DNA甲基化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控研究

孟彩鳳　周穎

摘 要：DNA甲基化修飾在表觀遺傳中占據(jù)重要的位置，DNA甲基化會(huì)改變啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)域的功能狀態(tài)，但不會(huì)改變胞嘧啶堿基序列。在植物中DNA甲基化發(fā)生在C的任何序列上：CG，CHG及CHH（H=A，T或者C）。植物中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要分為3類，染色質(zhì)甲基化酶（CMT）、甲基轉(zhuǎn)移酶I（MET I）和結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（DRM）。DNA甲基化主要通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)，如植物轉(zhuǎn)座子的沉默，內(nèi)源基因表達(dá)，春化作用，植物防御作用等，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞：DNA甲基化；植物；生長(zhǎng)發(fā)育

中圖分類號(hào) Q7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）10-29-04

Abstract：DNA methylation plays a dominant role in epigenetic mark.DNA methylation can change the function of regulatory regions without changing the cytosine base paring.In plants，any sequence of cytosine could be mathylated，including the symmetric CG，CHG，and the asymmetric CHH（H=A，T or G）.And there are three kinds of DNA methyltransferases in plants：Chromomethlase（CMT），DNA METHYLTRANSFERASE 1（MET1），DOMAINSREARRANGED METHYLTRANSFERASE（DRM）.DNA methylation regulates the growth and development of plants through regulating gene expression，transposon silencing，endogenous gene expression，vernalization，plant defense and so on.

Key words：DNA methylation；Plant；The growth and development

1 表觀遺傳學(xué)與表觀基因組

公元前3世紀(jì)，古希臘哲學(xué)家Aristoteles在《論動(dòng)物生成》中提出了相對(duì)于先成論（pre-formation）的后成理論（epigenesis），他認(rèn)為新器官是由未分化的團(tuán)塊發(fā)育形成的。1939年，發(fā)育生物學(xué)家Conrad Waddington根據(jù)希臘詞epigenesis正式提出表觀遺傳學(xué)的定義，他指出表觀遺傳主要是研究基因型（genotype）產(chǎn)生表型（phenotype）的過(guò)程，1942年他提出基因與表型之間存在一種因果機(jī)制，將這種控制機(jī)制定義為表觀遺傳學(xué)，并將表觀遺傳學(xué)列為生物學(xué)的一個(gè)分支。1975年，生物學(xué)家Robin Holliday比較系統(tǒng)的概括了表觀遺傳學(xué)的定義，即表觀遺傳學(xué)是研究在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，引起基因表型改變，并且通過(guò)有絲分裂、減數(shù)分裂等遺傳方式能夠在細(xì)胞與個(gè)體間傳遞，這種傳遞不遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的。經(jīng)過(guò)近80a的演變，逐漸形成了我們今天對(duì)表觀遺傳的定義：在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，全基因組范圍內(nèi)使表型能夠穩(wěn)定遺傳的修飾機(jī)制[1]。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化修飾，ATP依賴的染色質(zhì)重塑，組蛋白共價(jià)修飾，組蛋白變體和非編碼RNA編輯。眾所周知，在許多真核生物中，基因組的活動(dòng)是由組蛋白修飾和DNA甲基化來(lái)調(diào)控的，雖然我們不能忽視染色質(zhì)的其他修飾（包括H3K27me3）也屬于表觀遺傳的事實(shí)[2-3]，但是DNA的甲基化在表觀遺傳中占據(jù)了主要的位置，而且DNA甲基化是表觀遺傳標(biāo)記中最早發(fā)現(xiàn)且研究比較透徹的。

