南昆明650228）

汞（Hg）是一種對(duì)人體健康產(chǎn)生危害的重金屬元素，具有強(qiáng)揮發(fā)性、生物富集性和高毒性，普遍存在于大氣、土壤及水體中[1-3]。Hg及其化合物可通過呼吸道、食物鏈和皮膚接觸等多種途徑侵入人體，由于Hg特殊的理化性質(zhì)，不易排出體外，超出一定限量時(shí)可以造成大腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及肝、腎的損害，嚴(yán)重危害人體健康[4-5]；自然界的汞主要以金屬汞、無機(jī)汞（Hg2+）和有機(jī)汞（MeHg、EtHg、PhHg）的形式存在，其對(duì)生物體毒性的大小并不僅僅取決于該元素的總量，而是與該元素的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)，同種元素不同形態(tài)之間的毒性及可利用性常存在較大差異。有機(jī)汞因具有脂溶性，易被機(jī)體所吸收，其毒性遠(yuǎn)大于無機(jī)汞，尤其是甲基汞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)易造成不可逆的損害[6-7]。因此，有必要建立快速、有效的汞形態(tài)分析方法。

牛肝菌（Boletus fungi）是一種珍稀名貴的野生食用菌，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素及多種礦物質(zhì)元素，因其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，被認(rèn)為是理想的綠色健康食品，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛，在國(guó)際貿(mào)易中牛肝菌是重要的創(chuàng)匯農(nóng)副產(chǎn)品[8]。多數(shù)野生食用菌對(duì)重金屬Hg有很強(qiáng)的富集能力，子實(shí)體中的重金屬含量與土壤、水分、大氣等生長(zhǎng)環(huán)境因子具有密切聯(lián)系[9]。牛肝菌在生長(zhǎng)過程中對(duì)Hg、As、Cd、Pb等多種有毒重金屬元素均具有強(qiáng)富集作用，尤其是Hg含量超標(biāo)問題凸顯，對(duì)消費(fèi)者身體健康和生命安全造成威脅[10]。因此，研究牛肝菌或牛肝菌制品中汞元素的化學(xué)形態(tài)對(duì)正確認(rèn)識(shí)牛肝菌中汞元素對(duì)人體的危害具有重要意義。

目前測(cè)定汞形態(tài)的方法很多[11]。最早的方法為氣相色譜法，上世紀(jì)80年代以后，原子發(fā)射光譜（atomic emission spectroscopy，AES）、原子熒光光譜（atomic fluorescence spectrometry，AFS）、電感耦合-等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）等元素分析儀器與高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）聯(lián)用技術(shù)發(fā)展的日趨完善，已廣泛應(yīng)用于材料和生命科學(xué)樣品中元素的形態(tài)分析[12-14]。其中ICP-MS具有極低的檢出限、較寬的線性范圍、可同時(shí)測(cè)定多種元素、分析速度快、線性范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，成為形態(tài)分析中首選的檢測(cè)方法[15]。本文采用微波萃取并結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定牛肝菌中不同形態(tài)汞元素的方法，為全面客觀評(píng)價(jià)牛肝菌中汞元素的危害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5個(gè)批次的牛肝菌干片均來源于云南省楚雄州南華縣，試驗(yàn)編碼為S1～S5。

醋酸銨（分析純）、甲醇（色譜純）：默克公司；鹽酸（36.0%～38%，分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；L-半胱氨酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液[（GBW08675，76.6mg/kg（以甲基汞計(jì)）]：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液[（GBW（E）081524，75.3mg/kg（以乙基汞計(jì)）]：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；二價(jià)汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液[（GSB04-1729-2004，1 000mg/kg（以 Hg計(jì)）]：國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；試驗(yàn)用水：超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀、8800型三重四級(jí)桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent科技有限公司；GM300型刀式混合研磨儀：德國(guó)Retsch公司；XPE204型電子天平：瑞士Mettler公司；4-start9609BNWP型pH計(jì)：美國(guó)奧立龍；Milli-Q純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；3K15型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件

色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）：Agilent Eclipse plus C18色譜柱；進(jìn)樣量：100μL；柱溫：30℃；流速為1.0mL/min；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為10mmol/L醋酸銨（含0.12%L-半胱氨酸）并用10%氨水調(diào)節(jié)pH值至 7.5，A ∶B（8∶92，體積比）混合等度淋洗。

