木薯及其同源四倍體基因組與DNA甲基化差異分析

肖亮 周慧文 謝向譽(yù) 尚小紅 陳松筆 嚴(yán)華兵

摘 要 為研究染色體加倍對木薯基因組的影響，以及多倍化與2種不同倍性木薯之間DNA堿基序列的變化的聯(lián)系。本研究以木薯品種“新選048”二倍體及其同源四倍體為研究材料，使用微衛(wèi)星（simple sequence repeat， SSR）、目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（stand codon targeted polymorphism， SCoT）和甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)分別對木薯倍性間的遺傳差異、DNA甲基化水平和模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明：利用SCoT和SSR均未檢測出多態(tài)性條帶產(chǎn)生，利用MSAP技術(shù)可檢測出在DNA甲基化水平和模式均發(fā)生較大改變。二倍體和同源四倍體的總甲基化率分別為60.21%、59.52%，全甲基化率分別為39.92%、41.42%，半甲基化率分別為20.29%、18.10%。木薯多倍化后，其中有27.30%的位點(diǎn)發(fā)生了過甲基化，四倍體有25.00%的位點(diǎn)表現(xiàn)出去甲基化。本研究結(jié)果為探究木薯倍性間遺傳差異和表觀遺傳變化規(guī)律進(jìn)行了前期探索。

關(guān)鍵詞 木薯；二倍體；同源四倍體；DNA甲基化；遺傳差異

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To study the effect of chromosome doubling in cassava genome and， explore the relationship between changes of DNA sequence in two different ploidy levels and polyploidization variation in cassava， the cassava variety ‘Xinxuan 048 and its autotetraploid were taken as the materials to analyze the genomic mutation and DNA methylation diversity using microsatellite （Simple Sequence Repeat， SSR） and Stand codon targeted polymorphism （SCoT） molecular marker and Methylation Sensitive Amplification Polymorphism （MSAP） technique. The results showed that no polymorphic band occurred using SCoT and SSR molecular marker. In the level of DNA methylation，both of the level and pattern of the autotetraploid cassava changed. The total methylation rate of the diploid and the autotetraploid was 60.21% and 59.52%， respectively；the full methylation rate was 39.92% and 41.42%， respectively；the hemi methylation rate was 20.29% and 18.10%， respectively. In comparison to the diploid， the pattern of the methylation showed that about 25.00% sites was demethylation， 30.63% sites has been methylated in autotetraploid cassava. This research is a foundation for the further exploration of genetic differences and epigenetic regulation after cassava polyploidization.

Key words cassava； diploid； autotetraploid； DNA methylation； genetic differences

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）（2n=36）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，是熱帶地區(qū)第三大糧食作物，全球第六大糧食作物，被譽(yù)為“淀粉之王”，是世界近6億人賴以生存的糧食。除此之外，木薯還可飼用和加工成各種工業(yè)產(chǎn)品，如淀粉、酒精等[1]。因此，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和特色優(yōu)質(zhì)木薯品種選育顯得尤為必要[2]。

染色體多倍化在植物進(jìn)化過程中頻繁發(fā)生，對于產(chǎn)生新物種貢獻(xiàn)很大。同源四倍體植株能在細(xì)胞學(xué)、生理生化及表型方面發(fā)生顯著變化[3]。木薯為無性繁殖作物，基因組高度雜合，人工誘導(dǎo)多倍體是木薯種質(zhì)創(chuàng)新的理想途徑[4]。伴隨著同源多倍化，植物在基因組和表觀遺傳等水平都發(fā)生了顯著變化，如染色體重組、DNA序列消除、DNA甲基化等[5]。

分子標(biāo)記技術(shù)是目前研究上述領(lǐng)域的有效方法之一。梁武軍等[6]和鐘鳴等[7]利用簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat， SSR）鑒定葡萄柚（Citrus paradisi Macf）后代和柳枝稷（Panicum virgatum）的遺傳多樣性。韓國輝等[8]和周慧文等[9]分別利用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記（start condon targeted polymorphism，SCoT）分析枇杷（Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）和木薯的遺傳多樣性。然而，目前利用SSR和SCoT技術(shù)對不同倍性木薯間遺傳差異的相關(guān)研究卻鮮見報(bào)道。

