西南地區(qū)民族習(xí)用藥香龍肝香（杠香）的品種鑒定

張丹雁 范紫穎 馬換換 林如意 趙維波 梁耀勇 李偉

摘要 [目的]鑒定云川貴民族習(xí)用藥香龍肝香（杠香）的原植物品種，保護(hù)和開(kāi)發(fā)民族藥用新資源。[方法]實(shí)地調(diào)研、采訪，采集龍肝香（杠香）原植物，收集標(biāo)本，用基原鑒定法、性狀鑒定法以及DNA條形碼技術(shù)鑒別龍肝香（杠香）原植物品種。 [結(jié)果]龍肝香（杠香）的藤本植物形態(tài)、香藥材性狀特征及DNA條形碼特征與豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）相吻合。[結(jié)論]云川貴民族習(xí)用藥香龍肝香（杠香）來(lái)源于豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀富含樹(shù)脂的木質(zhì)藤莖。

關(guān)鍵詞 龍肝香；杠香；藥香；滇黔黃檀；品種鑒定

中圖分類(lèi)號(hào) R282.71文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）16-0011-03

Abstract [Objective] The research aimed to identify original plant variety of Longganxiang （Gangxiang） which was conventionally used as medicine and spice in Yunnan，Sichuan，Guizhou Province，and to provide basis for protection and development of new medicinal resources for the nation. [Methods] Field surveys，interviews and collection of the original plants of Longganxiang （Gangxiang），and to collect the plant samples. Next，germplasm origin identification method，character identification method and DNA barcode technology was used to identify the original plant varieties of Longganxiang（Gangxiang）. [Result] The morphological characteristics，macroscopic characters and DNA barcode information of Longganxiang （Gangxiang） were accordant with Dalbergia yunnanensis Franch.. [Conclusion] Longganxiang （Gangxiang） which conventionally used in Yunnan，Sichuan，Guizhou Province was derived from Dalbergia yunnanensis Franch. resinrich woody cane.

Key words Longganxiang；Gangxiang；Chinese medicine and spices；Dalbergia yunnanensis Franch.；Variety identification

長(zhǎng)期以來(lái)，云南、四川及貴州等地少數(shù)民族在襲用一種名為龍肝香、杠香、藤香、秧青、紫降及云香等稱(chēng)謂的富含樹(shù)脂的藤本木質(zhì)香材作為心血管、胃腸道及外傷常見(jiàn)疾病防治的民間藥，以及道觀祭祀香料，具悠久的藥用及香用歷史。此外，龍肝香（杠香）木質(zhì)致密、花紋美觀，氣味芳香怡人，亦深受香道廣大愛(ài)好者的青睞，并開(kāi)始盛行于香料文玩市場(chǎng)。龍肝香（杠香）作為西南少數(shù)民族地區(qū)藥香兩用原料，其原植物廣泛分布于云南、四川、貴州及廣西等地，資源豐富，然而這個(gè)被當(dāng)?shù)孛癖姾拖惴鹞耐婀に囀袌?chǎng)大量使用的藤類(lèi)香材究竟來(lái)源于何物種，至今尚未明確，且名稱(chēng)頗多，各地叫法混亂。鑒于龍肝香（杠香）獨(dú)特的香藥兩用價(jià)值，為挖掘和開(kāi)發(fā)民間藥用新資源，筆者通過(guò)實(shí)地考察，收集香材原植物標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行物種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

龍肝香（杠香）原植物及其香材采自云南省大理市及龍陵縣山區(qū)；樣品均保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室。

1.1.2 試劑。天根植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP305]；Goldview（Life Technologies，美國(guó)）；Agarse（Life Technologies，美國(guó)）；6×Loading buffer（Thermo，美國(guó)）；PrimeSTAR HS Premix（TaKaRa，大連）；DL2000 DNA Marker（Bioteke，北京）；rbcL序列引物（由深圳華大基因科技有限公司合成）。

1.1.3 儀器。1-15型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma有限公司，德國(guó)）；T100型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)伯樂(lè)有限公司）；JY1000C電泳儀（上海京工實(shí)業(yè)有限公司）；K-WHS型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；Eppendorf Research plus微量移液器（艾本德中國(guó)有限公司）；Precisa XS 125A型電子分析天平（瑞士Precisa有限公司）；Lab Dancer/MS3型渦旋混合儀（德國(guó)IKA有限公司）；HR-220型掌上離心機(jī)（北京鼎昊源科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基原鑒定及性狀鑒定。通過(guò)實(shí)地調(diào)研、采訪，觀察龍肝香（杠香）原植物生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征，采集標(biāo)本并記錄描述其形態(tài)及香材性狀特征，鑒定原植物品種。

