甘蔗無根試管苗光合自養(yǎng)生根過程中葉片生理生化特征的變化

劉麗敏 何為中 劉紅堅 余坤興 范業(yè)賡 翁夢苓

摘 要 甘蔗光合自養(yǎng)生根技術(shù)是一種新型的試管苗生根方法，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基異養(yǎng)生根法有顯著優(yōu)勢。為了揭示甘蔗生根的生理生化機(jī)理，為完善其生根技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究以甘蔗栽培品種桂糖44號無根試管苗為材料，噴施ABT2號生根粉溶液后移栽于沙土混合基質(zhì)中，在普通日光溫室進(jìn)行自養(yǎng)生根。在生根過程中連續(xù)采樣調(diào)查試管苗生根率和生長狀態(tài)，檢測葉片中總?cè)~綠素、碳水化合物（蔗糖、可溶性糖）、三大內(nèi)源激素（IAA、ABA、CTK）含量和過氧化物酶（POD）活性。結(jié)果表明，由于環(huán)境改變，試管苗受到環(huán)境脅迫，致使葉片先微黃后轉(zhuǎn)綠，7 d后老葉變黃衰老，新葉開始長出，并與日俱增；第一批不定根在處理后第5天突破表皮，至第9天100%的試管苗完成不定根的再生。葉綠素含量先減少后增加而后下降，9 d后跳躍上升；蔗糖、可溶性糖含量先是呈波動上升后急劇下降再跳躍上升；ABA含量和POD活性先上升后下降；IAA和CTK含量則相反，先下降后上升。從試管苗生長狀態(tài)和生理生化指標(biāo)變化規(guī)律分析，本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過程分為3個階段，第一階段在0～7 d，為試管苗適應(yīng)期；第二階段在7～9 d，為試管苗異養(yǎng)自養(yǎng)切換期；第三階段在9～15 d，為試管苗自養(yǎng)能力恢復(fù)期，試管苗成功過渡到自養(yǎng)階段是試管苗獲得高存活率的必要條件。

關(guān)鍵詞 甘蔗；試管苗；光合自養(yǎng)生根；葉片；生理生化

中圖分類號 S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Photoautotrophic rooting technique is newly developed for in vitro sugarcane plantlets， which has a significant advantage over the conventional heterotrophic rooting technique. The purpose of this study is to reveal the physiological and biochemical mechanism of the new rooting technique， and ultimately to provide a theoretical basis for improving the technology. In this study， the sugarcane cultivar GT44 was used as the explant， and the in vitro sugarcane plantlets were transplanted in the mixed sandy soil substrate for photoautotrophic rooting in the sunlight greenhouse after sprayed with ABT 2 rooting powder solution and hardened for 24 h. During the rooting process， samples were taken continuously to investigate the rooting rate and growth status， the total chlorophyll， carbohydrates （sucrose， soluble sugars）， three types of endogenous hormones （IAA， ABA， CTK） contents and peroxidase （POD） activity in the leaves were detected. The results showed that the plantlets were stressed and got yellow slightly in the leaves due to environmental changes， then turned green. Seven days later the older leaves turned yellow and aging， but more new leaves appeared. The first signed adventitious roots broke through the epidermis at 5 d and 100% of plantlets completed their regeneration of adventitious roots before 9 d. The chlorophyll content decreased firstly then increased and decreased， but jumped up after 9 d. The sucrose and soluble sugar contents at first steadily increased then drastically declined from day 7 to day 9 and later jumped up. The ABA content and POD activity increased at first and then decreased. The contents of IAA and CTK were declined at first and then increased， which was in opposite to that of ABA. The findings of the study suggested that photoautotrophic rooting of sugarcane in vitro plantlets was divided into three phases： the first was the adaptation phase from 0 d to 7 d， the second was the heterotrophic-autotrophic switching phase from 7 d to 9 d， and the third was the autotrophic function recovery phase from 9 d to 15 d. Successful recovery of the autotrophic function was essential for high survival of sugarcane plantlets.

