• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    腫瘤血管抑制劑Combretastatins的重要中間體CA4酸質量研究

    2018-05-14 19:44:04孫嘉茵李宇茜熊小平樊淑宏羅婷婷雍志全徐小平
    中國測試 2018年2期
    關鍵詞:高效液相色譜氣相色譜

    孫嘉茵 李宇茜 熊小平 樊淑宏 羅婷婷 雍志全 徐小平

    摘要:對Combretastatin系列化合物的重要中間體CA4酸(CA4s)理化特征、有關物質、殘留溶劑和含量測定的方法進行系統(tǒng)研究。通過IR、UV、MS、NMR等確定本品的化學結構。采用HPLC法檢測有關物質,條件為:色譜柱C18(150mm×4.60mm,5μm),流動相(體積比):0.1%甲酸(氨水調解pH至6.8)-甲醇-乙腈(75:22:3),檢測波長為220nm;采用HS-GC法檢測殘留溶劑,條件為:PEG20M(30m×0.53mm,1μm)的石英毛細管柱,柱溫80℃,檢測器溫度250℃(FID),進樣口溫度200℃,流量4.0mL/min,分流比:10:1;采用LC-MS鑒定本品有關物質;以剩余滴定法測定本品的含量。結果表明:CA4酸為難溶于水的淺黃色結晶性粉末,其化學結構與2-(3,4,5-三甲氧苯基)-3-[3-羥基-4-甲氧苯基卜丙烯酸相吻合,有6個雜質組分,經鑒定雜質5和雜質2為三甲氧基苯乙酸和異香草醛;雜質6為z式CA4酸,受光照影響發(fā)生較大的變化反映出順反異構的特征;殘留溶劑乙醇量小于0.08%。CA4酸為Combretastatinl類化合物的關鍵中間體,難溶于水,分子中的羧基可與堿性化合物作用生成可溶性的鹽,可突破該類化合物難溶性瓶頸,提高該類化合物抑制腫瘤血管的效率,是一個具有較高價值Combretastatins中間體或先導化合物。

    關鍵詞:CA4酸;抗腫瘤藥;高效液相色譜;氣相色譜

    文獻標志碼:A

    文章編號:1674-5124(2018)02-0041-07

    0引言

    Combretastatin類化合物是近年來發(fā)現的一類腫瘤血管抑制劑,其二苯乙烯母核的結構發(fā)現于南非灌木柳樹Combretumcaffrum的樹皮中,是一類具有順式二苯乙烯結構的天然產物,其抗腫瘤作用機理與秋水仙堿結構類似,是通過競爭抑制與微管蛋白相結合,從而發(fā)揮其抗有絲分裂的作用,達到抑制微管形成,阻滯細胞增殖以及抗血管活性的效果。在這類化合物中,Combretastatin A-4(CA4)具有最佳的微管抑制效果及體外細胞毒性,且對有異常結構特征和功能的腫瘤血管具有靶向抑制性,對正常血管作用較小,因而全身毒性較小且不易產生耐藥性,因而備受關注。但由于CA4具有水溶性較差且難以保持其有效構型等缺點,限制了其臨床應用。對該類化合物結構修飾并改善其水溶性是解決它們最終抗癌作用的關鍵,包括骨架及基團修飾和合成氨基糖類衍生物等。近年,國內外相繼開發(fā)出的CA4磷酸鹽前藥CA4P已進入II、III期臨床試驗。

    本文在CA4和CA4P研究的基礎上,發(fā)掘一種具有酸性結構的中間體——CA4酸(CA4s),可以通過成鹽產生具有良好水溶性的化合物,從而突破這類化合物的瓶頸。采用3,4,5-三甲氧基苯乙酸和異香草醛在乙酸酐和三乙胺中進行Perkin縮合反應,經濃鹽酸處理,并經無水乙醇重結晶精制,得到(E)-3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-丙烯酸(即CA4s,路線見圖1)。近期,CA4s與有機胺結合產生的DX1002作為腫瘤血管抑制劑已經申請國家一類創(chuàng)新藥臨床試驗,而CA4s的質量控制成為DX1002質量的關鍵,建立中間體CA4s的質量標準具有非常重要的意義,由于CA4s為首次開發(fā),暫無直接的研究報道,本文根據CA4s合成特點,針對其化學結構、性質和質量特征進行系統(tǒng)研究,確證其化學結構、性狀、種類,檢查其有關物質、建立含量測定方法,為進一步深入研究開發(fā)DX1002系列化合物提供中間體的分析方法和物質基礎。

