過表達miR-18a-5p對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制

瑪依努爾·達吾提，胡尼其古麗·阿巴克，阿依努爾·玉蘇普，祖麗胡瑪爾·阿卜杜合力力，依米提·熱合曼

( 新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊830046)

微小RNA(miRNA)是一類存在于真核生物中的內源性非編碼單鏈小分子RNA[1]，長度為20～25個核苷酸。成熟的miRNA以堿基互補配對原則與靶基因mRNA的非編碼區(qū)結合，從而引起靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯，進而在轉錄后對基因表達起負性調控作用，主要參與細胞增殖、分化、凋亡以及生長發(fā)育等一系列生物學過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[2，3]。miR-18a-5p為miR-17-92家族成員之一，之前稱為miR-18a，基于miRbase更名為miR-18a-5p[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌、胰腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤細胞可見miR-18a-5p差異表達，可能具有癌基因或抑癌基因作用[5～7]。2016年12月～2017年8月，本研究通過脂質體瞬時轉染技術構建過表達miR-18a-5p的結腸癌細胞，觀察過表達miR-18a-5p對結腸癌細胞生物學行為的影響，并對其可能的靶基因進行初步研究。現(xiàn)分析結果并報告如下。

1 材料

結腸癌SW480細胞，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。靶基因特異性引物，由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。miRNA真核質粒PGV514，上海吉凱基因化學技術有限公司。miR-18a-5p特異性引物，由北京天根生化科技有限公司合成。NanoDrop ND-2000核酸定量測定儀、Multiskan FCM酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；流式細胞儀，美國Beckman公司；熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。LipofectaminTM3000轉染試劑，美國Invitrogen公司；Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒，美國BD公司；miRcute miRNA cDNA試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒，北京天根生化科技有限公司；QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit，德國QIAGEN公司；First Strand cDNA Synthesis Kit，美國Thermo Fisher Scientific公司；質粒小體試劑盒，美國Omega-Bio-Tek公司。

2 方法與結果

2.1 質粒表達構建與質粒DNA抽提 從miRbase數(shù)據(jù)庫中獲得成熟miRNA序列，按照hsa-miR-18a-5p(miRbas編號：MIMAT0000072)的成熟miRNA序列：UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG，設計合成帶有末端保護堿基、BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點的hsa-miR-18a-5p引物。引物序列：hsa-miR-18a-5p-XhoⅠ-F：5′-GTCCGGACTCAGATCTCGAGCTTGAAT-CTACTGCAGTGAAGGCACTTG-3′，hsa-miR-18a-5p-BamHⅠ-R： 5′-TATCTAGATCCGGTGGATCCGTGCA-ACTATGCAAAACTAACAG-3′。擴增pre-miR-18a-5p序列，構建真核過表達hsa-miR-18a-5p-PGV514-EGFP質粒(miR-18a-5p-eGFP)、插入空載體(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)的陰性對照CMV-EGFP-MCS-SV40-Neomycin質粒(NC-eGFP)。將miR-18a-5p-eGFP、NC-eGFP接種于含50 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃恒溫搖床12～16 h，按質粒小體試劑盒說明抽提真核miRNA質粒DNA，核酸定量測定儀檢測質粒DNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。