Key words sugarcane； in vitro plantlet； photoautotrophic rooting； leaf； physiology and biochemistry

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.006

糖業(yè)是廣西最重要和最有代表性的傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一，食糖年產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的60%以上，涉及90多個縣（市、區(qū)）、2 000多萬農(nóng)業(yè)人口、10多萬產(chǎn)業(yè)工人[1-2]。廣西糖業(yè)發(fā)展事關(guān)我國食糖供給安全，在促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、保障財政收入、實現(xiàn)農(nóng)民增收、促進(jìn)民族團(tuán)結(jié)和邊疆鞏固安寧等方面都發(fā)揮了重要作用。甘蔗種莖是甘蔗生產(chǎn)中產(chǎn)量和品質(zhì)形成基礎(chǔ)，因此，甘蔗良種繁育是甘蔗生產(chǎn)中的一項非常重要的工作。目前，甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于良種快速繁育和健康種苗生產(chǎn)，傳統(tǒng)的試管苗生產(chǎn)流程要經(jīng)過初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和移栽4個階段，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，耗時長，生產(chǎn)成本高。為了降低生產(chǎn)成本，本課題組在國內(nèi)最新研發(fā)了甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根技術(shù)。該技術(shù)是將試管苗的生根和馴化結(jié)合起來，省去了試管苗瓶內(nèi)生根的傳統(tǒng)程序。這樣減少了一次無菌操作的步驟，提高了培養(yǎng)室的利用率，簡化了組培程序，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。但該技術(shù)存在試管苗生根不穩(wěn)定、品種間存在差異、生根苗恢復(fù)慢等問題。甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根是試管苗從異養(yǎng)過渡到自養(yǎng)的生長適應(yīng)過程，試管苗從室內(nèi)人工控制的最適宜生長環(huán)境轉(zhuǎn)移到室外自然環(huán)境，由于試管苗一直處于非自然環(huán)境中生長，適應(yīng)自然環(huán)境的能力差，環(huán)境脅迫壓力大；另一方面，試管苗的不定根的再生和芽苗生長需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，通過測量甘蔗試管苗在光自養(yǎng)生根過程中一些生理生化指標(biāo)可以進(jìn)一步研究試管苗在生根過程中的生理生化變化規(guī)律及生根機(jī)理。目前相關(guān)研究主要集中在外部因素（如溫度、濕度和光強(qiáng)）、栽培基質(zhì)和激素處理的篩選等方面[3-6]，有關(guān)甘蔗無根試管苗自養(yǎng)條件下生根過程中葉片生理生化指標(biāo)變化特征報道極少[7-8]。Barlow等[9]認(rèn)為早期陸地植物根的進(jìn)化與持續(xù)增長的光合效率有關(guān)，根被用作是消除過多由光合作用產(chǎn)生碳的工具，證據(jù)是植物苗根（shoot-borne root）生長部位常位于碳水化合物富集部位，如葉片基部或節(jié)。

光合作用通過碳同化為植株提供能量，光合器官的馴化對試管苗的存活以及對苗和根的其他代謝途徑馴化有重要影響[10]。激素在調(diào)控植物生根發(fā)育的過程中，會通過調(diào)控植物體內(nèi)一系列的生化活動來配合根原基的誘導(dǎo)和發(fā)育[11-13]。內(nèi)源激素IAA的含量高低與試管苗生根密切相關(guān)，外源激素可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平，間接影響不定根形成及根系的形成和發(fā)育。Husen[14]報道，外源激素IBA處理黃檀（Dalbergia sissoo）插條誘導(dǎo)不定根發(fā)育的過程中，可溶性糖和淀粉含量不斷下降，蛋白質(zhì)和PER酶活性先升高后下降，這些代謝變化與扦插枝條的根原基發(fā)育有關(guān)，同時也意味著IBA的使用激活了糖代謝，釋放了能力。Klerk[15]報道，在蘋果微枝培養(yǎng)生根過程中，外源激素處理后的24 h內(nèi)，基部細(xì)胞受生長素激素刺激出現(xiàn)淀粉，然后在不定根誘導(dǎo)階段淀粉粒降解成單糖，供應(yīng)細(xì)胞分裂。激素也影響著葉片的衰老，IAA和CTK為抑制葉片早衰的激素，ABA為促進(jìn)葉片衰老的激素[16-17]。IAA抗衰老效果較小，CTK延緩葉片衰老效果明顯，對離體葉片的抗衰老效果尤其明顯[15-16]。ABA促進(jìn)植物葉片的衰老，影響細(xì)胞膜的透性，加速葉片的衰老[15]。