    1實驗部分

    1.1儀器和試劑

    LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津),SPD-20A紫外/可見檢測器(日本島津),SePu3000色譜工作站(杭州普惠科技有限公司);Nicolet Impact 410型紅外光譜儀(美國Nicolet儀器公司);UV-2300紫外-可見分光光譜儀(上海天美科學儀器有限公司);GC7890F氣相色譜儀(FID,上海天美科學儀器有限公司);Varian UNITY INOVA型400核磁共振譜儀(美國Nicolet儀器公司);軌道阱高分辨質譜系統(tǒng)(LTQ Orbitrapelite美國熱電分析儀器公司);pHS-3C型酸度計(成都方舟科技開發(fā)公司);Sartorious BT 125D十萬分之一電子(德國Sartorius);SHANGPING FA2004萬分之一電子天平(上海天平儀器廠);KL10260D型超聲波清洗器(上海荊和分析儀器有限公司);DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥器(上海精宏實驗設備有限公司);SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(成都市予華偉業(yè)儀器有限公司);超純水機(成都品成科技有限公司);旋渦振蕩器(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)。

    CA4s樣品及其順式結構樣品(自制,東莞達信生物技術有限公司);異香草醛對照品(Adamas Reagentco.,Ltd.,批號:P1097634)和3,4,5-三甲氧基苯乙酸對照品(Adamas Reagentco.,Ltd.,批號:P03109);氫氧化鈉(AR,天津市科密歐化學試劑有限公司);濃硫酸(AR,成都市天華科技股份有限公司);甲醇(HPLC,天津科密歐化學試劑有限公司);乙腈(HPLC,進口分裝);氨水(AR,廣東光華科技股份有限公司);無水乙醇(HPLC,天津科密歐化學試劑有限公司);水為純水機自制超純水。

    1.2方法

    1.2.1CA4s的結構確證

    分別通過核磁共振(NMR)、質譜(MS)、紅外分光光度法(IR)和紫外分光光度法考察(CA4s)的結構。

    1.2.2CA4s的理化性質測定

    1)性狀的考察。取潔凈濾紙一張,挑取樣品少許置于其上,平鋪均勻,于自然光下觀察。取3份樣品適量,分別置于高溫(60℃)、高濕(相對溫度為92.5%)和光照(4500k)條件下1h,觀察外觀變化。

    2)溶解度的考察。照ChP.2015凡例要求,稱取樣品適量,于(25±2)℃條件下,加入待考察的溶劑適量,每隔5min強力振搖30s,觀察溶解情況??疾烊軇┌ǎ核⒓状?、乙醇、丙酮、氯仿、DMSO、DMF。

    3)pH的考察。取樣品適量,加超純水配制飽和溶液,測定pH。

    4)酸、堿條件下紫外圖譜。取樣品適量,精密稱定,分別加0.1mol/LhCl溶液和0.1mol/LnaOH溶液制成含量為20μg/mL的溶液,在波長200~400nm進行紫外掃描。

    1.2.3有關物質的研究

    1)色譜條件的確定

    以CA4P分離色譜條件為基礎,確定對CA4s的色譜條件為C18(150mm×4.60mm,5μm);流動相比例(體積比)為0.1%甲酸(pH 6.8)-甲醇-乙腈(75:22:3),柱溫30℃,流量1mL/min。

    2)方法學驗證

    照上述建立的CA4s有關物質HPLC檢測條件進行了相關方法學驗證,內容包括:1)專屬性試驗;2)檢測限與定量限的測定;3)精密度試驗(進樣精密度、重復性精密度及中間精密度)。

    3)重要有關物質的鑒定研究

    根據CA4s合成工藝及其有關物質分離結果表明,本品除了來自原料的異香草醛、三甲氧基苯乙酸外,受溫度和光照影響最明顯的為本品主峰后的雜質峰,為此,采用LC/MS對雜質進一步鑒定。色譜條件為ODS(4.6mm×250mm)色譜柱:流動相0.1%甲酸(氨水調pH 6.8)-甲醇-乙腈=75:22:3,流量1mL/min,進樣量為10μL,柱溫40℃:質譜條件為安捷倫三重串聯四級桿質譜,干燥氣為氮氣,氣體溫度:350℃,流量:11L/min,電噴霧離子源(ESI),毛細管電壓:4kV,霧化氣壓力:40psi(1psi=6.895kPa),裂解電壓:75V,離子化方式為正模式。碰撞能量:15V,細胞加速電壓:3V,檢測方式為多重反應監(jiān)測(MRM)方法。