DNA甲基化為全基因組DNA提供了一種可逆的分子標(biāo)記方法。細(xì)菌可以將自身基因組中的腺苷酸或者胞嘧啶甲基化，以識(shí)別并降解入侵的外來(lái)DNA，同時(shí)還可以在細(xì)胞分裂前追蹤錯(cuò)配修復(fù)和基因組復(fù)制的進(jìn)度[4-5]。在植物和哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化修飾作為可遺傳的表觀遺傳修飾調(diào)控基因的表達(dá)[6-8]。真核生物DNA的甲基化只發(fā)生在胞嘧啶上，而且DNA序列CG中胞嘧啶的甲基化和組蛋白的H3中第9位的賴氨酸（H3K9me3）的三甲基化通常是在細(xì)胞分裂時(shí)通過(guò)DNA半保留復(fù)制的方式而獲得的[9-11]。自從這一現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)，把在體外甲基化的DNA導(dǎo)入抓蟾卵母細(xì)胞[12]或者培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中[12-13]此DNA的轉(zhuǎn)錄就會(huì)暫停，DNA甲基化就在功能上與抑制基因表達(dá)聯(lián)系起來(lái)了。重要的是，很多生物體中都不存在甲基化，所以甲基化不總是真核生物調(diào)控基因表達(dá)所必不可少的，這些生物體包括多細(xì)胞動(dòng)物，如雙翅目昆蟲(chóng)、秀麗隱桿線蟲(chóng)，這說(shuō)明在發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，生物體不一定要DNA甲基化。而在很多進(jìn)化枝中，DNA甲基化都是必不可少的，其普遍性及其在基因組上分布的廣泛性，表明由于DNA甲基化作用不同其存在模式也不同[14-16]。

2 DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的抑制機(jī)理

DNA甲基化能夠引起DNA的構(gòu)象、DNA的穩(wěn)定性、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用方式的改變，因此其在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)控以及基因組印跡等許多方面都有著不可替代的重要作用。

2.1 DNA甲基化直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子識(shí)別序列的結(jié)合 DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)是其特有的特殊結(jié)構(gòu)，而轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的部位就在DNA雙螺旋的大溝中，能夠被許多蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子所識(shí)別并結(jié)合的啟動(dòng)子序列也都會(huì)突出于大溝內(nèi)，這些可被轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的序列中含有CpG位點(diǎn)[17]，當(dāng)CpG位點(diǎn)的胞嘧啶被甲基化之后，諸如AP-2（堿性磷酸酶）、E2F（轉(zhuǎn)錄因子）、NF-κB（反式作用因子）、CAREB（周期性AMP依賴的啟動(dòng)因子）等在內(nèi)的許多對(duì)DNA甲基化位點(diǎn)敏感的轉(zhuǎn)錄因子就會(huì)不再和相應(yīng)的啟動(dòng)子序列結(jié)合，這就導(dǎo)致了相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)法啟動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)基因不能表達(dá)。但是還有一些例如SP1、CTF等等在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CpG二核苷酸胞嘧啶的甲基化并不敏感，因此這些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)也就不會(huì)受到甲基化的影響[18]。

2.2 特異的轉(zhuǎn)錄抑制物——甲基CpG結(jié)合蛋白與CpG的結(jié)合 當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子中的啟動(dòng)子識(shí)別序列中含有被甲基化的CpG序列時(shí)，特異的轉(zhuǎn)錄抑制物即甲基CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG bingding protein，MBP）就會(huì)與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子競(jìng)爭(zhēng)該甲基化序列上的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而也就導(dǎo)致了相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)被抑制。

2.3 DNA甲基化通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)起到抑制基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用 除了上述2種方式之外，DNA甲基化還能夠通過(guò)誘導(dǎo)染色質(zhì)失去活性、阻止相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入等方式來(lái)起到阻止染色質(zhì)的活化的作用[19]。目前對(duì)于通過(guò)DNA甲基化來(lái)抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性的研究主要是圍繞著基因沉默、DNA的高度甲基化以及結(jié)構(gòu)多變的染色質(zhì)之間的聯(lián)系進(jìn)行的。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化、基因沉默、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)之間存在著某種內(nèi)在的聯(lián)系，這種現(xiàn)象在很多年前就已經(jīng)被人們所發(fā)現(xiàn)。早期的研究顯示，高度甲基化的CpG二核苷酸序列與細(xì)胞核內(nèi)的異染色質(zhì)的形成有關(guān)，而體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA甲基化與染色質(zhì)質(zhì)凝聚形成染色體有關(guān)，其它的研究結(jié)果也表明未被甲基化或者低水平甲基化的CpG島大多集中在高度乙?；慕M蛋白上。出現(xiàn)這種機(jī)制的原因一直以來(lái)都不清楚，最近有研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)能都調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，這個(gè)理論有可能能夠證實(shí)這種機(jī)制。

