精液混合斑分離法醫(yī)學研究進展

王婧茹 黃存金

隨著生物技術(shù)不斷的發(fā)展進步，法醫(yī)DNA分析技術(shù)在案件偵破中的重要作用日益顯著。在大部分的性侵害案件中的生物物證是附著在載體上的各種斑跡，多為男性精液與女性的陰道分泌物組成的混合斑跡，但混合斑跡往往不能很好地發(fā)揮證據(jù)效能。所以為了能夠更好的服務(wù)于性侵害類案件的偵破，就需要在混合斑跡中分離出單獨的精子細胞DNA分型 [1]。但這類檢材的檢驗往往很難處理，尤其是男性精子細胞數(shù)量較少，與大量的女性上皮細胞混合在載體上，想要采用常規(guī)方法把男性細胞從載體上進行分離檢驗十分困難，多數(shù)情況下獲得的分型結(jié)果不是單一的男性分型，而是男女組分都存在的混合分型 [2]。所以為進一步提高精子細胞分離的效率，為案件偵破提供理論依據(jù)，為新分離方法的研發(fā)提供科研思路，本文對現(xiàn)有的精液混合斑的分離提取方法進行綜合評述：

1 差異裂解法

差異裂解法是大部分科研人員最常用的方法，該方法利用精子細胞膜含有豐富的二硫鍵，與上皮細胞外膜特性不同的原理，通過先用十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， SDS）和蛋白酶K裂解女性的陰道上皮細胞膜，將陰道上皮細胞的DNA分離出來后，再利用二硫蘇糖醇（dithiothreitol， DTT）裂解男性精子細胞膜，然后再用常規(guī)的方法提取純化精子DNA，從而達到使上皮細胞和精子細胞分離的目的。[3]

該方法應(yīng)用廣泛，卻耗時長，提取過程中可能過度裂解或裂解不完全，使得精子DNA丟失，在精子含量少、女性成分含量相對很高的混合檢材中，采用差異裂解法無法將女性成分完全去除，不能得到完整單一的男性STR分型。所以針對該方法的改良也較多，國內(nèi)外研究者先后建立了硅珠法[4]、和DNaseI純化結(jié)合堿性裂解法[5]等分離精子細胞的方法與此同時還研發(fā)出了Phase lock GelTM system[6]、DifferexTM system[7]、DNA IQTM system[8]、差異提取試劑盒[9]等商業(yè)化試劑盒。

雖然差異裂解法有時并不能得到理想的實驗結(jié)果，但是由于其檢測成本低，原理簡單，仍是國內(nèi)大多數(shù)研究人員處理精液混合斑的主要手段。

2 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)是在磁性微珠上通過抗原抗體特異性結(jié)合分離和富集目標物的技術(shù)。精子細胞膜表面有很多蛋白，有些膜蛋白具有精子組織特異性，甚至是人類種屬特異性，并且有較強的的抗原性。[10]篩選出合適精子細胞表面特異性抗原，制作單克隆抗體，與磁珠偶聯(lián)，利用抗原-抗體反應(yīng)通過精子細胞膜上相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合的免疫磁珠定向捕獲精子，進而達到分離精子的目的。

免疫磁珠法所用儀器設(shè)備簡單，適用于各種條件的實驗室，而且該方法能夠保持被分離細胞的原有生物學性狀和功能，能夠在分離同時進行純化、富集。[11]雖然免疫磁珠法具有操作簡便、分離效率高且可重復性好等明顯的優(yōu)勢，但是在實際應(yīng)用中，常由于精子細胞膜表面抗原的降解，無法進行直接分離的情況，還需要結(jié)合其他技術(shù)輔助完成精子細胞的分離。

3 顯微操作法

顯微操作法分離精子細胞是在倒置顯微鏡的觀察視野下，通過顯微操作儀，利用精子細胞的特殊形態(tài)，在混合細胞中分離與富集精細胞。

該方法可有效地獲得單個細胞，尤其對微量檢材分型成功率高。但對于輪奸案中的混合精斑，由于存在不同男性的精子細胞，且不能通過顯微鏡觀察分辨，所以往往會出現(xiàn)分型疊加的結(jié)果。而且需要一定的經(jīng)驗和技巧，顯微操作過程復雜；對微量精子甚至單個精子進行DNA分型時，由于模板量少，容易產(chǎn)生擴增不平衡、等位基因丟失或增加等問題，影響后續(xù)的DNA結(jié)果分析。[12]