植物中甲基化位點(diǎn)包括3種：CG、CHH和CHG（H表示除G以外的核苷酸）[10]。李雅婷等[11]曾利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）同源四倍體有28.63%的位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化，30.63%的位點(diǎn)發(fā)生了過甲基化。王紅娟等[12]以20對引物研究了二倍體與同源四倍體茅蒼術(shù)（Rhizoma Areactylodis Lanceae）的甲基化差異的擴(kuò)增總甲基化率為56.92%和55.03%，四倍體基因組DNA半甲基化率高于二倍體，而全甲基化率低于二倍體；四倍體與二倍體相比，DNA甲基化模式發(fā)生調(diào)整的基因位點(diǎn)占總檢測位點(diǎn)的52.53%。

本研究利用SSR和SCoT技術(shù)分析木薯品種“新選048”二倍體及其同源四倍體間的遺傳差異，并利用MSAP技術(shù)探究木薯二倍體與同源四倍體的DNA甲基化水平與模式的變化，旨在探究木薯倍性間DNA堿基序列變化與木薯同源多倍化之間的聯(lián)系以及為揭示木薯不同倍性間甲基化變異趨勢奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試的木薯品種“新選048”二倍體親本由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。其同源四倍體由本課題組前期使用秋水仙素加倍該品種獲得[13]。

19條SCoT引物序列參照嚴(yán)華兵等[14]文中所列（表1），36對SSR引物參照王明等[15]文中所列（表2）。MSAP接頭序列與引物序列見表3。

1.2 方法

1.2.1 材料獲得 將二倍體親本及其同源四倍體的6個(gè)不同株系的組培苗種植于溫室大棚內(nèi)，取葉片用于分子標(biāo)記分析；在同源四倍體中挑選一個(gè)株系，待莖稈成熟后，將莖稈砍成20 cm一段的稈扦插至盆中，2個(gè)月后取二倍體和四倍體的頂端嫩葉，用于甲基化分析。

1.2.2 木薯全基因組DNA提取 使用常規(guī)CTAB法提取其DNA。將提取好的DNA稀釋成60 ng/μL濃度，放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 SSR標(biāo)記擴(kuò)增與檢測 PCR擴(kuò)增體系與程序參照王明等[15]。SSR擴(kuò)增產(chǎn)物均用7%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，以恒定電壓600 V跑膠20 min。電泳結(jié)束后用1 g/L AgNO3染色8～10 min，顯影后拍照保存。

1.2.4 SCoT標(biāo)記擴(kuò)增與檢測 PCR擴(kuò)增體系與程序參照相關(guān)文獻(xiàn)[14]。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、GoldView核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。

1.2.5 MSAP分析 酶切體系完全參照李雅婷等[11]的方法。酶切完畢后，在酶切片段的兩端加上人工設(shè)計(jì)的與EcoR I和Hpa II/Msp I酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的人工接頭（表3）。接頭連接體系為20 μL，其中包含：2 μL 10×T4 Buffer、0.4 μL 20 μmol/L EcoR I和Hpa II/Msp I 接頭，其余用水補(bǔ)齊，16 ℃過夜。隨后進(jìn)行的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增使用的體系和PCR程序同樣參照李雅婷等[11]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)94 ℃變性10 min后于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳，銀染后觀察結(jié)果。每份材料擁有2條泳道，為同裂酶HpaⅡ、MspⅠ與EcoRⅠ組合進(jìn)行雙酶切所產(chǎn)生。