染色質(zhì)的構(gòu)象呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，那么其DNA的高度甲基化是否會(huì)伴隨著組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?？這2個(gè)轉(zhuǎn)錄沉默通路間的相互作用機(jī)制是怎樣的？在導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默的眾多機(jī)制中，DNA甲基化是否占據(jù)主要地位？這許多的疑問(wèn)還尚未被解開(kāi)，還需要進(jìn)一步的研究，這也從側(cè)面說(shuō)明了DNA甲基化領(lǐng)域的復(fù)雜性與奇妙性。

3 植物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

根據(jù)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的類型，可以將其分為3類：第1種類型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可以將腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)镹6-甲基腺嘌呤；第2種類型則能將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)镹4-甲基胞嘧啶；第3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化的是最常見(jiàn)的DNA甲基化類型，就是將胞嘧啶轉(zhuǎn)變成為C5-甲基胞嘧啶。在原核生物中，這3種類型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶均可見(jiàn)到，它們主要參與了原核生物的限制-修飾系統(tǒng)、調(diào)節(jié)其DNA的復(fù)制和抗噬菌體感染的“免疫應(yīng)答”。而在高等真核生物中，則只發(fā)現(xiàn)有第3種類型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的存在，即DNA C5胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶。DNA C5胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸為甲基的供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上以完成DNA甲基化的全過(guò)程。根據(jù)其功能，DNA C5胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶又可分成以下2類：一類是維持DNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶，這種類型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要是在DNA進(jìn)行半保留復(fù)制的時(shí)候，根據(jù)親本鏈上特異的被甲基化修飾的位點(diǎn)，在新生成的新生鏈的相應(yīng)位置上也進(jìn)行同樣的甲基化修飾，這樣就使得在生物一代代遺傳的過(guò)程中，母體DNA甲基化的信息不會(huì)丟失，保證了生物體的穩(wěn)定性；另一類是DNA重頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，這種類型的酶主要是在生物體發(fā)育過(guò)程中使去甲基化的CpG位點(diǎn)重新再甲基化。

截至目前，在植物中發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要有3種，分別是：染色質(zhì)甲基化酶（CMT）、甲基轉(zhuǎn)移酶I（MET I）和結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（DRM），這3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在胞嘧啶不同的DNA序列中的活性是不同的。

3.1 染色質(zhì)甲基化酶（Chromomethylase，CMT） CMT甲基轉(zhuǎn)移酶在植物中分布十分廣泛，它主要是對(duì)異染色質(zhì)DNA進(jìn)行甲基化修飾。主要作用機(jī)理是一個(gè)染色質(zhì)功能域插入在甲基轉(zhuǎn)移酶保守的Ⅱ和Ⅳ亞基之間，這個(gè)功能域可以指導(dǎo)一些在DNA甲基化過(guò)程中也發(fā)揮作用的蛋白到異染色質(zhì)區(qū)域，然后由CMT甲基轉(zhuǎn)移酶催化對(duì)異染色質(zhì)DNA進(jìn)行甲基化修飾。在擬南芥中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有3個(gè)基因編碼CMT蛋白，在玉米和十字花科中也發(fā)現(xiàn)了2個(gè)基因[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，CMT3功能的缺失并不能使植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育和生理產(chǎn)生異常，這與另外2種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的突變體不同。