目前的研究普遍認(rèn)為植物的生長過程與植物內(nèi)源激素水平及各激素間相互平衡有密切關(guān)系，因而探討各種激素間的比例關(guān)系具有一定的價值。Hou等[18]在研究不同增殖代數(shù)板栗試管苗葉片內(nèi)源激素對不定根發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)，IAA/ABA、IAA/CTK的比值隨著增殖代數(shù)變大，生根率也隨之增大，說明IAA/ABA、IAA/CTK的比值大，有利于不定根的誘導(dǎo)發(fā)育。因此，本研究以甘蔗栽培品種桂糖44號的無根試管苗為材料，于噴施生根液前后，取樣測量葉片中總?cè)~綠素、蔗糖、可溶性糖、過氧化物酶（POD）和三大內(nèi)源激素[吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、細(xì)胞分裂素（CTK）]等生理生化指標(biāo)，研究甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過程中生理生化指標(biāo)的動態(tài)變化特征，探索試管苗光合自養(yǎng)生根機(jī)理，為進(jìn)一步研究甘蔗不定根發(fā)育和完善生根技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為廣西農(nóng)科院甘蔗研究所培育的甘蔗（Saccharum L. hybrid.cv））新品種‘桂糖44號增殖期的無根試管苗，由廣西農(nóng)科院甘蔗研究所生物室提供。該試管苗的培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)基為MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，繼代培養(yǎng)周期為15 d；室內(nèi)培養(yǎng)條件為溫度（28±2）℃，濕度60%～70%；光源為日光燈，光照時間12～18 h/d，光強(qiáng)（2 500±300） lx。

1.2 方法

1.2.1 試管苗噴施處理 試管苗預(yù)處理方法采用He等[19]的處理方法并加以改進(jìn)，即使用ABT生根粉溶液噴施甘蔗無根試管苗葉片，以葉片沾滿生根液為宜，煉苗24 h后將甘蔗分叢、清洗、消毒；后種植到塑料托盤內(nèi)（8伊6孔），栽培基質(zhì)為沙土混合物，混合比例黃泥∶沙=1∶1，每個孔種植一叢。放置于大棚內(nèi)，蓋膜，保持高溫高濕的環(huán)境，溫度20～40 ℃，濕度70%～100%，白晝光照強(qiáng)度控制在20 000 lx以下，但不能長時間低于2 000 lx。

1.2.2 生根率調(diào)查 噴施處理第2天，也就是移栽后第1天開始調(diào)查生根率，每次調(diào)查30叢，3次重復(fù)，統(tǒng)計不可自然分割個體和生根個體數(shù)量，生根率=生根個體數(shù)/自然分割個體總數(shù)×100%。

1.2.3 采樣方法 從噴施當(dāng)天為0 d，移栽種植當(dāng)天為1 d。噴施前開始取樣，從1～9 d，每天取樣一次，11～15 d隔天取樣一次。每次采30叢，3個重復(fù)，取同一部位（正1，2葉）綠色葉片為檢測樣品，樣品儲存在-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.4 檢測方法 葉綠素總含量測定采用張憲政[20]的方法，蔗糖測定采用紫外光比色法，可溶性糖采用蒽銅比色法、POD活性采用可見光比色法；IAA、ABA、CTK采用酶聯(lián)免疫方法測定。上述指標(biāo)除葉綠素總含量外其余均委托南京建成生物工程研究所進(jìn)行測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

圖表采用Microsoft Excel 2007繪制，試驗數(shù)據(jù)分析采用DPS16.05軟件完成。采用單因素方差分析法（one-way ANOVA）分析不同時間段的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 試管苗根系發(fā)育及葉片生長情況