    1.2.4殘留溶劑的檢查

    根據CA4s的合成和精制工藝,確定本品殘留溶劑為乙醇(bp.78.4℃)。參照ChP.2015通則0521氣相色譜法和通則0861殘留溶劑測定法,建立氣相色譜法檢測CA4s中的殘留乙醇并進行方法學驗證。

    1)色譜條件的選擇

    本文對色譜柱SE-54(30m×0.32mm,0.25μm)、OV-624(30m×0.53mm,0.5μm)、OV-17(15m×0.53mm,1.0μm)、PEG(30m×0.53mm,1μm);分流比(200:30、200:25、200:20、200:20、200:15、200:10、200:5);流量3.5,4.0,4.5mL/min和柱溫60,80,100,120℃、進樣方式(直接進樣、頂空進樣)以及溶劑(DMF、DMSO)等條件做了篩選,以乙醇的理論塔板數、分離度、拖尾因子為指標進行考察。

    2)線性與靈敏度

    CA4s中殘留乙醇約0.1%,因此設置線性范圍為0.0067-1.0796mg/mL,進樣濃度為0.0067,0.0135,0.0270,0.0540,0.1080,0.2699,0.5398,1.0796mg/mL。頂空后,依次精密量取上述溶液1mL分別注入氣相色譜儀,記錄色譜圖。按信噪比法,在S/N≥10,確定定量限,在S/N≥3,確定檢出限。

    3)回收率

    供試品溶液的配制:分別精密取本品9份(每份約1g)置于10mL容量瓶中,分為高、中、低3組。往低濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mL的對照品溶液0.8mL;往中濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mL對照品溶液1mL;往高濃度組加入乙醇濃度為0.75mg/mt的對照品溶液1.2mL,加入DMSO稀釋至刻度,分別作為CA4s回收率80%、100%、120%的供試品溶液。

    1.2.5含量測定研究

    根據CA4s結構(見圖2)中的羧基呈酸性的特點,試驗將采用酸堿滴定法就其含量進行測定。由于CA4s水溶性極差,所以,在設計本品含量測定方法時,采用了以定量過量NaOH溶液溶解,然后用硫酸標準溶液滴定的剩余滴定法來實現。

    1)滴定曲線的測定及指示劑的選擇

    取樣品約100mg,精密稱定,加入0.1mol/LnaOH滴定液25mL,搖勻溶解后加入50mL新沸水,用0.05mol/Lh2SO4滴定液滴定至溶液中有沉淀析出,并在滴定過程中,記錄滴定過程的pH值變化,繪制滴定曲線。

    2)精密度試驗

    重復性精密度:取同一批CA4s 6份,經含量測定,以CA4s的含量計算重復性精密度:中間精密度試驗:取本品,分別由兩個不同的實驗員連續(xù)6d、每人測定6份樣品含量,計算含量平均值和RSD。

    2結果與討論

    2.1結構確認

    如圖3所示,MS的分子離子峰(+m/z)為359,碎片峰與CA4s的分子量360的M-1吻合:NMR tH譜(圖4)的氫譜的歸屬分別為:63.296(d,3H,4"--OCH3),δ3.753(d,9H,3,4,5-OCH3),δ6.484(s,2H,2,6'-H),δ6.545(s,1H,2"-H),δ6.676(d,1H,5"-H),δ6.788(d,1H,6"-H),δ7.707(s,1H,3-H),除兩個活潑氫被D2O氘代,其他皆與結構吻合(具體編號見圖2);IR光譜(圖5)中波數3300,2900,1670,1600,1400cm-1等分別表現出結構中的羥基、甲基、羰基、甲氧基等,與CA4s分子結構中的相關基團吻合;UV光譜(圖6)特征表明,本品具有共軛體系,受羧基和酚羥基的影響,B帶和E帶都發(fā)生長移現象,最大吸收為311nm,與CA4s的機構特征吻合。4大譜結果表明本品的結構為2-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-3-(3-甲氧基2-羥基-苯基)丙烯酸。對比本品順反式UV譜(圖7)可知,由于羥基苯基在空間上影響到羧基的作用,使得311nm的最大吸收萎縮,并250nm的肩峰凸顯,由此證明本品系羧基與羥苯基于異側的反式或E式結構。即(E)2-(3,4,5'-三甲氧基-苯基)-3-(3”-甲氧基2"-羥基-苯基)丙烯酸。