3.2 甲基轉(zhuǎn)移酶I（Methyltransferase I，METI） Finnegan等利用催化結(jié)構(gòu)的高度保守性，從擬南芥中分離得到了第一個(gè)植物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MetI的基因，MetI在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt 1十分類似。MetI家族是植物中最重要的一種DNA甲基化酶，在植物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中占有統(tǒng)治地位。它主要的作用是維持重復(fù)的和單拷貝的DNA序列的甲基化修飾[22]，從而將親代DNA序列相應(yīng)位點(diǎn)甲基化通過(guò)DNA復(fù)制傳遞給子代，以保證生物的穩(wěn)定性，除此之外MetI也很可能在重頭甲基化中起作用。MetI起作用的目的DNA大多是CG序列，除了擬南芥外，在豌豆、番茄、胡蘿卜和玉米中也已經(jīng)找到MetI的同源物。

3.3 重新甲基轉(zhuǎn)移酶（domain rearanged methylase，DRM） DRM的結(jié)構(gòu)與Dnmt3十分類似，特異性指導(dǎo)在CNG和CHH（H為除G以外的任何堿基）非對(duì)稱位點(diǎn)處的DNA序列發(fā)生甲基化修飾。DRM家族包括有DRM1、DRM2和DRM3這3個(gè)成員。DRM的N端結(jié)構(gòu)域包括有泛素結(jié)合序列，表明了DRM有泛素化潛能。DRM除了可以使非對(duì)稱位點(diǎn)的DNA序列從頭甲基化，還能維持失活轉(zhuǎn)座子以及轉(zhuǎn)基因沉默位點(diǎn)的胞嘧啶的甲基化[23]。DRM與真菌的作用方式非常相似，它的多突變體可以在2個(gè)位點(diǎn)恢復(fù)。

除了上述3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，在植物中還存在有第4類的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，也就是擬南芥中的DMT11和玉米種的DMT104，這2種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶很可能是Dnmt2家族的同類物。雖然它們?cè)诤芏辔锓N中呈現(xiàn)高度的保守性，但是它們的功能目前未研究清楚[24]。

4 DNA甲基化在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用

在一些原核生物中，DNA的甲基化修飾可使其形成對(duì)自身基因組的保護(hù)，以抵御外來(lái)基因的干擾。而在植物中DNA的甲基化主要對(duì)其基因的表達(dá)起到調(diào)控作用，進(jìn)而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)，另外DNA甲基化還與植物轉(zhuǎn)基因的沉默有關(guān)。

4.1 DNA甲基化是植物正常發(fā)育所必需的 研究證實(shí)，在植物中DNA甲基化的不足，會(huì)使其出現(xiàn)不正常的發(fā)育和表型。5-胞苷（5-zaC）是一種去甲基化劑，可以引起基因組DNA甲基化程度的明顯降低，用它處理水稻的種子和甘藍(lán)的幼苗發(fā)現(xiàn)，成熟植株的基因組DNA甲基化的程度明顯降低，表現(xiàn)出很多生長(zhǎng)發(fā)育異常性狀，如葉片小、植株矮小[25]等，并且這些特征大多都可以通過(guò)遺傳的方式傳遞給下一代。另外，F(xiàn)innegan[22]和Nakano[26]等人把DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的反義基因即MET1分別轉(zhuǎn)入野生型煙草和擬南芥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些植株的基因組DNA甲基化水平明顯降低，且營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)均發(fā)生異常，這種不正?，F(xiàn)象的程度與DNA去甲基化的水平呈現(xiàn)正比關(guān)系。這些都說(shuō)明了DNA甲基化對(duì)于植物來(lái)說(shuō)是其維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及其它過(guò)程中都起著不可替代的關(guān)鍵調(diào)控作用。

