葡萄品種分子鑒定研究進展及展望

李貝貝　劉崇懷　姜建福

摘要：品種鑒定是葡萄種質(zhì)資源保存、研究、開發(fā)利用以及新品種品種權(quán)保護的重要依據(jù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，出現(xiàn)了多種基于DNA水平的分子標記技術(shù)用于品種鑒定。本文綜述了目前國內(nèi)外幾種主要的分子標記技術(shù)（AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SRAP、SNP、iPBS）在葡萄品種鑒定中的應(yīng)用與研究進展，并闡述了各種標記方法的基本原理和特點，以期為今后葡萄品種鑒定提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：葡萄；分子標記；品種鑒定；研究進展；基本原理；特點

中圖分類號：S663.101 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0015-06

葡萄為葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis L.）植物，是世界范圍內(nèi)栽培最廣泛的樹種之一，目前世界已經(jīng)報道的葡萄品種有6 000～10 000個[1]。在葡萄的生產(chǎn)過程中，優(yōu)良品種是提高葡萄質(zhì)量和種植效益的必要條件，也是其產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要保障，回顧我國葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展歷程，每一個快速發(fā)展時期都伴隨著新品種的引進、選育與推廣，新品種對促進葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展發(fā)揮著越來越重要的作用[2]。

葡萄多為無性繁殖，扦插繁殖容易，不同地區(qū)之間品種交流頻繁，導(dǎo)致其種類和品種繁多，同名異物及同物異名現(xiàn)象嚴重[3]。另外，由于國內(nèi)現(xiàn)階段的種苗市場管理還不完善，部分不法苗木商為了自身利益，導(dǎo)致市場上以劣充優(yōu)、以假亂真現(xiàn)象時有發(fā)生[4]。因此，為了保護育種者的權(quán)益及保證葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，對葡萄品種進行快速、準確可靠的鑒定顯得尤為重要。同時，隨著我國加入世貿(mào)組織和國際植物新品種保護聯(lián)盟后，一個新品種的推廣、產(chǎn)權(quán)保護都必須提供該品種特異的鑒定標記[5]。而傳統(tǒng)的品種鑒定都以形態(tài)學(xué)標記為主，該方法易受環(huán)境及季節(jié)的影響，且鑒定時間長、工作量大。此外，由于新品種選育技術(shù)的同質(zhì)化，品種之間的形態(tài)差異也越來越小，目測區(qū)分植株性狀就顯得越來越困難。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與成熟，使根據(jù)遺傳物質(zhì)DNA在不同生物個體之間的差異來鑒別生物物種成為可能，并且取得了顯著成果。分子標記技術(shù)是一種以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，通過檢測DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長短與排列不一的重復(fù)序列等機制而產(chǎn)生多態(tài)性的技術(shù)[6]，該技術(shù)不受環(huán)境因素及發(fā)育階段的影響，具有快速、簡單、準確、可靠、穩(wěn)定、經(jīng)濟等特點。國際植物品種權(quán)保護聯(lián)盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，簡稱UPOV）也將DNA分子標記鑒定作為農(nóng)作物品種DUS（distinctness uniformity and stability）測試的輔助手段[7]。已經(jīng)發(fā)展起來的分子標記多達60多種，應(yīng)用較廣的主要有AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SRAP、SNP以及iPBS等。目前，DNA分子標記鑒定技術(shù)已在多種作物上開展了廣泛的研究，在葡萄品種的鑒定方面取得了很大的進展，本文對目前國內(nèi)外7種主要的分子標記技術(shù)原理以及在葡萄品種鑒定上的應(yīng)用進展作一綜述，以期為今后葡萄品種鑒定技術(shù)的選擇提供參考依據(jù)。

1國內(nèi)外葡萄品種的鑒定技術(shù)

1.1RAPD技術(shù)

隨機擴增多態(tài)DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分子標記發(fā)展于1990年[8-9]，它是以基因組DNA為模板，利用人工合成的單鏈隨機引物（一般8～10 bp）對其進行PCR擴增，通過凝膠電泳檢測擴增片段，從而得到多態(tài)性標記的一種技術(shù)。RAPD標記簡便、快速、成本低，無須了解基因組序列信息，DNA用量少，基于以上優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定及遺傳關(guān)系分析等方面[10-14]。