1.2.2 DNA條形碼鑒別。

1.2.2.1 樣品前處理。將采集得到的新鮮葉片迅速置入裝有變色硅膠的密封袋中，以使盡量干燥完全。

1.2.2.2 樣品DNA提取。提取方法參照植物天根DP305基因組DNA提取試劑盒操作指南進(jìn)行部分調(diào)整：①取經(jīng)硅膠干燥后的葉片30 mg，加入等量石英砂，充分研磨。②將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有800 μL 65 ℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中（試驗(yàn)前在預(yù)熱的GP1中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1%），迅速顛倒混勻后，將離心管放在65 ℃水浴20 min，水浴過(guò)程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。③加入800 μL氯仿，充分混勻，12 000 r/min 離心5 min。④將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入新離心管中，加入800 μL緩沖液GP2，充分混勻。⑤將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12 000 r/min 離心30 s，棄掉廢液。⑥向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑧重復(fù)操作步驟⑦。⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑩將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。B11重復(fù)步驟⑩。B12將收集到的共100 μL 洗脫緩沖液TE加入到吸附柱CB3中，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，以提高DNA收率。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增反應(yīng)程序。PCR擴(kuò)增體系為rbcl正向引物及反向引物各1 μL，DNA模板4 μL，蒸餾水19 μL，DNA聚合酶25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性溫度94 ℃，時(shí)間120 s；變性溫度98 ℃，時(shí)間10 s；退火溫度55 ℃；延伸溫度72 ℃，時(shí)間30 s；以上程序進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后延伸溫度為72 ℃，時(shí)間為300 s；最終保存溫度為4 ℃。

1.2.2.4 電泳檢測(cè)。上樣量：PCR產(chǎn)物 5 μL；Marker 3 μL。電泳條件：100 V，400 mA，30 min。

1.2.2.5 測(cè)序及分析。PCR樣品送樣30 μL，正向引物rbcLa-F送樣15 μL，交由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用GeneBank進(jìn)行在線(xiàn)Blast。

2 結(jié)果與分析

2.1 基源鑒別

大藤本，有時(shí)呈大灌木或小喬木狀，小枝呈螺旋狀或鉤狀。羽狀復(fù)葉，葉軸被微柔毛；小葉13～25片，近革質(zhì)，長(zhǎng)圓形或橢圓狀長(zhǎng)圓形，先端微凹或鈍，葉表面具銹色稀疏毛，背面毛多，密集于中脈。葉干后背面粉白，邊緣反卷，多角形脈島細(xì)小且清晰。聚傘花序頂生或生于上部葉腋，花序梗與花梗被微柔毛?；ㄉ悦芗?，小苞片卵形，花萼鐘狀，花冠白色，旗瓣闊倒卵狀長(zhǎng)圓形，先端稍凹缺，基部具闊短瓣柄，翼瓣狹倒卵狀長(zhǎng)圓形，無(wú)耳，龍骨瓣近半月形，內(nèi)側(cè)具耳，與翼瓣同具狹長(zhǎng)瓣柄。雄蕊9，子房無(wú)毛或被微柔毛，花柱短。莢果薄革質(zhì)，長(zhǎng)圓形或橢圓形，種子部分具明顯網(wǎng)紋，種子多數(shù)1粒，少見(jiàn)2～3粒，腎形（圖1）?；ㄆ?—5月。

2.2 性狀鑒別

香材外皮脫落，木部呈圓柱形、扁塊狀或不規(guī)則塊狀，表面呈黃棕色、紅棕色至棕黑色，有時(shí)殘留條形或塊狀黃白色木部，形成深淺不一的花紋，偶見(jiàn)棕黑色發(fā)亮樹(shù)脂斑及長(zhǎng)圓形凹窩（香眼），土埋者棕色或褐色，通體附著紅色細(xì)粉。木質(zhì)堅(jiān)硬致密，斷面具同心環(huán)狀或輻射狀黃棕、紅棕、棕褐色等花紋，偶見(jiàn)中空（圖2）。氣芳香，味微苦辛、微澀，回甘，火燒冒黑煙，滲油，香氣四溢。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

龍肝香（杠香）PCR擴(kuò)增出單一清晰的目標(biāo)條帶（如圖3所示，rbcL序列約為600 bp），表明PCR體系及擴(kuò)增條件對(duì)模板DNA擴(kuò)增效果理想，特異性高，適用于該試驗(yàn)龍肝香（杠香）模板DNA的PCR擴(kuò)增研究。

2.4 測(cè)序結(jié)果與分析

龍肝香（杠香）rbcl基因序列經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測(cè)序分析，所得rbcl序列為：CGAC

