一個(gè)耐硒基因過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定

錢靚雯 歐陽劍 孟云

摘要 [目的]進(jìn)一步驗(yàn)證WRKY47基因在調(diào)控硒脅迫應(yīng)答中的功能，構(gòu)建WRKY47過表達(dá)載體，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系。[方法]以野生型擬南芥的cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增WRKY47基因全長，將該基因連接到pBI121載體上。將獲得的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株GV3101，通過浸化轉(zhuǎn)化法將WRKY47重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型植株中，利用轉(zhuǎn)基因篩選與遺傳鑒定獲得WRKY47轉(zhuǎn)基因陽性植株。[結(jié)果]擴(kuò)增獲得WRKY47基因，CDS全長1 470 bp，連接轉(zhuǎn)化并獲得測序正確的重組載體pBI121-WRKY47。通過抗性篩選和分子鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)論]成功構(gòu)建過表達(dá)載體并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系，為進(jìn)一步研究該基因的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 擬南芥；WRKY47基因；過表達(dá)；轉(zhuǎn)基因植株

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）20-0086-03

Abstract [Objective]To further confirm that WRKY47 gene was involved in the regulation of selenium stress response， the transgenic lines WRKY47 overexpression were generated. [Method] With the cDNA of wild type Arabidopsis thaliana（Col0） as a template， the full length of WRKY47 gene was amplified by PCR and cloned into pBI121 vector. The recombinant vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101. WRKY47 recombinant plasmid was transformed into Arabidopsis thaliana wild type by dipping transformation. The transgenic lines were isolated through antibiotic screening and genetic identification. [Result]The WRKY47 gene was amplified and the CDS was 1 470 bp in length， ligated and transformed to obtain the correct recombinant vector pBI121WRKY47. Transgenic plants were obtained by resistance screening and molecular identification. [Conclusion]The overexpression vector was successfully constructed and the corresponding transgenic lines were obtained， which laid the foundation for further study on the molecular mechanism of the gene.

Key words Arabidopsis thaliana；WRKY47 gene；Overexpression；Transgenetic plants

硒（Selenium，Se）是自然環(huán)境中廣泛存在的一種非金屬元素[1]。盡管沒有直接證據(jù)顯示硒對植物是必需的，但其已被證實(shí)是人類和動(dòng)物所必需的微量元素[2]。硒作為一種降低生物氧化脅迫的生物活性物質(zhì)，其功能受到抗氧化硒蛋白的調(diào)節(jié)，如谷胱甘肽過氧化物酶 （GPx） 和硫氧還蛋白還原酶（TrxR）[3]。近年來，有研究也證實(shí)補(bǔ)硒對預(yù)防與氧化脅迫或炎癥相關(guān)疾病有重要影響[4]。植物吸收硒的主要形式為硒酸鹽（SeO24-）和亞硒酸鹽（SeO23-）。硒在植物體內(nèi)能夠以多種化合物的形式存在，這些化合物大體可以分為無機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)。植物體內(nèi)主要以有機(jī)硒的形式存在，占80%以上；無機(jī)硒含量較少，占總硒的8%左右[5]。通過分子和基因組分析許多硒誘導(dǎo)基因已經(jīng)在擬南芥和其他植物中確定，其中包括一系列的調(diào)節(jié)脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量的轉(zhuǎn)錄因子。脅迫誘導(dǎo)基因不僅在最初脅迫反應(yīng)中起作用，而且還影響植物對該脅迫的耐受性。硒是人和動(dòng)物所必需的營養(yǎng)元素，而它的最低劑量和中毒劑量之間的范圍很窄。

合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在前期試驗(yàn)工作中篩到2個(gè)具有硒敏感表型的突變體wrky47-1、wrky47-2，研究了WRKY47基因在硒脅迫下的相關(guān)耐硒機(jī)理及對相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。筆者通過運(yùn)用生物學(xué)方面的各種方法成功構(gòu)建了WRKY47過表達(dá)載體并篩選鑒定得到過表達(dá)株系，為進(jìn)一步探究該基因分子功能提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。采用的植物材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana），購于美國擬南芥種子資源中心，遺傳背景為哥倫比亞（Col）型，后由分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁殖培育。

植物培養(yǎng)黑土購置于鎮(zhèn)江市京口區(qū)綠島園藝開發(fā)中心，土壤pH為5.6～7.0。

1.1.2 主要試劑和酶類。Easy Taq DNA Polymerase（TransGen）；Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase（TransGen）；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ（NEB）、KpnⅠ（NEB）、HindⅢ（NEB）； T4 DNA Ligase（TransGen）；Prime STAR HS DNA Polymerase（TaKaRa），Silwet L-77，蔗糖，MES，HgCl2。

1.1.3 菌體和質(zhì)粒載體。大腸桿菌感受態(tài)DH5α、農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101、pBI121表達(dá)載體。

1.2 方法[6-7]

1.2.1 土培營養(yǎng)液配制。按照表1、2配方配制土培營養(yǎng)液。

1.2.2 擬南芥土壤培養(yǎng)。首先將黑土高溫高壓滅菌20 min以上，冷卻后粉碎，再將蛭石、黑土、珍珠巖按照9.0∶3.0∶0.5的比例混合，裝入提前清洗干凈的缽子中。將配制好的營養(yǎng)液倒入托盤中，待土壤充分吸足營養(yǎng)液后，將種子用牙簽蘸取后點(diǎn)在土壤表面，置于溫室中培養(yǎng)。

