Notch信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細胞EMT過程中的作用

何燕霞，張巍然，李鵬云，單婉婉

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

Notch信號通路是一種廣泛表達于多個物種、遺傳進化上高度保守、反映相鄰細胞間通信作用的信號通路，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[1～3]。該信號通路的失調(diào)與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的重要生物學過程。目前用來驗證EMT過程發(fā)生的分子標志物主要有上皮性標志基因E-cadherin及間質(zhì)性標志基因Vimentin等。腫瘤微環(huán)境改變，如轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)增多，可誘導(dǎo)多種類型上皮細胞發(fā)生EMT[4]。目前對Notch信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細胞EMT過程中的作用尚不完全清楚。2016年10月～2017年6月，我們觀察了Notch信號通路在胃癌細胞EMT過程中的作用及其對胃癌細胞侵襲能力的影響?，F(xiàn)分析結(jié)果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞株SGC7901(以下稱SGC7901細胞)，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。TGF-β1，美國PeproTech公司。Jagged1 siRNA及陰性對照siRNA，廣州市銳博生物科技有限公司；引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。7500Fast熒光定量PCR儀，美國ABI公司；NanoDrop ND-2000超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6D型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Transwell小室，美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠，美國BD公司。TRIzol，北京康維世紀生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑及用于qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)，美國Invitrogen公司；Bestar?SybrGreen qPCR mastermix，德國DBI公司；兔抗人Jagged1單克隆抗體，美國Abcam公司；兔抗人E-cadherin單克隆抗體和兔抗人Vimentin單克隆抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗人N1ICD單克隆抗體，沈陽萬類生物科技有限公司；兔抗人GAPDH多克隆抗體，杭州賢至生物科技有限公司。

1.2 TGF-β1誘導(dǎo)SGC7901細胞EMT及其效果驗證 ①細胞培養(yǎng)：將SGC7901細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換1次新的培養(yǎng)基，待細胞生長融合至80%左右，胰酶消化，計數(shù)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。②TGF-β1誘導(dǎo)SGC7901細胞EMT：取對數(shù)生長期SGC7901細胞，接種于含10% FBS RPMI 1640完全培養(yǎng)基的6孔板，每孔2×105個，隨機將細胞分為誘導(dǎo)組和對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細胞生長融合至70%左右，棄去原培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組每孔加入含10 ng/mL TGF-β1的無血清培養(yǎng)基，對照組加入不含TGF-β1的無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。③EMT效果驗證：a.采用熒光定量PCR法。收集各組培養(yǎng)24 h細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，經(jīng)NanoDrop ND-2000超微量分光光度計檢測，A260/A280為1.8～2.0，說明提取的總RNA純度合格，可用于后續(xù)實驗。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：E-cadherin上游引物5′-CGGACGATGATGTGAACACC-3′，下游引物5′-TTGCTGTTGTGCTTAACCCC-3′；Vimentin上游引物5′-TTGACCTTGAACGCAAAGTG-3′，下游引物5′-ACATCGATTTGGACATGCTG-3′；β-actin上游引物5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 1 μL，Bestar?SybrGreen qPCR mastermix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，無RNA酶水8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s、55 ℃退火34 s共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸30 s。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組和對照組E-cadherin mRNA相對表達量分別為0.339±0.035、1.000±0.040，Vimentin mRNA相對表達量分別為1.597±0.025、1.000±0.100，兩組比較P均<0.05。b.采用Western blotting法。收集各組培養(yǎng)24 h細胞，采用普通RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg行SDS-PAGE(8%分離膠、5%濃縮膠)，電泳結(jié)束采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶750)、GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組和對照組E-cadherin蛋白相對表達量分別為0.30±0.04、1.02±0.30，Vimentin蛋白相對表達量分別為1.41±0.08、1.05±0.08，兩組比較P均<0.05。結(jié)果表明，TGF-β1可誘導(dǎo)SGC7901細胞發(fā)生EMT，可用該方法進行后續(xù)試驗。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后再誘導(dǎo) 取對數(shù)生長期SGC7901細胞，接種于含10% FBS RPMI 1640完全培養(yǎng)基的6孔板，每孔2×105個，隨機將細胞分為空白對照組、陰性對照組、siRNA組。當細胞生長融合至80%左右，siRNA組、陰性對照組分別加入Jagged1 siRNA及陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000及siRNA產(chǎn)品說明進行?？瞻讓φ战M不予轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h，將空白對照組、陰性對照組、siRNA組分別分為兩份，一份直接用于mRNA和蛋白檢測，另一份陰性對照組、siRNA組更換為含10 ng/mL TGF-β1的無血清培養(yǎng)基，空白對照組更換為不含TGF-β1的無血清培養(yǎng)基，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后進行相關(guān)mRNA和蛋白檢測。