參照王春國等[16]的方法，將木薯二倍體與其同源四倍體的DNA甲基化水平變化分為4大類共15個(gè)亞類。A類是指在同一位點(diǎn)，二倍體與四倍體的擴(kuò)增模式未發(fā)生改變，即不存在擴(kuò)增多態(tài)性；B類表明在同一位點(diǎn)四倍體表現(xiàn)出過甲基化或超甲基化，即四倍體的甲基化水平較二倍體上調(diào)；C類表明四倍體表現(xiàn)出去甲基化，即四倍體較二倍體的甲基化水平下調(diào)；D類表明MSAP技術(shù)無法確定該位點(diǎn)甲基化狀態(tài)調(diào)整，但該位點(diǎn)的甲基化模式同樣產(chǎn)生多態(tài)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

在泳道的同一位點(diǎn)處，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，篩選條帶數(shù)量豐富，擴(kuò)增清晰的引物進(jìn)行條帶數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。MSAP條帶統(tǒng)計(jì)分析方法參考王春國等[16]和邊禹[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯二倍體與同源四倍體基因組的遺傳差異

用SSR標(biāo)記的36對引物對木薯二倍體及其同源四倍體共7份材料進(jìn)行擴(kuò)增，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1所示。從圖2中可見，所使用的引物可以在這7份材料中擴(kuò)增出清晰的條帶。每對引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在1～5之間，在7份材料中一共擴(kuò)增出672條條帶，平均每對引物在每份材料中擴(kuò)增出2.7條條帶，條帶大小主要集中于250～750 bp之間，但是沒有一條引物可以檢測到有新增位點(diǎn)或者缺失位點(diǎn)。

用19條SCoT分子標(biāo)記引物對木薯二倍體及其同源四倍體共7份材料進(jìn)行擴(kuò)增，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖2所示。從圖2中可見，所使用的引物均能在這7份材料中擴(kuò)增出清晰的條帶。每條引物擴(kuò)增條帶數(shù)在3～12條之間，大多數(shù)條帶大小集中在500～3 000 bp之間。19條SCoT引物共擴(kuò)增出1 008條條帶，平均每條引物在每份材料中擴(kuò)增出7.6條條帶。但結(jié)果同使用SSR分子標(biāo)記分析倍性間遺傳差異相同，均未發(fā)現(xiàn)有多態(tài)性條帶產(chǎn)生。雖然條帶有亮有暗，推測可能是由于基因的劑量效應(yīng)導(dǎo)致，而與堿基序列變化無關(guān)。所使用的6份同源四倍體材料與其二倍體親本沒有檢測出新增或缺失位點(diǎn)，即利用SCoT分子標(biāo)記也未能檢測出木薯倍性間的遺傳差異。

2.2 木薯二倍體與四倍體的MSAP結(jié)果

從50個(gè)引物組合中篩選出了23個(gè)擴(kuò)增條帶豐富，清晰可辨的引物組合，以這23個(gè)引物組合所擴(kuò)增出的位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示。23個(gè)引物組合共擴(kuò)增出1 500個(gè)位點(diǎn)，其中，二倍體共擴(kuò)增出754個(gè)位點(diǎn)，同源四倍體共擴(kuò)增出746個(gè)位點(diǎn)。雖然倍性間的總甲基化率幾近持平，四倍體略低于二倍體0.69%，但是甲基化類型發(fā)生了變化。同源四倍體雙鏈內(nèi)甲基化的位點(diǎn)低于二倍體4.84%，單鏈外甲基化的位點(diǎn)低于二倍體2.19%，完全甲基化的位點(diǎn)高于二倍體6.34%。其中，四倍體半甲基化率低于二倍體2.19%，全甲基化率高于二倍體1.5%。由此可見，木薯二倍體與其同源四倍體的總甲基化水平相差較小，但是各個(gè)甲基化類型發(fā)生了一定規(guī)模的改變。從DNA甲基化水平類型看（表5），木薯二倍體及其同源四倍體擴(kuò)增類型為A類的位點(diǎn)占總擴(kuò)增位點(diǎn)的43.62%，B類擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)占總數(shù)的27.30%。C類的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的比例是25.00%，D類擴(kuò)增條帶比例最小，為4.08%。綜上所述，多態(tài)性擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)目占總擴(kuò)增數(shù)目的56.38%，即木薯多倍化后，共有56.38%的位點(diǎn)甲基化模式發(fā)生了調(diào)整。