    2.2理化性質

    試驗結果表明,本品為淺黃色結晶性粉末;在高溫和高濕條件下較穩(wěn)定,光照時出現顏色加深。難溶于水,微溶于甲醇和丙酮,易溶于乙醇,是其難以以原型發(fā)揮活性的根源,飽和水溶液的pH為6.48,在酸性條件較穩(wěn)定,在堿性條件下不穩(wěn)定。

    2.3有關物質研究

    2.3.1色譜分離的影響因素

    如圖8所示,水相的pH對分離呈負相關,pH升高保留時間縮短:水相比例提高保留時間增加;柱溫對本品色譜行為無明顯影響。

    2.3.2有關物質的鑒定

    結合CA4s的合成途徑,起始原料3,4,5-三甲氧基苯乙酸和異香草醛的色譜定位,以及LC/MS對本品雜質譜的分離和在線鑒定,分離出6個雜質組分,其中本品主峰前的雜質2為異香草醛、雜質5為3,4,5-三甲氧基苯乙酸。而雜質6與主峰分子質量相同,但保留時間相差甚遠,結合紫外吸收圖譜和核磁共振氫譜分析,確定雜質6為CA4s的順式(Z式)異構體,結構如圖9所示。

    2.3.3檢出限和定量限

    按信噪比法,在S/N≥10和S/N≥3,確定CA4s的定量限為1ng、檢出限為0.2ng。

    2.3.4專屬性試驗

    結果表明,酸破壞(4mol/LhCl破壞4h)和堿破壞(4mol/LnaOH破壞4h)條件下,供試品溶液雜質峰數量無明顯增加,主峰也無明顯降解;在氧化破壞(30%H2O2破壞4h)和高溫破壞(160℃放置1h)條件下,雜質峰含量略有增加,主峰無明顯降解。在光照破壞(4500Lx破壞4h)條件下,雜質峰數量和含量都有增加,雜質6含量增加尤為明顯,主峰也顯著降解。

    2.3.5精密度

    連續(xù)進樣6針,各雜質峰面積RSD在2.27%~5.03%,表明此方法進樣精密度良好。平行配制6份供試品溶液進樣,以不加校正因子的自身稀釋對照法計算各雜質含量,RSD在1.63%-4.67%之間,表明此方法重復性良好。連續(xù)3d,每天由兩名實驗員平行配制6份供試品溶液進樣,以不加校正因子的自身稀釋對照法計算各雜質含量,RSD在2.84%~5.07%,表明此方法中間精密度良好。

    2.3.6有關物質的含量檢查

    用建立的方法對自制3批樣品進行有關物質檢查,3批樣品中單個雜質含量均小于0.05%,總雜質含量小于0.5%,符合規(guī)定。

    2.3.7有關物質研究小結

    由于CA4s在水中幾乎不溶,采用甲醇作為溶劑時,各雜質峰有關物質峰理論塔板數均較低,對稱性差,且溶劑峰對保留時間短的雜質出峰影響很大。故采用甲醇溶解樣品制成高濃度的儲備液(約為5mg/mL),再用流動相作為溶劑,稀釋制成0.5mg/mL的供試品溶液,采用這種方法制備的供試品溶液色譜圖中,各雜質峰柱效有了顯著提高。通過專屬性試驗可以看出,CA4s對酸性、堿性、氧化、高溫條件耐受性較高,在光照的條件下容易發(fā)生構型反轉,得到順式結構的雜質6。因此在合成和儲存過程中,應注意避光。

    2.4殘留溶劑

    2.4.1色譜條件影響

    與其他3種類型色譜柱相比較時,PEG毛細管色譜柱在柱效、分離度和峰對際性方面均有明顯優(yōu)勢,并且分析時間合適;分流比對本品分析影響較大,隨著分流比增大,出峰時間延遲,乙醇峰理論塔板數升高,與基質中的雜質峰分離度有所提高,但靈敏度有所下降,當分流比10:1時,既能保證乙醇峰有較高的柱效、分離度和對稱性,保留時間也比較合適,故選擇分流比10:1;不同流量對本品分析影響不大,流量4.0mL/min時,有較好的柱效、分離度、對稱性,能保證殘留溶劑乙醇的有效檢出,故選擇流量4.0mL/min;柱溫對柱效和拖尾因子影響不大,但隨著柱溫的升高,乙醇峰的分離度顯著下降,柱溫80℃時,能保證殘留溶劑乙醇的有效檢出,且與空白溶劑中相關峰達到有效分離,故照國家藥品標準,選擇柱溫80℃:頂空進樣與直接進樣相比,柱效和峰對稱性等方面均有明顯優(yōu)勢,頂空進樣可避免基質影響和樣品對色譜柱的污染,故選擇頂空進樣方式;溶劑DMF在乙醇峰前面有溶劑峰,影響乙醇的檢出,故選擇DMSO作為殘留溶劑檢查的樣品溶劑。