結(jié)果表明，試管苗在噴施生根液處理之后第5天，開始觀察到有肉眼可見根出現(xiàn)，生根率為18%左右；第6天大量根系突破表皮，生根率為69%，增幅達(dá)51%（絕對值）；第7天生根率達(dá)83%。第8天生根率達(dá)90%左右，新葉開始抽出，老葉逐漸變黃，第9～15天生根率達(dá)到100%，根系逐漸伸長、數(shù)量增多，部分老葉變枯黃，新葉逐漸生長，展開變綠。

2.2 葉片葉綠素總含量變化與試管苗生根率變化的關(guān)系

葉綠素能夠吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換光能，是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量直接影響葉片的光合速率。甘蔗無根試管苗在移栽生根的過程中，葉綠素含量呈波浪式上升趨勢。從變化的差異顯著性看，一共分為5個階段。第1個階段在噴施生根液之后的0～2 d，試管苗從室內(nèi)培養(yǎng)的環(huán)境轉(zhuǎn)移到室外大棚，受環(huán)境變化的影響，葉綠體含量急劇降低，差異顯著（p<0.05）。第2個階段在2～6 d，試管苗根系在第5天首次突破表皮，試管苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，葉綠體有所恢復(fù)，葉綠素含量逐漸增加，但差異不顯著；第3階段在6～7 d，試管苗根系大量突破表皮，葉綠素含量急劇升高，在第7天達(dá)到峰值，差異顯著（p<0.05）；第4階段為第7～9天，老葉開始黃化，新葉開始生長，葉綠素含量下降；第5階段為第9天之后，試管苗生根率達(dá)100%，新葉抽出，試管苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，依靠自身光合作用進(jìn)行生長，葉綠素含量呈穩(wěn)定上升趨勢（圖1）。

2.3 葉片蔗糖含量變化與試管苗生根率變化的關(guān)系

蔗糖是光合同化物與能量的運輸和貯藏形式，是植物生長、發(fā)育過程中的重要化合物之一。如圖2所示，在0～4 d蔗糖含量差異不顯著，即葉片中蔗糖含量始終保持在試管苗增殖階段的水平。隨后在4～7 d，蔗糖含量緩慢升高，第7天達(dá)到一個階段高點，7～9 d蔗糖含量急劇下降，到第9天達(dá)到最低。隨后穩(wěn)步上升，到第15天達(dá)到峰值，比較圖1和圖2可發(fā)現(xiàn)葉片中葉綠素含量變化曲線與蔗糖含量變化曲線在生根過程的變化趨勢非常相近。試管苗根突破表皮前葉片中蔗糖含量保持在一個穩(wěn)定水平，第一批根出后至7 d蔗糖含量逐漸上升，然后生根率不斷上升，但蔗糖含量卻下降，直到9 d后，蔗糖才快速升高。蔗糖含量的變化一方面反應(yīng)了試管苗光合作用的能力，另一方面也體現(xiàn)了試管苗根系發(fā)育的各個時期的碳水化合物需求情況。0～7 d是試管苗不定根誘導(dǎo)、根原基形成、根原基伸長和根突破表皮的關(guān)鍵時期，試管苗生理代謝較低，光合產(chǎn)物合成大于消耗，蔗糖便可以存儲下來，含量增加。7～9 d，由于根系大量生長，新葉長出，消耗大于合成，蔗糖消耗很多，因此含量急劇下降。9～15 d，根系形成，有光合能力的新葉增加代謝活動減弱，光合產(chǎn)物累積，蔗糖含量增加。

2.4 葉片可溶性糖含量變化與試管苗生根率變化的關(guān)系

可溶性糖是植物體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，可以為植物的生長發(fā)育提供能量。如圖3所示，在試管苗光合自養(yǎng)生根過程中可溶性糖含量的呈倒雙峰的變化趨勢。在0～1 d含量小幅度升高，隨后1～4 d含量逐漸下降，在第4天達(dá)到第一個低谷；接著在4～8 d，含量逐漸上升，到第8天含量達(dá)到最大值，與低谷含量變化差異顯著（p<0.05）。到了第9天，含量急劇下降，與前一天的差異達(dá)到顯著水平（p<0.05）。第9天之后，含量逐步穩(wěn)定上升。

