HPLC—ELSD測定安神寶顆粒中3種成分

李麗麗 田海偉 李晉 張贊 馮玉蓉 哈婧

摘要：為完善安神寶顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜法同時測定安神寶顆粒中酸棗仁皂A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素3種有效成分，采用Agilent Zorbox SB C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）及蒸發(fā)光散射檢測器，柱溫35 ℃，流動相為甲醇-0.5%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明，在該色譜條件下，3種有效成分均完全分離，峰面積對數(shù)與進(jìn)樣量對數(shù)呈良好的線性關(guān)系（r=0.995 6～0.998 0）；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果符合要求，各被測組分的平均回收率在94.74%～96.08%之間。液相色譜法操作簡單，準(zhǔn)確度、靈敏度高，可用于檢測安神寶顆粒中的有效成分，對完善安神寶顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提升藥品的質(zhì)量控制水平具有實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞：色譜分析；高效液相色譜法；安神寶顆粒；酸棗仁皂苷A；東莨菪內(nèi)酯；槲皮素；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類號：R283；R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Determination of 3 ingredients in Anshenbao

granules by HPLC-ELSD

LI Lili1， TIAN Haiwei1， LI Jin1， ZHANG Zan2， FENG Yurong2， HA Jing1

（1.School of Chemical and Pharamaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China；2. Hebei Yuzhilin Pharmaceutical Company Limited， Xingtai， Hebei 054400， China）

Abstract：In order to improve the quality control standard of Anshenbao granules， a high performance liquid chromatography （HPLC） method is developed for the determination of three active ingredients including Jujuboside A， Scopoletin and Quercetin in Anshenbao granules. The analysis is performed on a Agilent Zorbox SB C18 column（4.6 mm×150 mm，5 μm） with a gradient mobile phase of methanol-0.5% glacial acetic acid at a flow rate of 1.0 mL/min. The evaporative light scattering detector（ELSD） is used， the column temperature is 35 ℃， and the injection is 10 μL. The three active ingredients are separated completely under the given chromatogram system with a good linearity （r=0.995 6～0.998 0） of peak area and the injection. The results of precision， repeatability and stability experiments can meet the requirement， and the mean recoveries of each active ingredients are all in the range of 94.74%～96.08%. The analytical method is simple， accurate and sensitive， and it can be used for determination of active ingredients in Anshenbao granules. It is of practical significance to improve the quality standard of Anshenbao and improve the quality control of medicine.

Keywords：chromatographic analysis； HPLC； Anshenbao granules； jujuboside A； scopoletin； quercetin； quality standard

安神寶顆粒具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)心安神的功效，用于治療失眠健忘、眩暈耳鳴、腰膝酸軟等疾病[1]，處方組成中包括酸棗仁、枸杞子與藤合歡，組方科學(xué)、配伍合理。其中，酸棗仁藥材中含有生物堿、皂苷、氨基酸、阿魏酸、維生素C、植物甾醇、環(huán)磷酸腺苷及微量元素等多種成分[2-11]；枸杞子藥材中含有枸杞多糖、枸杞黃酮、甜菜堿、類胡蘿卜素、類胡蘿卜素酯、維生素C、莨菪亭、多種氨基酸及微量元素等多種成分[10-14]；藤合歡中主要含有黃酮類化合物[10-11，15-21]。安神寶顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國藥典》[1]，僅采用薄層鑒別、正丁醇提取物來進(jìn)行質(zhì)量控制，不能很好地控制安神寶顆粒的質(zhì)量。

安神寶顆粒中3種成分本試驗(yàn)綜合考慮藥材中的有效成分，建立了液相色譜法[19]同時測定安神寶顆粒中酸棗仁皂A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素3種有效成分的測定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法分離度好，精密度高，加標(biāo)回收率結(jié)果令人滿意，對完善安神寶顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提升藥品的質(zhì)量控制水平具有重要意義。

1實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

1.1儀器

LC-16液相色譜儀，島津科學(xué)儀器有限公司提供；UM500蒸發(fā)光散射檢測器，上海通微分析技術(shù)有限公司提供；FA1104N萬分之一電子天平，上海民橋分析儀器有限公司提供；BT25S十萬分之一電子天平，德國賽多利斯分析儀器有限公司提供；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠提供。