1.4 相關(guān)指標觀察

1.4.1 E-cadherin、Vimentin、Jagged1 mRNA表達 采用熒光定量PCR法。收集空白對照組、陰性對照組、siRNA組轉(zhuǎn)染48 h細胞及三組轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h細胞，檢測E-cadherin、Vimentin、Jagged1 mRNA表達。Jagged1引物序列：上游引物5′-TTCCAACGACACACCTGAAG-3′，下游引物5′-TCCCGTGAAG-CCTTTGTTAC-3′。其余步驟同1.2。

1.4.2 E-cadherin、Vimentin、Jagged1、N1ICD蛋白表達 采用Western blotting法。收集空白對照組、陰性對照組、siRNA組轉(zhuǎn)染48 h細胞及三組轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h細胞，檢測E-cadherin、Vimentin、Jagged1、N1ICD 蛋白表達。Jagged1、N1ICD一抗稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000、1∶750，其余步驟同1.2。

1.4.3 細胞侵襲能力 采用Transwell侵襲法。將BD基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按15∶1稀釋后，取100 μL鋪于Transwell上室并置于培養(yǎng)箱6 h待基質(zhì)膠凝固。收集空白對照組、陰性對照組、siRNA組轉(zhuǎn)染48 h細胞及三組轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室，24孔板下室加入完全培養(yǎng)基750 μL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2遍，蘇木素染色10 min，PBS沖洗，小心擦除小室內(nèi)未侵襲細胞，將小室置于倒置顯微鏡下觀察。每個小室隨機選取5個200倍視野，計數(shù)侵襲至小室下層的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組siRNA轉(zhuǎn)染48 h及轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 hJagged1、E-cadherin、Vimentin mRNA表達比較 見表1、2。

表1 各組siRNA轉(zhuǎn)染48 h E-cadherin、Vimentin、 Jagged1 mRNA相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

表2 各組siRNA轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h E-cadherin、 Vimentin、Jagged1 mRNA相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.2 各組siRNA轉(zhuǎn)染48 h及轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h E-cadherin、Vimentin、Jagged1、N1ICD蛋白表達比較 見表3、4。

表3 各組siRNA轉(zhuǎn)染48 h E-cadherin、Vimentin、 Jagged1、N1ICD蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

表4 各組siRNA轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h E-cadherin、Vimentin、 Jagged1、N1ICD蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 空白對照組、陰性對照組、siRNA組轉(zhuǎn)染48 h侵襲細胞數(shù)分別(55.00±2.65)、(54.67±4.50)、(22.33±2.52)個，siRNA組侵襲細胞數(shù)明顯低于空白對照組和陰性對照組(P均<0.05)，而空白對照組與陰性對照組比較P>0.05?？瞻讓φ战M、陰性對照組、siRNA組轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h侵襲細胞數(shù)分別(74.67±2.60)、(77.33±3.79)、(23.33±4.73)個，siRNA組侵襲細胞數(shù)明顯低于空白對照組和陰性對照組(P均<0.05)，而空白對照組與陰性對照組比較P>0.05。