2.5 葉片POD活性變化與試管苗生根率變化的關(guān)系

過氧化物酶（POD）是普遍存在高等植物體內(nèi)的一類含鐵卟啉輔基的酶，亦是木質(zhì)素合成的主導(dǎo)酶，在不定根的誘導(dǎo)和根原基形成過程中POD通過氧化IAA調(diào)控IAA含量而起作用。同時，POD也是植物抵抗逆境脅迫的一個重要的生理指標(biāo)。如圖4所示，試管苗葉片POD活性呈雙峰變化趨勢。噴施處理之后第1天活性劇增上升，達(dá)到第一個小高峰，差異顯著（p<0.05）。第2～5天活性波動下降，到5 d達(dá)到最低點；接著5～7 d活性急劇增加，在第7天達(dá)到最高值，差異顯著（p<0.05）。在7～15 d后，POD活性曲線下降，在7～9 d降低，到第11天又輕微上升，之后活性穩(wěn)定下降，差異顯著（p<0.05）。

2.6 葉片內(nèi)源激素含量變化與試管苗生根率變化的關(guān)系

如圖5所示，在甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過程中，ABA的含量變化呈雙峰變化趨勢。在未噴施處理前（0 d）為最低值，接著含量逐漸上升，并在第4天達(dá)到第一個小峰值，差異達(dá)顯著水平（p<0.05）。第5天下降隨后又增加，到第7天達(dá)到最高值。隨后含量曲線下降，在第7～9天含量下降，在9～13 d又輕微上升，但差異不顯著。13 d之后含量急劇下降，差異顯著（p<0.05）。CTK含量變化呈一個谷型變化。從0～7 d，CTK含量呈曲線下降，到第7天達(dá)到最低值。第7～15天，含量曲線上升，在7～9 d上升，隨后11 d下降，自13 d之后，含量穩(wěn)定上升。在整個生根過程葉片IAA的含量都比同期的CTK和ABA含量低，且不同時間內(nèi)波動幅度較小，處理前（0 d）IAA含量達(dá)到最高，處理后下降，在第7天達(dá)到最低值，7 d后含量上升，但幅度很小，從1～15 d IAA含量變動幅度不顯著。從激素的數(shù)據(jù)中可以看出，噴施處理第7天是激素變化的一個臨界點，3種激素都在這個臨界點達(dá)到最低或最高值，ABA含量達(dá)到峰值，IAA和CTK含量出現(xiàn)最低點，在生根過程中，內(nèi)源激素含量波動幅度由大到小的排序依次是ABA含量，CTK含量和IAA含量。