1.2藥品與試劑

安神寶顆粒樣品（批號為161201，161202，161203，河北御芝林藥業(yè)有限公司提供）；酸棗仁皂苷A（批號為110814-201409）、東莨菪內(nèi)酯（批號為110768-200504）、槲皮素（批號為100081-201509）（均購自中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純），無水乙醇、冰醋酸、鹽酸、三氯甲烷（分析純，北京化工廠提供）；氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純，國藥試劑）；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbox SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脫（洗脫程序見表1）；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器；流速：1 mL/min；載氣：高純氮?dú)?；流速?.5 L/min；漂移管溫度：75 ℃；進(jìn)樣量：對照品進(jìn)樣量5 μL與10 μL，樣品進(jìn)樣量10 μL；柱溫：35 ℃。

2.2溶液的配制

1）對照品儲備液

精密稱取酸棗仁皂苷A5.0 mg、東莨菪內(nèi)酯8.4 mg、槲皮素10.3 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。

2）混合對照品溶液

分別精密量取上述對照品儲備液1.0 mL，置于同一個20 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，制成含酸棗仁皂苷A25.0 μg、東莨菪內(nèi)酯42.0 μg、槲皮素51.5 μg作為對照品溶液。

3）供試品溶液

取本品粉末（過4號篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流6 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，置燒瓶中，濃縮至約1 mL，加3 mol/L鹽酸溶液10 mL，水浴中加熱水解2 h，立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10 mL分次洗滌容器，并入分液漏斗中，加氯化鈉2 g，用三氯甲烷強(qiáng)力振搖提取5次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，加無水硫酸鈉2 g，攪拌，濾過，容器用少量三氯甲烷洗滌，濾過，濾液合并，70 ℃以下濃縮至近干，立即加甲醇使之溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

4）陰性對照溶液制備

按處方工藝制備不含酸棗仁、枸杞子、藤合歡藥材的陰性樣品，依“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取混合對照品溶液、陰性樣品溶液及供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，各成分之間無干擾，混合對照品溶液中各色譜峰的理論塔板數(shù)均大于4 000，各相鄰峰的分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

2.4線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品儲備液0.1，0.3，0.5，0.7，1.0 mL，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以進(jìn)樣量（μg）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積A的對數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.5精密度試驗(yàn)

精密量取混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素的RSD值分別為1.9%，1.0%，1.2%（n=6），表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取安神寶顆粒（批號為161201）約1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液6份，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)法計算結(jié)果，得到酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素的RSD值分別為2.0%，1.8%，2.2%（n=6），表明系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.7供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取安神寶顆粒（批號為161201）約1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別在0，3，6，9，12，15，21，24 h按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)法計算結(jié)果，得到酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素RSD分別為2.5%，2.8%，2.0%（n=8），表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8檢出限與定量限

取各對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=10為定量限，酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素的定量限分別為1.0，0.8，0.8 g/L；以信噪比S/N=3為檢測限，分別為0.1，0.05，0.05 g/L。

2.9回收率試驗(yàn)

精密稱取安神寶顆粒（批號為161201）樣品約1 g，共9份，分別精密加入上述混合對照品溶液0.7，0.8，0.9 mL，每個濃度平行3份，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)法計算，結(jié)果見表3。

2.10中間精密度試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，由不同操作人員于不同日期測定同一藥品，按外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)法計算樣品中酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素的RSD值分別為2.24%，1.03%，1.91%（n=5），表明儀器的中間精密度良好。

2.11樣品測定

取安神寶顆粒樣品（批號為161201，161202，161203），按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，每批平行2 份，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)法計算3批樣品中酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素的含量，結(jié)果見表4。

3討論

本方法針對安神寶顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未進(jìn)行含量測定的問題，提出了對安神寶顆粒同時進(jìn)行多成分含量測定的方法。將酸棗仁中具有安神功效的主要成分（酸棗仁皂苷A）、枸杞中具有鎮(zhèn)靜功效的成分（東莨菪內(nèi)酯）、藤合歡主要成分（槲皮素）作為含量測定參數(shù)，使安神寶顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更具有整體性、特征性和穩(wěn)定性，并且對檢測器、檢測波長、色譜流動相等進(jìn)行了反復(fù)研究、優(yōu)化。通過多指標(biāo)成分的定量控制，能夠綜合反映安神寶顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，提升制劑的質(zhì)量控制水平，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升做好前期準(zhǔn)備。