3 討論

目前，對胃癌發(fā)生的分子機制尚不完全清楚，但其強侵襲和轉(zhuǎn)移能力是患者預(yù)后差的主要原因。在闡釋腫瘤轉(zhuǎn)移機制的理論模型中，EMT模型被廣泛認可。EMT是上皮細胞向間質(zhì)樣細胞的可塑性轉(zhuǎn)變，在此過程中，細胞間連接和細胞黏附能力被破壞，細胞極性喪失，失去上皮細胞表型獲得間質(zhì)細胞表型，并獲得更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。EMT是腫瘤侵襲和遷移的先決條件[5]。研究證實，多種因子及信號通路(如Wnt、Hedgehog等)均可通過相應(yīng)受體信號參與胃癌細胞的EMT過程。如Zhang等[6]研究報道，KLF8因子參與胃癌細胞的EMT過程，并能促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究還發(fā)現(xiàn)，抑制胃癌細胞中Hedgehog通路的轉(zhuǎn)錄因子Gli1可逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的EMT，使得E-cadherin表達上調(diào)、Vimentin表達下調(diào)，同時使間質(zhì)樣細胞恢復(fù)上皮細胞形態(tài)[7]。

Notch基因最初在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其功能喪失可導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺口，進而以此命名。Notch信號通路由三部分組成：Notch受體、Notch配體Jagged1和DNA結(jié)合序列CSL。在哺乳動物中，Notch受體有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4四種異構(gòu)體及Dll1、Dll-3、Dll-4、Jagged-1、Jagged-2五種配體。Notch受體和Jagged-1均是Ⅰ型單次跨膜蛋白[8]。Notch信號通路是十分保守的信號通路，可參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡，對機體正常發(fā)育至關(guān)重要，是許多重要信號通路的主要組成部分和關(guān)鍵調(diào)控位點。Notch信號通路配體Jagged1與鄰近上皮細胞膜上Notch1受體結(jié)合后，經(jīng)過金屬蛋白酶和γ分泌酶介導(dǎo)的一系列酶促分裂反應(yīng)，致使Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(N1ICD)易位至細胞核；N1ICD進而與細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，從而促進靶基因Hes、Hey轉(zhuǎn)錄。有研究顯示，Notch信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，具有促癌或抑癌作用[9，10]。多項研究表明，Notch受體及其配體在宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中表達上調(diào)[11～13]。此外，Notch1及其配體Jagged1高表達與乳腺癌和肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后不良有關(guān)[14,15]。在胰腺癌細胞系中，Notch1信號通路已被證實可促進EMT相關(guān)的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。而在探索Notch信號通路參與EMT發(fā)生的機制時發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路可能通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snail表達，促進TGF-β1誘導(dǎo)的EMT[11]。Leong等[18]在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)，Slug可作為Notch信號通路調(diào)節(jié)EMT的下游靶點，通過抑制E-cadherin表達促進EMT發(fā)生，進而促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡。

本研究通過TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生EMT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞E-cadherin表達下調(diào)、Vimentin表達上調(diào)，表明TGF-β1可誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生EMT。為進一步證實Notch信號通路是否參與TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌細胞EMT過程，采用RNAi技術(shù)通過Jagged1 siRNA沉默Notch信號通路，結(jié)果顯示，siRNA組Jagged1、N1ICD表達下調(diào)，表明轉(zhuǎn)染Jagged1 siRNA可抑制Notch信號通路；而siRNA轉(zhuǎn)染后再誘導(dǎo)時，siRNA組E-cadherin表達上調(diào)、Vimentin表達下調(diào)，與僅予siRNA轉(zhuǎn)染時E-cadherin、Vimentin表達變化一致，表明抑制Notch信號通路可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，進一步證實TGF-β1可通過Notch信號通路誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生EMT。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，siRNA組轉(zhuǎn)染48 h及轉(zhuǎn)染48 h再誘導(dǎo)24 h侵襲細胞數(shù)明顯低于空白對照組和陰性對照組，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。表明抑制Notch信號通路可降低胃癌細胞的侵襲能力。

綜上所述，抑制Notch信號通路可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌細胞EMT過程，并能降低胃癌細胞的侵襲能力。

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