RF入射功率：1 550W；RF匹配電壓1.74 V；同心圓霧化器，載氣為純度≥99.99%的氬氣，等離子體氣體流速：15.0 L/min；載氣流速：0.65 L/min；輔助氣體流速：0.45 L/min；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：0.1 r/s；采樣深度：8mm；檢測(cè)質(zhì)量數(shù)：m/z=202（Hg）；停留時(shí)間為 0.5 s（m/z=202）。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密吸取二價(jià)汞、甲基汞和乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配成質(zhì)量濃度為1 000μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于棕色試劑瓶中，避光保存于4℃冰箱中備用。

1.3.3 樣品前處理方法

稱取研磨儀磨細(xì)的牛肝菌樣品0.2 g于萃取用玻璃管中，放入磁性攪拌子，加入10mL萃取液（0.07mol/L的HCl），用微波萃取儀在55℃，壓力15MPa，功率110W，保持15min的條件下進(jìn)行萃取。萃取完成后放入冰箱中靜置5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，14 000 r/min，4℃，5min條件下離心，吸取上清液經(jīng)0.2μm水相針式濾器過濾。過濾后吸取500μL樣品溶液用流動(dòng)相1∶1稀釋，混勻，得到待測(cè)樣液，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成濃度為1、10、25、50、100、200μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（現(xiàn)用現(xiàn)配），進(jìn)樣量 100μL，以二價(jià)汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）的色譜峰面積與相應(yīng)濃度分別進(jìn)行線性回歸分析，得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。以空白溶液基線信號(hào)3倍（即信噪比S/N為3 ∶1）時(shí) Hg2+、MeHg、EtHg 對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限。

1.3.5 方法學(xué)考察

1.3.5.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取“1.3.2”項(xiàng)下制備混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10μg/L），按照“1.3.1”項(xiàng)下的儀器條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣10次進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次樣品平行稱取10份，經(jīng)過樣品前處理制備待測(cè)樣液，按照“1.3.1”項(xiàng)下的試驗(yàn)條件依次進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次樣品平行稱取1份，經(jīng)過樣品前處理制備待測(cè)樣液，按照“1.3.1”項(xiàng)下的試驗(yàn)條件，分別于0、2、4、6、8、12、24、48 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.3.5.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

應(yīng)用本文建立的方法對(duì)已知含有量的牛肝菌樣品進(jìn)行測(cè)定，向牛肝菌提取液中分別添加3個(gè)不同濃度水平的二價(jià)汞、甲基汞、乙基汞的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下的試驗(yàn)條件同時(shí)測(cè)定6個(gè)平行樣計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

分別使用AgilentEclipseplus-C18（150mm×4.6mm，5μm）和Athena C18（250mm×4.6mm，5μm）兩根色譜柱在其它試驗(yàn)條件不變的情況下分離標(biāo)準(zhǔn)樣品，二價(jià)汞（Hg2+）出峰時(shí)間分別為1.98min和5.73min并且Athena C18色譜峰明顯展寬，因此選用AgilentEclipse plus-C18（150mm×4.6mm，5μm）做為色譜分析柱。

2.2 色譜流速的選擇

保持儀器其他試驗(yàn)參數(shù)不變的情況下考察了流動(dòng)相流速分別為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL/min 時(shí)，3 種形態(tài)汞的分離情況。試驗(yàn)結(jié)果表明隨著流動(dòng)相流速的增加3種汞形態(tài)的保留時(shí)間明顯縮短，信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但是當(dāng)流速高于1.0mL/min后，3種汞形態(tài)分離度開始下降，故試驗(yàn)選擇流動(dòng)相流速為1.0mL/min。

2.3 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相中加入親水性較強(qiáng)的L-半胱氨酸作為汞形態(tài)分析的絡(luò)合物，可以明顯縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)考慮到L-半胱氨酸濃度太大對(duì)色譜柱有損害，因此選擇0.12%L-半胱氨酸作為汞形態(tài)分析的絡(luò)合劑。

選用質(zhì)量濃度為8%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇作為有機(jī)相有利于ICP-MS分析信號(hào)的穩(wěn)定及消除汞的記憶效應(yīng)；同時(shí)在流動(dòng)相中加入適量的緩沖鹽醋酸銨，能夠有效改善拖尾現(xiàn)象，試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)醋酸銨含量增加到10mmol/L時(shí)，峰形和出峰時(shí)間達(dá)到最佳。