3.1檢測波長的研究確定

幾個主要成分的紫外吸收波長各不相同，并且紫外檢測背景干擾比較大。為了更好地同時適用多個成分的檢測，采用蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）。

3.2流動相的研究

對照品溶液的配制：分別精密稱取酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品適量，加甲醇溶液分別配制成0.1 g/L的溶液，作為對照品溶液。首先采用以下流動相進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，色譜柱：Agilent Zorbox SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，結(jié)果如下。

1）流動相為0.5%冰醋酸-甲醇（32∶68，體積比，下同）

分別進(jìn)樣酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品溶液，檢出酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素，東莨菪內(nèi)酯及槲皮素出峰時間過早無法分離。

2）流動相為水-甲醇-乙酸（45∶50∶5）

分別進(jìn)樣酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品溶液，檢出酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素，槲皮素出峰時間過早無法分離，棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B出峰時間過長，峰形不符合要求。

3）流動相為甲醇-水-冰醋酸（32∶68∶0.16）

分別進(jìn)樣酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品溶液，檢出槲皮素、其他峰形不符合要求。

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，同時檢測多成分需要進(jìn)行梯度洗脫分離各類成分。

4）流動相梯度洗脫研究

流動相：A為甲醇，B為0.5%冰醋酸進(jìn)行梯度洗脫，流動相比例在變化過程中有臨界比例，到達(dá)臨界比例時吸收值會出現(xiàn)較大變化，干擾樣品的檢測，對幾個對照品的出峰均產(chǎn)生干擾。調(diào)整梯度斜率，改變位置和峰形，將梯度系統(tǒng)改為漸變系統(tǒng)，減少流動相吸收值突然變化對對照品出峰的干擾。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)峰形得到一些改善，其中酸棗仁皂苷A、槲皮素峰形良好，酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿出峰時間處于流動相梯度改變區(qū)間，達(dá)不到基線分離。繼續(xù)調(diào)整流動相各區(qū)間的梯度，峰形改善，酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素出峰時間均處于流動相配比穩(wěn)定區(qū)間，達(dá)到基線分離。調(diào)整梯度系統(tǒng)，增加30%A流動相的沖洗時間，甜菜堿無出峰，槲皮素、酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯出峰良好，無干擾，酸棗仁皂苷B出峰與雜質(zhì)峰部分重疊，達(dá)不到分離。

3.3供試品溶液制備研究

梯度系統(tǒng)用對照品進(jìn)行研究，由于樣品中雜質(zhì)較多，樣品精制方法決定了雜質(zhì)是否對待測成分產(chǎn)生干擾，本試驗(yàn)進(jìn)行了供試品溶液精制方法研究。

1）精密稱取樣品2 g至10 mL的容量瓶中，超聲提取20 min，放至室溫，用甲醇定容，充分搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，作為供試品溶液1。

2）稱取樣品2 g于索氏提取器中，加50 mL石油醚，水浴加熱提取2 h，棄去石油醚，再用50 mL甲醇索氏提取3 h，收集甲醇提取液，回收甲醇并定量轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，充分搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，作為供試品溶液2。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：供試品溶液1由于無除雜步驟，雜質(zhì)峰對待測峰產(chǎn)生嚴(yán)重干擾；供試品溶液2除雜不完全，雜質(zhì)峰仍有干擾；本試驗(yàn)中使用的方法由于加入水解除雜步驟，甜菜堿無出峰，槲皮素、酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯出峰良好，無干擾，酸棗仁皂苷B出峰與雜質(zhì)峰部分重疊，達(dá)不到分離。最終選擇酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素作為指標(biāo)成分對安神寶顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制，以完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4結(jié)語

安神寶顆粒作為古典名方和中藥保護(hù)品種，由枸杞子、酸棗仁、藤合歡組成，療效確切。目前其質(zhì)量控制方法相對單一，不能很好地反映安神寶顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗(yàn)建立了安神寶顆粒含量的測定方法，靈敏度高、重復(fù)性好，可作為對安神寶顆粒質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)評價和全面控制的參考依據(jù)。

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