    2.4.2系統(tǒng)適應性條件

    色譜柱為PEG毛細管色譜柱(30m×0.53mm,1μm),柱溫80℃,檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID),檢測器溫度250℃:進樣口溫度200℃;載氣為氮氣,流量為4.0mL/min,分流比10:1;頂空進樣,頂空瓶溫度80℃,平衡時間40min進樣:進樣體積1.0mL。

    2.4.3線性與靈敏度

    由乙醇峰高(H)對乙醇溶液濃度回歸作圖,獲得乙醇的標準曲線方程為y=674724.8172x-2034.2,(r2=0.9993)。乙醇濃度在0.0067-1.0796mg/mL范圍內,其線性關系良好。按信噪比法,在S/N≥10,確定定量限1.8μg/mL;在S/N≥3,確定檢出限為0.6μg/mL。

    2.4.4回收率與精密度

    經過高、中、低3種濃度的回收率測定結果分別為98.06%(RSD為4.57%)、103.6%(RSD為1.73%)、93.63%(RSD為7.21%):進樣精密度RSD為1.90%;重復性精密度測定殘留溶劑含量為0.0739%(RSD為4.10%)。方法的準確度和精密度均良好。

    2.4.53批樣品的殘留溶劑結果

    用建立的方法對自制3批樣品進行殘留溶劑檢查,3批樣品中殘留溶劑含量為0.0748%、0.0727%、0.0795%,符合規(guī)定。

    2.5含量測定

    2.5.1滴定曲線的考察

    滴定曲線確定突躍范圍為7.5~9.0,由于本品為難溶于水的酸性化合物,故實驗設計本品預先溶于定量的NaOH溶液中,由HCl標準溶液回滴定剩余的堿液,經空白校正后,計算出本品的含量。根據溶液體系由堿到酸的滴定過程,試驗選擇了堿性指示劑酚酞指示終點,溶液由紅色變?yōu)闊o色。

    2.5.2CA4s的含量測定方法

    取樣品約300mg,精密稱定,加入0.1mol/LnaOH滴定液25mL,充分搖勻溶解后加入50mL新沸水,加入酚酞指示劑2滴,用0.05mol/Lh2SO4滴定液滴定至溶液紅色消失,且0.5min內顏色無改變,并將結果用空白試驗校正。每1mLh2SO4(0.05mol/L)滴定液相當于36.04mgc19H20O7。

    2.5.3精密度試驗

    重復性精密度測定結果為100.7%(RSD 0.08%):中間精密度測定結果為100.5%(RSD 0.11%),說明此方法精密度良好。

    2.5.4 3批樣品含量測定

    用建立的方法對自制3批樣品含量進行測定,3批樣品含量分別為100.4%(RSD 0.057%)、100.6%(RSD 0.150%)、100.6%(RSD 0.057%)。

    2.5.5容量法研究小結

    采用酚酞作為指示劑時,溶液濃度對重點判斷影響很大,濃度越大變色現象越不明顯,經過多次對比試驗,在堿溶液中加入50mL新沸水對溶液進行稀釋后,能顯著觀察到變色現象,有利于減少終點誤差。

    3結束語

    CA4s作為Combretastatin類化合物重要中間體,其質量將對終產物造成直接影響。本品的化學結構鑒定結果表明與CA4s的結構式吻合:所建立的HPLC雜質檢查法、GC殘留溶劑檢查法和容量分析法能夠有效檢測出本品的有關物質、殘留溶劑和含量,可為進一步研究CA4s提供良好的分析手段。