1.2.3 WRKY47過表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.2.3.1 目的基因片段的獲得。①利用軟件設(shè)計(jì)所需引物，選用Xba Ⅰ和KpnⅡ 2個(gè)酶切位點(diǎn)。所需引物為FP：5′-GGGGT ACCATGGAAGAACATA TTCAAGATC-3′，RP：5′-CGGCGAGCTCTTAGTTTGT AGAGAAAGT GG-3′。②提取擬南芥植物組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模版用PS酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3.2 重組載體的獲得。①用分子生物學(xué)試劑盒回收目的基因及pBI121載體，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅡ置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行酶切。②用T4 連接酶將酶切產(chǎn)物置于金屬浴16 ℃過夜連接。③用熱擊轉(zhuǎn)化的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，然后涂布在含有50 μg/mL Kana抗性的固體LB平板上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。④待其長出單菌落后挑取單克隆轉(zhuǎn)接至含有相應(yīng)抗性的液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)12 h，進(jìn)行PCR鑒定，挑選陽性菌液送至上海生工生物公司測序，并用50%甘油以1∶1的比例將其置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因。用電擊轉(zhuǎn)化法將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中，涂布在含有50 μg/mL Kana抗性和50 μg/mL Gen抗性的固體LB平板上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。待其長出單菌落后挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，用條帶大小正確、成功轉(zhuǎn)化的陽性菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。

轉(zhuǎn)基因方法：將陽性菌液活化至OD600達(dá)0.8左右，用普通離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，時(shí)間為10 min，離心所得菌體用提前配制好的浸染緩沖液洗滌2次，最后重懸至菌液的OD600為0.8左右，浸染前1 d將開放的花朵剪去，澆滿水，次日將選取未盛開的花苞置于轉(zhuǎn)基因緩沖液中浸泡30～60 s，用保鮮膜包裹好置于黑暗處理24 h后于溫室培養(yǎng)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因陽性株系的篩選與鑒定。將收集的種子置于常溫下干燥7 d，并于 4 ℃春化7 d，將種子消毒后置于濾紙上干燥，用無菌牙簽慢慢地?fù)苋龅胶?0 μg/mL Kana抗性的1/2MS培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，可以看到陽性植株的根系發(fā)達(dá)并且葉片顏色翠綠，將其移栽至土壤中于培養(yǎng)室正常培養(yǎng)，并將其作為T1代植株。

待陽性植株生長21～28 d后，取植株葉片用CTAB法提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增條帶鑒定篩到的是否為陽性株系，將假陽性株系去除。將陽性植株所收獲的種子記為T2代植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥WRKY47基因克隆

用Trizol法提取擬南芥野生型植株的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)成cDNA，然后以cDNA為模板PCR擴(kuò)增WRKY47基因片段。擴(kuò)增出的目的基因片段如圖1a所示，擴(kuò)增后的片段電泳檢測條帶大小與預(yù)計(jì)一致，大小為1 470 bp左右，這證明已經(jīng)成功克隆出WRKY47基因。然后繁殖了pBI121質(zhì)粒載體，并進(jìn)行電泳檢測，由圖1b可知，條帶大小正確，條帶清晰，均可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建

選用pBI121質(zhì)粒作為過表達(dá)載體，經(jīng)軟件設(shè)計(jì)后選擇的酶切位點(diǎn)是XbaⅠ和KpnⅠ。將產(chǎn)純后的目的基因與表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行電泳檢測（圖2a、b），酶切后的基因和載體條帶清晰、大小正確，可用于下一步試驗(yàn)。

酶切成功后置于金屬浴中16 ℃過夜連接，接著將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂于含有抗性的平板上，待長出單菌落后挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，使用基因自身引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測結(jié)果見圖3。

將陽性菌株的菌液送至上海生工生物公司測序，測序比對結(jié)果與擬南芥網(wǎng)站上查得的序列一致。由以上結(jié)果可知WRKY47基因過表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定與篩選

收種后室溫干燥7 d，置于4 ℃冰箱春化3 d，消毒后用無菌牙簽撥撒到含有30 μg/mL Kana抗性的1/2MS培養(yǎng)基上，置于溫室培養(yǎng)14 d。14 d后可以看到轉(zhuǎn)化成功的擬南芥植株，它的長勢狀態(tài)比未成功轉(zhuǎn)基因的植株?duì)顟B(tài)好，并且它的根系發(fā)達(dá)、葉片翠綠。挑選長勢好的幼苗進(jìn)行土培移栽?？剐院Y選結(jié)果見圖4。

待植株生長14 d后提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，條帶大小約為1 500 bp（圖5），說明成功篩出了5個(gè)WRKY47基因過表達(dá)株系。

3 討論

在試驗(yàn)中通過分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法構(gòu)建了WRKY47過表達(dá)載體并成功篩選獲得了過表達(dá)材料，這一試驗(yàn)成果對于后期研究該基因在耐硒脅迫中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能具有重大的意義，為進(jìn)一步研究此基因的耐硒富硒機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

硒的有益和有毒作用之間的濃度差異較小[8]，硒是人和動(dòng)物必需的14種微量元素之一，具有抗氧化作用、抗癌作用、預(yù)防各種疾病作用，還能抵抗人體內(nèi)有毒金屬元素積累。由于動(dòng)物和人類不能從自然界的土壤中吸收所需要的有機(jī)態(tài)硒，但能夠吸收植物中所含有的有機(jī)態(tài)硒，植物可吸收和富積有機(jī)態(tài)硒的這個(gè)能力對人們來說是很寶貴的，對植物富積硒的研究不斷深入，為保證人體健康提供了保障[9]。通過分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法研究植物硒代謝積累相關(guān)途徑已經(jīng)開始，這將為尋找植物中潛在的參與硒脅迫應(yīng)答的基因，提高目標(biāo)植物中的硒含量奠定扎實(shí)的理論依據(jù)。這一具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的研究將推動(dòng)富硒功能性食品、保健品等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為人體硒營養(yǎng)健康做出重要貢獻(xiàn)[10]。

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