4.2 DNA甲基化與植物的春化作用 春化作用是通過(guò)DNA甲基化的改變來(lái)發(fā)揮作用的。用5-胞苷（5-zaC）對(duì)植物進(jìn)行處理可引起早花，說(shuō)明基因組DNA甲基化程度的降低對(duì)開(kāi)花起到促進(jìn)作用，而對(duì)春化作用不敏感的植物則對(duì)5-胞苷的處理沒(méi)有反應(yīng)，這些都說(shuō)明春化作用與DNA甲基化是密切相關(guān)的。同時(shí)，反義構(gòu)建植物DNA甲基化水平的降低，使其在沒(méi)有低溫處理時(shí)也促進(jìn)了開(kāi)花作用，而且對(duì)開(kāi)花作用的促進(jìn)作用與基因組DNA甲基化水平的降低程度呈正相關(guān)。雖然春化對(duì)開(kāi)花的促進(jìn)作用機(jī)理還不清楚，但其與DNA甲基化的密切聯(lián)系為其機(jī)理的研究提供了新的思路。

4.3 DNA甲基化可調(diào)節(jié)植物內(nèi)源基因的表達(dá) 在不同的發(fā)育時(shí)期以及不同的生長(zhǎng)環(huán)境下，植物發(fā)育的情況是不同的[27]，以適應(yīng)生存的需要，這主要取決于植物內(nèi)源基因的選擇性表達(dá)，與基因組本身的核苷酸序列無(wú)關(guān)。植物基因組DNA的甲基化在這個(gè)過(guò)程中起到了不可替代的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)基因處于活躍表達(dá)的狀態(tài)時(shí)，DNA甲基化的水平一般較低，然而隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育需要關(guān)閉該基因的表達(dá)時(shí)，該基因的啟動(dòng)子或者編碼區(qū)就會(huì)發(fā)生重新甲基化的現(xiàn)象，使其表達(dá)受到抑制；相反地，當(dāng)需要那些表達(dá)處于關(guān)閉狀態(tài)的基因重新活化時(shí)，該基因的啟動(dòng)子區(qū)域就會(huì)發(fā)生去甲基化過(guò)程，去甲基化的啟動(dòng)子對(duì)DNaseI有著高度的敏感性，這時(shí)基因的轉(zhuǎn)錄就開(kāi)始啟動(dòng)[28]。通過(guò)這些機(jī)制，植物就可以實(shí)現(xiàn)不同發(fā)育時(shí)期以及不同環(huán)境條件下基因的時(shí)空表達(dá)。

4.4 DNA甲基化對(duì)植物基因組防御的作用 在植物基因組中，寄生序列廣泛存在，即一些病毒的殘存序列和轉(zhuǎn)座子元件等，這些寄生系列的表達(dá)會(huì)對(duì)植物本身基因組的結(jié)構(gòu)和正常有序的基因表達(dá)造成破壞。DNA甲基化通過(guò)保護(hù)自身DNA序列不被自己的DNA限制性內(nèi)切酶破壞來(lái)保護(hù)自身基因，又通過(guò)對(duì)外來(lái)DNA序列的切割降解來(lái)抵御外來(lái)基因組的干擾。同時(shí)DNA甲基化通過(guò)抑制自身轉(zhuǎn)座子和外來(lái)DNA的轉(zhuǎn)錄，降低了由于非等位基因之間的轉(zhuǎn)座和重組引起的對(duì)基因組的破壞，既保護(hù)了植物自身，又抵御了外來(lái)基因的干擾。

5 結(jié)語(yǔ)

DNA甲基化是最常見(jiàn)的復(fù)制后及轉(zhuǎn)錄后修飾方式之一，它能夠在不改變基因組序列的前提下，對(duì)生物體基因的表達(dá)及其功能可逆的可遺傳的改變，DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、基因組印跡、生物體的發(fā)育調(diào)節(jié)等方面都有著重要作用。

DNA甲基化模式在不同時(shí)空的變化是生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，因此對(duì)早期胚胎DNA甲基化模式的研究，對(duì)于揭示在生物體早期特異表達(dá)的基因以及對(duì)其以后生長(zhǎng)發(fā)育的研究都是很有價(jià)值的。在動(dòng)物中，早期胚胎的整體甲基化程度的變化早已有了很透徹的研究，在其早期胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化整體水平呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，然而在植物中相關(guān)的研究仍非常有限。

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（責(zé)編：張宏民）