2.7 葉片IAA/ABA和 IAA/CTK比值的變化與試管苗生根率變化的關(guān)系

生根過程也是多種植物激素相互協(xié)同、制約的過程，不同激素含量比值的變化更能反應(yīng)不定根形成能力。在試管苗生根過程中，IAA/CTK和IAA/ABA變化趨勢相似，0～7 d從最高峰植降到最低值，7 d后生根率達(dá)到80%以上后，IAA/CTK和IAA/ABA比值又緩慢上升，不同之處是IAA/CTK比值波動幅度小，而IAA/ABA比值波動幅度比較大。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過程中，光合作用重要指標(biāo)葉綠素和蔗糖含量的變化是同步的，這可能與如下事實相關(guān)：甘蔗試管苗葉片是恒溫、恒濕和異養(yǎng)的人工環(huán)境下生長發(fā)育而成，其葉片與大田生長植株葉片不一樣，表現(xiàn)異常，沒有功能氣孔、表皮發(fā)育差和光合效率低等[9]。試管苗移栽到溫室初期（0～7 d），葉片光合器官也需經(jīng)過環(huán)境適應(yīng)這個過程，因此一開始并不能建立高效的光合系統(tǒng)，光合作用指標(biāo)是緩慢升高；在7～9 d光合指標(biāo)急劇下降與這個時段的試管苗生長特征有關(guān)，試管苗根突破表皮達(dá)到高峰期，試管苗生根率達(dá)到100%，新葉也不斷抽出，碳水化合物消耗量激增，而另一方面試管苗原有葉片衰老和新葉光合作用效率低等原因致使蔗糖急降；9～15 d試管苗完成了根的再生和新葉新芽不斷生長后，其光合效率顯著提高。這與Rodriguez等[10]的報道結(jié)論相似?？扇苄蕴呛康淖兓瘎t體現(xiàn)了試管苗自身的能量儲備消耗與合成的比例關(guān)系。根據(jù)其變化趨勢，可能是前期激素誘導(dǎo)了試管苗根原基的分化，也促進(jìn)了淀粉的分解，試管苗自身儲備的能量充足，消耗小于合成；中期，根系和葉片生長需要消耗大量能量，試管苗自身儲備能量減少，消耗大于合成；后期，試管苗根系已經(jīng)建成，葉片已經(jīng)具備光合作用，合成大于消耗。IAA含量在甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過程的變化不大，說明IAA在整個過程中對根系的生長和葉片的衰老影響較小，但是一直保持在一個穩(wěn)定的水平，對根系生長發(fā)育，延緩葉片衰老也起到一定的作用。CTK含量變化則與葉片生長的狀態(tài)有關(guān)，前期CTK降低，葉片在在逆境中逐漸衰老，后期CTK逐漸升高，葉片逐漸適應(yīng)逆境，并有新葉片長。甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過程中ABA的含量波動幅度大。體現(xiàn)了試管苗在光合自養(yǎng)生根的過程中對環(huán)境的適應(yīng)能力。Chandra等[21]的研究也表明，在試管苗移栽訓(xùn)化過程中，ABA在維持植株體內(nèi)水分平衡和植物試管適應(yīng)環(huán)境脅迫方面發(fā)揮了重要作用。葉片中內(nèi)源激素及其比值的變化與傳統(tǒng)生根的不一致，其中的原因值得進(jìn)一步的研究。過氧化物酶（POD）是IAA分解代謝的關(guān)鍵酶，它能氧化分解IAA以此來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生長素水平，從而保持植物的正常生長發(fā)育，調(diào)節(jié)植物體的生長的節(jié)律。本試驗結(jié)果表明，生根過程中POD活性波動很大，但I(xiàn)AA濃度波動幅度很小，差異不顯著。這可能與POD存在的離子態(tài)有關(guān)。有報道指出POD降解IAA具有相對性，不是所有POD同工酶帶都具有強(qiáng)IAA氧化能力，陽離子POD（堿性或稱高等電點POD）與IAA的親合力強(qiáng)于陰離POD[22-23]。

甘蔗試管苗光合自養(yǎng)生根過程是試管苗從異養(yǎng)生長逐步過渡到自養(yǎng)生長的過程，結(jié)合對試管苗葉片各個生理生化指標(biāo)的分析，我們可以推斷，整個光合自養(yǎng)生根過程可以分為3個階段，即適應(yīng)期、異養(yǎng)自養(yǎng)切換期和自養(yǎng)功能恢復(fù)期。第一階段在0～7 d，試試管苗在這個階段生長環(huán)境發(fā)生劇烈變化，試管苗生長受到環(huán)境脅迫的影響，起初葉片微黃，后慢慢轉(zhuǎn)綠，不定根的誘導(dǎo)、根原基的形成在這一階段完成，并有部分不定根突破表皮，形成肉眼可見根，試管苗光合系統(tǒng)還不完善，主要依靠自身的碳水化合物供應(yīng)植株生長；第二階段在7～9 d，這個時期大部分植株不定根突破表皮，生根率達(dá)到100%，新葉開始出現(xiàn)，老葉衰老，呼吸作用大于光合作用，自身碳水化合物消耗大，試管苗從依靠自身碳水化合物開始轉(zhuǎn)換到依靠光合作用產(chǎn)物；第三階段在9～15 d，新葉抽出，不定根伸長和旺盛生長，試管苗逐漸建立自己的光合系統(tǒng)，根系開始吸收土壤中的營養(yǎng)和水分，光合作用產(chǎn)物逐漸供養(yǎng)植株生長需要。

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