2.2 細胞轉染及轉染效率驗證 將SW480細胞接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換1次新的培養(yǎng)基，當細胞融合約90%時，用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，按1∶2比例進行傳代。取傳4代對數(shù)生長期細胞，以4×106個/孔接種于6孔板，隨機將細胞分為miR-18a-5p-eGFP組、NC-eGFP組、空白對照組。當細胞融合約70%時，miR-18a-5p-eGFP組加入含200 ng/μL miR-18a-5p-eGFP的質粒DNA 25 μL、LipofectaminTM3000 Reagent 3.75 μL和Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL；NC-eGFP組加入含200 ng/μL NC-eGFP的質粒DNA 25 μL、LipofectaminTM3000 Reagent 3.75 μL和Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL；空白對照組僅加入Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL。各組均置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育6 h，棄去舊培養(yǎng)基，更換為含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，之后每隔24 h更換1次新的培養(yǎng)基。轉染12、24、48 h，熒光倒置顯微鏡下空白對照組未見綠色熒光，miR-18a-5p-eGFP組、NC-eGFP組均可見綠色熒光，表明轉染成功，且以轉染48 h效率最高。故選擇轉染48 h細胞進行后續(xù)實驗。收集miR-18a-5p-eGFP組、NC-eGFP組轉染48 h細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，經(jīng)核酸定量測定儀檢測，OD260/OD280為1.8～2.0；經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28、18 S兩條RNA條帶。說明提取的總RNA純度和完整性符合實驗要求。取總RNA 1 μg，按照miRNA cDNA試劑盒說明逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按照miRNA熒光定量檢測試劑盒說明進行PCR擴增。miR-18a-5p和內參U6的引物序列由北京天根生化科技有限公司提供。PCR反應體系共20 μL：2×miRcute miRNA Premix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O 7.2 μL；反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s共40個循環(huán)，最后55 ℃ 30 s。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-18a-5p相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)，miR-18a-5p-eGFP組、NC-eGFP組、空白對照組miR-18a-5p相對表達量分別為17.19±0.98、7.32±0.51、2.97±0.66；與NC-eGFP組、空白對照組比較，miR-18a-5p-eGFP組miR-18a-5p相對表達量明顯升高(P均<0.05)，而NC-eGFP組與空白對照組比較P>0.05。表明此轉染方法能使miR-18a-5p過表達，可用于后續(xù)實驗。

2.3 過表達miR-18a-5p對SW480細胞增殖抑制率影響的觀察 采用MTT法。預實驗發(fā)現(xiàn)，NC-eGFP組和空白對照組細胞增殖抑制率比較P>0.05[8]，故本次檢測僅設miR-18a-5p-eGFP組和NC-eGFP組。取傳4代對數(shù)生長期SW480細胞，按2.2中方法進行轉染。轉染48 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r/min離心10 min，吸棄上清液；每孔加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩10 min，使結晶充分溶解。酶聯(lián)免疫分析儀450 nm波長處檢測各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率(Ri)。Ri=[1-(實驗孔A450值-空白對照孔A450值)/(陰性對照孔A450值-空白對照孔A450值)]×100%。結果發(fā)現(xiàn)，miR-18a-5p-eGFP組、NC-eGFP組細胞增殖抑制率分別為(66.02±0.51)%、(23.81±0.64)%，兩組比較P<0.05。

2.4 過表達miR-18a-5p對SW480細胞凋亡率影響的觀察 采用流式細胞術。取傳4代對數(shù)生長期SW480細胞，按2.2中方法進行分組、轉染。轉染48 h，收集各組細胞，4 ℃、800 r/min離心5 min，棄上清液，PBS重懸。收集含2×105個細胞的細胞懸液，4 ℃、800 r/min離心5 min，棄上清液，室溫下加入1×Binding Buffer 400 μL，然后加入Annexin V-PE 5 μL和7-AAD 5 μL輕輕混勻，避光反應15～20 min。采用流式細胞儀自動檢測早期凋亡率和晚期凋亡率。結果見表1。

表1 三組轉染48 h早期凋亡率和晚期凋亡率比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與NC-eGFP組比較，#P<0.05。

2.5 miR-18a-5p過表達對SW480細胞靶基因表達影響的觀察

2.5.1 miR-18a-5p靶基因預測與篩選 根據(jù)基因芯片結果，運用在線數(shù)據(jù)庫miRanda、microCosm、Targetscan等預測miR-18a-5p的靶基因可參與MAPK、Wnt等信號通路，通過靶基因信號通路分析，篩選出miR-18a-5p的靶基因可能為DUSP5、FZD3、CCND2。