CGTAATTCTTAGCGGATAACCCCAATTTCGGTTTAATAGTAC

ATCCCAATAGGGGACGGCCATACTTGTTTAATTTATCTCTTT

CAACTTGGATACCGTGAGGCGGACCTTGGAAAGTTTTAACA

TAAGAAGTAGGGATTCGCAAATCTTCCAGACGTAGGGCGCG

CAGGGCCTTGAACCCAAATACATTACCTACAATGGAAGTAA

ACATGTTAGTAACAGAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAGGGA

TAAGCTACATAAGCAATATATTGATTTTCTTCTCCAGCAACG

GGCTCGATGTTGTAGCATCGTCCTTTGTAACGATCAAGACT

GGTAAGCCCATCGGTCCAAACGGTTGTCCATGTACCAGTAG

AAGATTCGGCAGCTACCGCGGCACCCGCTTCTTCAGGAGGA

ACTCCAGGTTGAGGAGTTACTCGGAATGCGGCCAAGATATC

AGTATCTTTCGTTTCATAGTCAGGAGTATAATAATTCAATTT

ATAATCTTTAACACCAGCTTTGAACCCAACACTTGCTTTAGT

CTCTGTTGGGGGGGAGCCTATA。

上述rbcl序列的在線(xiàn)Blast結(jié)果與GeneBank中滇黔黃檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）rbcl序列的相似度為100%，E值為0。滇黔黃檀rbcl序列GeneBank登陸號(hào)為KM458233.1。近年來(lái)，DNA分子鑒定被廣泛應(yīng)用于中藥材動(dòng)植物基源的鑒定[1-7]，具有較高的專(zhuān)一性和科學(xué)性。陳士林[8]研究得出，GeneBank在線(xiàn)匹配結(jié)果相似性高于95%時(shí)，可判斷為同源。上述樣品的rbcl序列與GeneBank中滇黔黃檀相似度為100%，表明樣品為豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.）。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)與在線(xiàn)Blast結(jié)果匹配時(shí)，除與滇黔黃檀的相似度為100%外，與多裂黃檀和印度黃檀匹配度亦較高，但印度黃檀為喬木，可予排除，鑒于龍肝香（杠香）原植物與多裂黃檀藤本植物形態(tài)差異較大（前者為大藤本，小葉數(shù)目13～25對(duì)，后者為藤本，小葉數(shù)目2～4對(duì)），故結(jié)合植物形態(tài)、香材外觀性狀特征及DNA條形碼特征，可判定龍肝香（杠香）原植物為豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.）。現(xiàn)版《中國(guó)植物志》[9]收載了滇黔黃檀（原變種）（D.yunnanensis Franch.）及其變種高原黃檀（D.yunnanensis var.collettii），經(jīng)黃檀屬植物學(xué)家李世晉等[10]實(shí)地考察證明兩者實(shí)為同一物種在不同生態(tài)環(huán)境下的不同形態(tài)，并將兩者進(jìn)行歸并，統(tǒng)稱(chēng)為滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.），且新的英文版中國(guó)植物志（Flora of China）亦將高原黃檀歸并為滇黔黃檀，故滇黔黃檀不再有原變種后綴說(shuō)明。

滇黔黃檀藥香兩用歷史已久，在多部地方史料中均有記載。其中《西昌中草藥》[11]記載“杠香”為西昌地區(qū)常用中草藥，其基源為蝶形花亞科黃檀屬植物云南黃檀（D.yunnanensis Franch.），說(shuō)明“杠香”早期的原植物名與現(xiàn)今原植物名滇黔黃檀有異，但拉丁學(xué)名一致，因此“杠香”與龍肝香實(shí)為同物異名。

龍肝香（杠香）來(lái)源于豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.）富含樹(shù)脂的木質(zhì)藤莖，為云川貴少數(shù)民族習(xí)用香藥，該研究對(duì)其進(jìn)行的原植物品種鑒定為藥用新資源滇黔黃檀的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

龍肝香（杠香）具有較高的香藥兩用經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景，尤其是其藥用歷史悠久，因此云貴川龍肝香（杠香）作為當(dāng)?shù)叵懔虾臀磥?lái)藥用資源，應(yīng)給予合理的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，其所含的化學(xué)成分及藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)有待今后進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐紅，王崢濤，胡之壁.中藥DNA分子鑒定技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，5（2）：24-30.

[2] 彭雪梅，張衛(wèi)明，王蔓麗，等.羅布麻及其易混品的DNA分子鑒定[J].植物研究，2007，27（3）：302-307.

[3] 石林春，陳俊，向麗，等.基于ITS2條形碼的中藥材天南星及其混偽品DNA分子鑒定[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（12）：2176-2179.

[4] 崔麗娜，杜鶴，張輝，等.基于COI條形碼序列的金錢(qián)白花蛇及其混偽品的DNA分子鑒定[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（2）：424-428.

[5] LIU J，HE T，CHUN Z.DNA molecular identification of Herba Dendrobii and its adulterant species based on ITS sequence analysis[J].China journal of chinese materia medica，2009，34（22）：2853-2856.

[6] FENG S G，JIANG Y，WANG S，et al.Molecular identification of Dendrobium species（Orchidaceae）based on the DNA barcode ITS2 region and its application for phylogenetic study[J].International journal of molecular sciences，2015，16（9）：21975-21988.

[7] 譚麗盈，鄭婕.基于rbcL序列鑒別十大功勞葉及其偽品[J].北方藥學(xué)，2012，9（4）：1-2.

[8] 陳士林.中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列[M].北京：科學(xué)出版社，2015.

[9] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第40卷[M].北京：科學(xué)出版社，1979：112.

[10] 李世晉，張奠湘，吳鴻.中國(guó)黃檀屬植物（豆科）分類(lèi)學(xué)修訂[C]//廣東省植物學(xué)會(huì)第十七期學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.廣州：廣東省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)科技交流部，2008.

[11] 四川省西昌地革委衛(wèi)生局.西昌中草藥[M].西昌：四川省西昌地革委衛(wèi)生局，1972：656.