    猜你喜歡
    高效液相色譜氣相色譜
    毛細管氣相色譜法分析白酒中的甲醇和酯類
    固相萃取—氣相色譜法測定農田溝渠水中6種有機磷農藥
    高效液相色譜法測定異菌脲原藥的含量
    丁草胺原油高效液相色譜法的研究
    高效液相色譜—串聯質譜法測定檳榔中9種有機磷農藥殘留
    高效液相色譜—二極管陣列檢測器法測定膠囊殼中20種禁用工業(yè)染料
    分析化學(2016年7期)2016-12-08 00:57:07
    氣相色譜法快速分析人唾液中7種短鏈脂肪酸
    分析化學(2016年7期)2016-12-08 00:09:44
    吹掃捕集—氣相色譜法同時測定海水中的氟氯烴和六氟化硫
    分析化學(2016年7期)2016-12-08 00:07:08
    基于GC/MS聯用的六種鄰苯二甲酸酯類塑化劑檢測探討
    價值工程(2016年29期)2016-11-14 01:34:54
    高效液相色譜技術在石油化工中的應用分析
    在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产欧美网| 午夜久久久在线观看| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 午夜成年电影在线免费观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费av中文字幕在线| 满18在线观看网站| 亚洲av国产av综合av卡| 国产av又大| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 91av网站免费观看| 捣出白浆h1v1| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本vs欧美在线观看视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美一级毛片孕妇| 天堂8中文在线网| 色综合婷婷激情| 黄色成人免费大全| 老司机靠b影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 99精品欧美一区二区三区四区| 成年人免费黄色播放视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人精品久久二区二区91| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费不卡黄色视频| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲成人免费av在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩精品免费视频一区二区三区| 考比视频在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美激情高清一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲av日韩在线播放| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 青草久久国产| 日本vs欧美在线观看视频| 多毛熟女@视频| 黄片播放在线免费| 中文字幕av电影在线播放| 国产亚洲精品一区二区www | √禁漫天堂资源中文www| 最新在线观看一区二区三区| 久久久久视频综合| 久久午夜综合久久蜜桃| 怎么达到女性高潮| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 婷婷成人精品国产| 999久久久国产精品视频| 午夜福利视频在线观看免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产不卡av网站在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩一区二区三区影片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 波多野结衣av一区二区av| 热re99久久精品国产66热6| 12—13女人毛片做爰片一| av在线播放免费不卡| 成年人免费黄色播放视频| 国产福利在线免费观看视频| 99香蕉大伊视频| 国产97色在线日韩免费| 国产男女内射视频| 看免费av毛片| 超碰成人久久| 亚洲欧美激情在线| 97在线人人人人妻| 一进一出好大好爽视频| videosex国产| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 人人妻人人澡人人看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 人人澡人人妻人| 在线观看免费高清a一片| 免费日韩欧美在线观看| 精品福利观看| 12—13女人毛片做爰片一| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 久久中文字幕人妻熟女| 丝袜人妻中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 香蕉久久夜色| 热re99久久精品国产66热6| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品人妻在线不人妻| 亚洲av电影在线进入| a级毛片在线看网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 夜夜夜夜夜久久久久| 9色porny在线观看| 午夜日韩欧美国产| 岛国在线观看网站| 在线观看免费视频日本深夜| 另类精品久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 一进一出好大好爽视频| 99国产综合亚洲精品| 亚洲五月婷婷丁香| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲一区中文字幕在线| 嫩草影视91久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 大码成人一级视频| 欧美久久黑人一区二区| 色老头精品视频在线观看| 嫩草影视91久久| 男女床上黄色一级片免费看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 黄色片一级片一级黄色片| 正在播放国产对白刺激| 美国免费a级毛片| 亚洲欧美激情在线| 少妇粗大呻吟视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 五月开心婷婷网| 日本av免费视频播放| 在线av久久热| 一区二区三区国产精品乱码| 天堂俺去俺来也www色官网| videos熟女内射| 国产在线免费精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 无人区码免费观看不卡 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲,欧美精品.| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 91大片在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 成年动漫av网址| 极品教师在线免费播放| 麻豆国产av国片精品| 国产精品欧美亚洲77777| 美国免费a级毛片| 成人av一区二区三区在线看| 国产高清激情床上av| 亚洲av日韩在线播放| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| av网站在线播放免费| 午夜福利影视在线免费观看| 久久 成人 亚洲| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 悠悠久久av| 深夜精品福利| 欧美精品一区二区大全| 久久这里只有精品19| 国产欧美日韩一区二区精品| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲国产欧美网| 丝袜在线中文字幕| 成年动漫av网址| 久久精品国产亚洲av高清一级| 色婷婷av一区二区三区视频| 窝窝影院91人妻| 亚洲中文字幕日韩| av在线播放免费不卡| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 免费av中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一级毛片电影观看| 