H2和M2分別代表木薯二倍體EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切擴(kuò)增結(jié)果。H4和M4代表木薯四倍體EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切擴(kuò)增結(jié)果。箭頭和字母表示不同甲基化擴(kuò)增模式（與表4對應(yīng)）。E39Msp59-E44Msp39為不同引物組合。M為marker。

3 討論

木薯為無性繁殖作物，基因組高度雜合，這決定了多倍體育種可作為木薯種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑[4]。2017年，有報(bào)道稱為了滿足人們生活需要，木薯長期的無性繁殖固定了大量的有害突變，同源多倍化產(chǎn)生冗余基因?qū)е嘛@性基因掩蓋隱性等位基因的有害突變，大大減少了純合隱性突變，降低有害個(gè)體發(fā)生的頻率；另一方面，同源多倍化還可以通過改變生物體重要基因拷貝數(shù)的增加會(huì)導(dǎo)致基因功能的多樣化[18]。本研究中利用SCoT和SSR分子標(biāo)記分析木薯“新選048”二倍體及同源四倍體的DNA堿基序列進(jìn)行檢測，并未發(fā)現(xiàn)木薯二倍體與其同源四倍體間的遺傳差異，這與曾少華[19]對柑橘國慶1號(hào)的研究結(jié)論一致，原因可能為：（1）選取標(biāo)記數(shù)量太少，如果在全基因組范圍內(nèi)多挑選一些SSR或許二倍體和四倍體之間能表現(xiàn)出遺傳差異。（2）本研究使用的檢測手段——SSR分子標(biāo)記和SCoT分子標(biāo)記具有局限性，未能對木薯二倍體與同源四倍體進(jìn)行全面檢測。或許更換分子標(biāo)記種類，如使用AFLP或許可以檢測出遺傳差異。

與通過高通量測序的重亞硫酸鹽處理DNA來檢測全基因組甲基化信息的方法相比，在AFLP分子標(biāo)記技術(shù)上改進(jìn)的甲基化敏感限制性酶切法（MSAP法）更為經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，且該方法操作簡便，可在全基因組水平上進(jìn)行DNA甲基化模式分析[20]，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于分析植物脅迫處理[21-22]、輻射誘變[23]以及化學(xué)方法誘變的DNA甲基化變異中。在本研究中應(yīng)用MSAP技術(shù)分析木薯二倍體與其同源四倍體的甲基化變異時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)倍性的甲基化水平十分相近，僅相差0.69%，但是有超過一半的位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)發(fā)生了改變，這與王春國等[16]結(jié)果相似。

前人研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化可以引起轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型產(chǎn)生巨大變異[24]，本課題組觀察到經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的同源四倍體木薯品種“新選048”有葉片變寬圓，葉色深綠，植株變矮和節(jié)間距變短現(xiàn)象[13]。根據(jù)MSAP甲基化分析結(jié)果推測，產(chǎn)生表型變異的原因可能是由于染色體加倍導(dǎo)致基因的“劑量效應(yīng)”或是DNA甲基化水平和模式改變而引起。

本研究利用SSR與SCoT分子標(biāo)記技術(shù)未能檢測出木薯品種“新選048”二倍體與其同源四倍體之間的基因組差異。利用MSAP技術(shù)可檢測出木薯品種“新選048”二倍體與其同源四倍體之間的DNA甲基化水平和模式發(fā)生了變化；其中，二倍體的總甲基化水平為60.21%；四倍體的總甲基化水平為59.52%，低于二倍體0.69%；木薯基因組加倍后，有56.38%的位點(diǎn)的甲基化模式發(fā)生了變異，其中有27.30%的位點(diǎn)發(fā)生了過甲基化，四倍體有25.00%的位點(diǎn)表現(xiàn)出去甲基化，此結(jié)論與鐵皮石斛[11]，茅蒼術(shù)[12]，水稻[25]，小麥[26]等研究結(jié)論基本一致。本研究為揭示木薯多倍化后表觀遺傳調(diào)控提供了理論依據(jù)。

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