2.4 洗脫方式的選擇

保持1.0mL/min流速條件下，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇含量從5%增加至50%時(shí)，3種不同形態(tài)的汞出峰時(shí)間明顯縮短，但各自的分離效果差，無法做到基線分離。因此，通過試驗(yàn)選擇等度洗脫的方式有效解決了分離度差和洗脫時(shí)間長(zhǎng)的問題。

2.5 等離子體質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)分別對(duì)載氣流速以及采樣深度進(jìn)行考察，載氣流速影響著霧化效率，對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響明顯。隨著載氣流量的增大，質(zhì)譜信號(hào)也隨之增大，當(dāng)載氣流速達(dá)到0.65 L/min時(shí)信號(hào)值達(dá)到最大，繼續(xù)增大載氣流速，質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)反而減小，因此，試驗(yàn)采用的載氣流速為0.65 L/min。采樣深度對(duì)分離效果的影響不大，但對(duì)信號(hào)強(qiáng)度有很大影響，在采樣深度為8mm時(shí)信號(hào)最強(qiáng)，故試驗(yàn)選擇采樣深度為8mm。

采用上述試驗(yàn)條件混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（10μg/L）中的二價(jià)汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）色譜分離圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中二價(jià)汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）色譜圖（10μg/L）Fig.1 Chromatogram of Hg2+，MeHg and EtHg（10 μg/L）

從圖1可以看出3種形態(tài)的汞出峰順序?yàn)槎r(jià)汞、甲基汞、乙基汞，保留時(shí)間分別為1.98、2.64、4.47min，在5min之內(nèi)二價(jià)汞、甲基汞、乙基汞實(shí)現(xiàn)了基線分離且峰形對(duì)稱。

2.6 線性關(guān)系考察結(jié)果

計(jì)算得到二價(jià)汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 二價(jià)汞、甲基汞和乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab le1 Linear equation，correlation coefficientand detection lim itof Hg2+，M eHg and EtHg

由表1可以看出3種不同形態(tài)的汞在1μg/kg～200μg/kg范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系且相關(guān)系數(shù)均大于0.999，二價(jià)汞、甲基汞和乙基汞檢出限分別為0.005、0.008mg/kg和 0.005mg/kg

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn)

10次試驗(yàn)結(jié)果的二價(jià)汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）RSD值分別為1.95%、1.67%，1.83%均小于2%，表明儀器性能穩(wěn)定，精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn)

10次試驗(yàn)結(jié)果的二價(jià)汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）峰面積的RSD值分別為1.95%、1.67%，均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

計(jì)算結(jié)果顯示二價(jià)汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）峰面積的的RSD值分別為2.38%、2.75%，均小于3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

樣品加標(biāo)回收率見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明在牛肝菌樣品中，二價(jià)汞、甲基汞、乙基汞的6次平行測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于7%，加標(biāo)平均回收率在72%～93%之間，表明加標(biāo)回收率良好且具有良好的精密度。

表2 樣品加標(biāo)回收率（n=6）Table2 Recovery testof Sam ple

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本文建立的方法對(duì)市售的5個(gè)批次牛肝菌樣品進(jìn)行測(cè)定（表3）。結(jié)果表明在牛肝菌中主要以無機(jī)汞（Hg2+）的形式存在，含有少量甲基汞（MeHg）。該方法分離效果好，快速準(zhǔn)確，具有檢出限低、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)牛肝菌中不同價(jià)態(tài)汞元素的分離測(cè)定方法。樣品采用微波萃取結(jié)合HPLC-ICP-MS聯(lián)用的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛肝菌中不同價(jià)態(tài)汞元素的分離檢測(cè)，方法加標(biāo)平均回收率范圍在72%～93%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7%，該方法操作簡(jiǎn)便、分離效果好、檢出限低、靈敏度高、重復(fù)性好，檢測(cè)時(shí)間短，5min內(nèi)能夠完全出峰，洗脫時(shí)間短，能夠在亞濃度（μg/kg）水平檢測(cè)不同價(jià)態(tài)汞元素；本研究可為今后制定野生食用菌中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法提供參考，同時(shí)也對(duì)完善食用菌質(zhì)量控制、檢測(cè)方法及相關(guān)技術(shù)有重要意義。

表3 牛肝菌樣品中不同價(jià)態(tài)汞的含量Tab le3 The contentof Hg2+，M eHg and EtHg in Boletus fungi mg/kg

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