成年版毛片免费区| 新久久久久国产一级毛片| 90打野战视频偷拍视频| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久精品国产欧美久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲全国av大片| 宅男免费午夜| 母亲3免费完整高清在线观看| 在线av久久热| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 超碰97精品在线观看| 国产精品国产av在线观看| 天天添夜夜摸| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产一区二区 视频在线| 久久国产精品影院| 久热这里只有精品99| cao死你这个sao货| 精品久久久久久电影网| 午夜91福利影院| 丝袜在线中文字幕| 少妇被粗大的猛进出69影院| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲精品乱久久久久久| 一本综合久久免费| 91成人精品电影| 久久精品人人爽人人爽视色| aaaaa片日本免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜视频精品福利| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产在线一区二区三区精| 午夜福利免费观看在线| 人人妻人人澡人人看| 黑人操中国人逼视频| 十八禁高潮呻吟视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| aaaaa片日本免费| 美国免费a级毛片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 在线看a的网站| 高清在线国产一区| 在线观看免费视频日本深夜| 久久av网站| av福利片在线| 99九九在线精品视频| videos熟女内射| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜久久久在线观看| 欧美日韩av久久| 国产伦理片在线播放av一区| 久久九九热精品免费| 国产一区二区 视频在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美激情 高清一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 超碰97精品在线观看| 国产精品.久久久| 国产成人av教育| 国产成人免费无遮挡视频| 999久久久国产精品视频| 色94色欧美一区二区| 国产97色在线日韩免费| 一本综合久久免费| 男人舔女人的私密视频| 五月开心婷婷网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产成人系列免费观看| 国产伦人伦偷精品视频| 日本vs欧美在线观看视频| 看免费av毛片| 在线观看免费视频日本深夜| 1024香蕉在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 看免费av毛片| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品福利观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美成狂野欧美在线观看| 青青草视频在线视频观看| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩欧美免费精品| 成人影院久久| 999精品在线视频| 黄色视频,在线免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 男人操女人黄网站| 黄色毛片三级朝国网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| cao死你这个sao货| 正在播放国产对白刺激| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产午夜精品久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线观看舔阴道视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 日日夜夜操网爽| 久久久国产欧美日韩av| av网站免费在线观看视频| www.熟女人妻精品国产| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美久久黑人一区二区| 丁香欧美五月| 丁香六月天网| 免费观看人在逋| 正在播放国产对白刺激| 午夜视频精品福利| 91av网站免费观看| av网站在线播放免费| 亚洲熟女毛片儿| 成在线人永久免费视频| 夫妻午夜视频| 国产成人欧美| 国产精品av久久久久免费| 欧美成人免费av一区二区三区 | 99热国产这里只有精品6| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产成人精品久久二区二区免费| av在线播放免费不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 老司机午夜十八禁免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成人国产一区在线观看| 一进一出抽搐动态| 亚洲色图av天堂| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人国语在线视频| 一级黄色大片毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| av片东京热男人的天堂| 国产精品免费视频内射| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 大型av网站在线播放| 国精品久久久久久国模美| 自线自在国产av| 人成视频在线观看免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黄色片一级片一级黄色片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 人妻一区二区av| 精品欧美一区二区三区在线| 久久久久久人人人人人| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美大码av| 91成人精品电影| 中文欧美无线码| 超碰成人久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 老司机午夜福利在线观看视频 | 十八禁网站网址无遮挡| 精品欧美一区二区三区在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 大型av网站在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 波多野结衣av一区二区av| 大香蕉久久成人网| 9191精品国产免费久久| av视频免费观看在线观看| 人人妻人人澡人人看| 少妇 在线观看| 色94色欧美一区二区| 久久ye,这里只有精品| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美日韩视频精品一区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 不卡一级毛片| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲中文日韩欧美视频| 精品一品国产午夜福利视频| 人人妻人人澡人人看| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美激情高清一区二区三区| 天堂8中文在线网| 日韩欧美一区视频在线观看| 制服诱惑二区| 成年版毛片免费区| 日韩视频一区二区在线观看| 在线播放国产精品三级| www日本在线高清视频| 亚洲国产看品久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| av免费在线观看网站| 黑丝袜美女国产一区| 黄色a级毛片大全视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| 黄色成人免费大全| 成在线人永久免费视频| 日本av手机在线免费观看| 国产高清激情床上av| 