2.5.2 過表達miR-18a-5p對SW480細胞靶基因DUSP5、FZD3、CCND2表達的影響 采用qRT-PCR法。預實驗發(fā)現(xiàn)，NC-eGFP組和空白對照組靶基因相對表達量比較P>0.05[8]，故本次檢測僅設miR-18a-5p-eGFP組和NC-eGFP組。取傳4代對數(shù)生長期SW480細胞，按2.2中方法進行轉染。轉染48 h，收集兩組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA。經(jīng)核酸定量測定儀和1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA純度和完整性符合實驗要求。取總RNA 1 μg，按照First Strand cDNA Synthesis Kit說明逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：DUSP5上游引物5′-AATGAGGTAGTTGGTTGAAGTAGC-3′，下游引物5′-AGAAGA-GGTGGAATGAGACAAGT-3′；FZD3上游引物5′-TGGCTCTCATAGTTGGCATTCC-3′，下游引物5′-ACCTGTCGGCTCTCATTCACT-3′；CCND2上游引物5′-TG-AGGAACAGAAGTGCGAAGA-3′， 下游引物5′-CTGAGGCTTGATGGAGTTGTC-3′； β-actin上游引物5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，下游引物5′-ATGGAGCCACCGATCCACADUSP-3′。PCR反應體系共20 μL：cDNA 1 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.7 μL，RNase-Free ddH2O 7.6 μL；反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)，最后55 ℃ 10 s。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。結果見表2。

表2 兩組miR-18a-5p的靶基因DUSP5、FZD3、CCND2相對表達量比較

注：與NC-eGFP組比較，*P<0.05。

3 討論

miRNA是一種轉錄后調節(jié)基因表達的非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA結合，抑制靶mRNA翻譯過程或誘導靶mRNA降解，繼而參與基因表達調控。生理狀態(tài)下，miRNA主要參與生物體生長、發(fā)育、衰老、死亡等生命過程調控[9]。miRNA異常表達會影響靶基因表達，導致多種疾病的發(fā)生[10]。據(jù)報道，超過50%的miRNA位于腫瘤相關的基因區(qū)域或脆性位點，其異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[11]。miR-18a-5p是miRNA中的一種，屬于miR-17-92家族成員，定位于染色體13q31.3，與抑癌基因GUGC序列結合發(fā)揮作用[12]。miR-18a-5p可在多種腫瘤細胞中差異表達。如在非小細胞肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤細胞中miR-18a-5p表達上調，并通過靶向調控干擾素因子2，促進腫瘤細胞增殖和侵襲[13，14]；miR-18a-5p還可下調腫瘤抑制基因PTEN表達，促進腫瘤進展[15]。

本研究通過脂質體瞬時轉染法成功在SW480細胞過表達miR-18a-5p。結果發(fā)現(xiàn)，miR-18a-5p-eGFP組細胞增殖抑制率明顯高于NC-eGFP組，說明miR-18a-5p過表達能抑制SW480細胞增殖。miR-18a-5p-eGFP組早期凋亡率、晚期凋亡率均明顯高于NC-eGFP組和空白對照組，提示過表達miR-18a-5p可促進SW480細胞凋亡。

miRNA的功能主要取決于其下游靶基因的生物學效應。本研究對miR-18a-5p的靶基因進行預測，篩選出其靶基因可能為DUSP5、FZD3、CCND2。DUSP5是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，其功能是磷酸酪氨酸和磷酸絲氨酸去磷酸化而起作用的MAPK負性調節(jié)劑[16]。MAPK信號通路是細胞內廣泛存在的信號通路之一。Bellou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，DUSP5能去磷酸化p-VEGF從而抑制腫瘤血管生成；在前列腺癌中DUSP5呈低表達，其表達變化可引起前列腺癌細胞生物學行為改變[18]。FZD3基因是FZD家族成員之一，其編碼的卷曲蛋白是Wnt蛋白的受體，可與Wnt配體結合啟動Wnt信號通路[19，20]。Pourreyron等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD3與Wnt5a結合激發(fā)Wnt信號通路與非黑色素瘤皮膚癌的侵襲有關。CCND2是D型細胞周期蛋白家族成員，主要參與細胞周期調控。CCND2可參與PI3K-AKT信號通路，調控細胞增殖、凋亡和遷移等過程[21，22]。本研究結果顯示，miR-18a-5p-eGFP組DUSP5、FZD3相對表達量高于NC-eGFP組，CCND2相對表達量低于NC-eGFP組。說明過表達miR-18a-5p通過靶向調控其靶基因DUSP5、FZD3、CCND2表達，繼而調控MAPK、Wnt和PI3K/AKT等信號通路，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，過表達miR-18a-5p能夠抑制結腸癌SW480細胞增殖并促進其凋亡，其機制可能與調控靶基因DUSP5、FZD3、CCND2表達有關。

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