4 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture mierodisseetion， LCM）是一種可以分離單個細胞的新技術(shù)，由于它能夠在顯微鏡的直視下自動化的迅速準確的選取單一細胞亞群或單個細胞[13]，利用紅外激光捕獲技術(shù)和紫外切割技術(shù)將選取的目標細胞從混合細胞中分離出來，從而為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。LCM基本原理是通過紅外激光脈沖激活熱塑膜，激光脈沖瞬間的高能量使目標細胞與轉(zhuǎn)運膜在光斑處的粘合凝固，從而有選擇性地將目標細胞或組織碎片分離出目標樣品 [14]。

近年來運用單純LCM技術(shù)，在實際檢案中也獲得了較滿意的效果[15]，但對于一些精子形態(tài)很難辨認的檢材，例如陳舊檢材，該方法仍有一定的局限性。所以LCM聯(lián)合免疫熒光染色技術(shù)或LCM聯(lián)合FISH技術(shù)應(yīng)運而生，這兩種方法避免了反復的載體轉(zhuǎn)移與洗脫過程，從而減少了精子細胞的損失，所以適用微量等疑難檢材的分析處理。但這兩種方法的設(shè)備昂貴，對操作人員要求較高；常因存在女性DNA粘附于精子細胞頭部或者轉(zhuǎn)移膜的情況，獲得混合分型，不能達到分離出單一精子DNA的目的 [12]。

5 微流控芯片

微流控芯片（microfluidic chip）是將采集樣品、前處理、反應(yīng)、分離、檢測等功能集中在一小塊芯片上進行分析，該技術(shù)以生物化學和分析化學為基礎(chǔ)，以微機電加工技術(shù)為依托，以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征的綜合類技術(shù) [16]。

該方法具有高速、高效、高能量、集成化、低樣品與試劑消耗、易在片集成多用途功能組件等特點，且芯片的體積小、重量輕、便于攜帶、可進行多通量操作，非常有利于實現(xiàn)精子細胞的高通量、自動化分離。目前技術(shù)研究主要集中在微流控芯片上以機械操控法[17]、雙向電泳[18]及聲波差異提取法[19]等方向來分離精液混合斑，但由于芯片技術(shù)還是一門新興學科，技術(shù)發(fā)展中還存在很多的不成熟，還需要進一步的改進與完善。

6 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù) （Flow cytometry， FCM）是集激光技術(shù)、電子生物技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、熒光化學技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)于一體的高科技技術(shù)。[20]FCM是將熒光素分子與制備好的具有精子細胞表面特異性抗原的單克隆抗體偶聯(lián)后，在含有精子細胞的混合液中孵育，制成帶有免疫熒光標記的單細胞懸液，在細胞線性排列通過時，檢測器將接收的被熒光染色的細胞所產(chǎn)生的熒光激發(fā)信號，與電荷及高壓靜電場聯(lián)合作用，實現(xiàn)多參數(shù)、快速定量的分析和分選。[21]

FCM能夠?qū)⒍喾N細胞的逐一分離，實現(xiàn)單個細胞水平的研究，對精子細胞相對含量極少的檢材有較高的靈敏度和精準度，同時可以加入其它參數(shù)的測定，為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。但與差異裂解法相比FCM同樣存在，對設(shè)備和操作人員的要求高的缺點，不利于推廣使用。

7 總結(jié)與展望

綜上所述，雖然國內(nèi)外研究人員依據(jù)上皮細胞與精子細胞在形態(tài)學、物理學、分子生物學等存在的差異，建立了多種分離精液混合斑的方法，但目前仍沒有一種方法能夠既易操作又可以有效、快速得分離精子細胞。目前隨著科技的不斷進步，為解決這一難題也提出了許多新的思路，也許不久的將來精液混合斑的分離將不再是個難題。

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作者簡介：王婧茹（1988），女，寧夏人，本科，法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證檢驗工作。