99热网站在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 中文字幕人妻丝袜制服| 我的亚洲天堂| 午夜福利欧美成人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜两性在线视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久精品免费免费高清| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费在线观看影片大全网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 人妻久久中文字幕网| 大型黄色视频在线免费观看| a级毛片在线看网站| 成人永久免费在线观看视频 | 一级毛片电影观看| 丝袜喷水一区| av福利片在线| 亚洲五月色婷婷综合| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| kizo精华| 欧美一级毛片孕妇| 飞空精品影院首页| 亚洲av国产av综合av卡| 精品久久久精品久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 天天影视国产精品| 人人妻人人澡人人看| 久久久精品区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 蜜桃在线观看..| 老司机午夜福利在线观看视频 | 视频区欧美日本亚洲| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 丝袜喷水一区| bbb黄色大片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天天操日日干夜夜撸| 男男h啪啪无遮挡| 久久av网站| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产一区有黄有色的免费视频| 女警被强在线播放| 女同久久另类99精品国产91| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 丝袜美足系列| 久久久久精品人妻al黑| 欧美国产精品一级二级三级| 一个人免费看片子| 午夜老司机福利片| 免费在线观看影片大全网站| a级毛片在线看网站| 亚洲国产欧美网| 99国产精品免费福利视频| 欧美精品av麻豆av| 免费少妇av软件| 最新的欧美精品一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 电影成人av| 9热在线视频观看99| 久久中文字幕一级| 在线观看免费高清a一片| 十八禁网站免费在线| 最新美女视频免费是黄的| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 啪啪无遮挡十八禁网站| 岛国在线观看网站| 18禁美女被吸乳视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产免费av片在线观看野外av| 大片电影免费在线观看免费| 搡老岳熟女国产| 女人精品久久久久毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲熟女精品中文字幕| 一级黄色大片毛片| 电影成人av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲专区字幕在线| 男女之事视频高清在线观看| 超碰成人久久| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品久久久久成人av| 久久中文字幕人妻熟女| 免费在线观看日本一区| www.999成人在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 一进一出好大好爽视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产不卡av网站在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 少妇被粗大的猛进出69影院| www.熟女人妻精品国产| 考比视频在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 人妻 亚洲 视频| 国产精品 欧美亚洲| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 免费少妇av软件| 午夜激情久久久久久久| 天天影视国产精品| 亚洲综合色网址| 成年动漫av网址| 国产激情久久老熟女| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 大片电影免费在线观看免费| avwww免费| 一级片'在线观看视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 老司机福利观看| 99re在线观看精品视频| av网站在线播放免费| 亚洲国产看品久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品视频人人做人人爽| 亚洲avbb在线观看| 亚洲国产看品久久| 亚洲avbb在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 国产激情久久老熟女| 国产主播在线观看一区二区| √禁漫天堂资源中文www| 国产主播在线观看一区二区| 免费av中文字幕在线| 亚洲第一av免费看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲精品在线美女| 亚洲熟女精品中文字幕| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费在线观看黄色视频的| 自线自在国产av| av福利片在线| 亚洲伊人色综图| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲欧美色中文字幕在线| av网站在线播放免费| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线播放国产精品三级| 国产伦理片在线播放av一区| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩三级视频一区二区三区| 午夜福利视频精品| 国产有黄有色有爽视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产老妇伦熟女老妇高清| av网站免费在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久亚洲真实| 国产视频一区二区在线看| 在线观看免费日韩欧美大片| 不卡av一区二区三区| av有码第一页| 精品少妇内射三级| 岛国毛片在线播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产一卡二卡三卡精品| 成人18禁在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人av教育| 男女午夜视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 黑人猛操日本美女一级片| 日韩欧美三级三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 热99国产精品久久久久久7| 男女边摸边吃奶| 不卡一级毛片| 亚洲国产av新网站| 丝袜喷水一区| 成人18禁在线播放| 久久久水蜜桃国产精品网| 真人做人爱边吃奶动态| 香蕉丝袜av| 下体分泌物呈黄色| 十八禁人妻一区二区| 悠悠久久av| 日本wwww免费看| 欧美在线黄色| 精品第一国产精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品 国内视频| 999精品在线视频| svipshipincom国产片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 两个人看的免费小视频| 岛国毛片在线播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品 国内视频| 丝袜在线中文字幕| av片东京热男人的天堂| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久人妻av系列| 色94色欧美一区二区| www日本在线高清视频| 高清毛片免费观看视频网站 |