1997年，Stavrakakis利用15個RAPD標記鑒別了8個希臘品種，結(jié)果表明，RAPD標記技術(shù)適合用于葡萄品種鑒定[15]。王軍等利用RAPD標記技術(shù)分別分析了中國野生葡萄和鮮食葡萄，認為RAPD標記技術(shù)可有效區(qū)分葡萄種質(zhì)，是一種快速、經(jīng)濟實用的分子標記技術(shù)[16-17]。Bajraktari等以Rahovec的6個主栽品種為材料，利用10對高效的RAPD引物對其進行鑒定分析，鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)檢測的結(jié)果完全一致，6份種質(zhì)均被區(qū)分開，排除了同名異物的存在[18]。2008年，李玉霞等依據(jù)RAPD技術(shù)對蛇龍珠葡萄的來源和親緣關(guān)系進行了分析，認為蛇龍珠可能為法國的嘎赫姆奈赫，而非以前被認為的品麗珠[19]。隨后，2012年李紅娟等利用RAPD分子標記對8個蛇龍珠營養(yǎng)系進行遺傳多樣性分析，并將其與赤霞珠和品麗珠之間的親緣關(guān)系進行驗證，結(jié)果顯示蛇龍珠的5個營養(yǎng)系之間沒有任何差別，其余3個營養(yǎng)系之間卻存在一定的差別，提出了蛇龍珠在遺傳基礎(chǔ)上與品麗珠有一定的差異，應(yīng)屬不同品種[20]。Zhao等用基于RAPD標記的MCID法完成了對葡萄品種的鑒定，該方法對將來葡萄品種鑒定以及新品種權(quán)保護具有重要意義[21-23]。El-Sayed等僅用1對RAPD引物就將Thompson Seedless、Red Roomy、Palomino、Rish Baba、Ruby Seedless、Beauty Seedless、Superior和Flame Seedless等8個葡萄品種區(qū)分開，再次證明了RAPD標記鑒定葡萄品種的可行性[24]。另外，RAPD標記還可用于區(qū)分芽變品種，如張國海成功地應(yīng)用RAPD分子標記鑒定了巨峰及其芽變品種98-2、京亞及其芽變品種洛浦早生[25]。RAPD分子標記以其獨特的優(yōu)勢在20世紀90年代前期得到了廣泛的應(yīng)用，但在實際應(yīng)用中也存在一定的缺陷，其穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，這主要是因為該種標記是顯性標記，不能區(qū)別純合體和雜合體。

1.2AFLP技術(shù)

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）標記是由荷蘭科學(xué)家Zabeau等發(fā)明的一種分子標記技術(shù)[26-27]。其基本原理是利用成對的限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切，酶切片段與人工接頭（與酶切片段含有共同黏末端）連接，并通過引物（引物由接頭，酶切位點和2～3個核苷酸組成）擴增得到大量DNA片段，最后通過聚丙烯酰氨凝膠電泳對擴增片段多態(tài)性進行檢測。AFLP技術(shù)結(jié)合了RFLP與RAPD等2種分子標記技術(shù)的優(yōu)點，既有前者的可靠性，又有后者的靈敏性。endprint

AFLP技術(shù)以其重復(fù)性好、多態(tài)性高、分辨率高等優(yōu)勢常被用于葡萄無性系變異或突變品種的鑒定[28-29]。該技術(shù)可以解決同工酶標記、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)等不能解決的問題。Scott等成功地應(yīng)用AFLP技術(shù)鑒定了火焰無核及其早熟突變體，這也是首次利用AFLP標記成功鑒定突變體[30]。Cervera等利用AFLP分子標記技術(shù)對35個鮮食品種及2個Napoleon無性系變異品種（N10-7、N76-7）進行鑒定，分別使用2個引物組合[2E（+ACC，+ACT）/M+CAT，2E（+ACC，+ACT）/M+CTG]和1個引物組合[2E（+ACC，+ACT）/M+CTT]將鮮食品種和無性系變異品種區(qū)分開，結(jié)果表明，AFLP技術(shù)是鑒定無性系變異品種的一種有效方法[31]。超藤葡萄是藤稔的芽變品種，二者親緣關(guān)系十分接近，鮑露等應(yīng)用傳統(tǒng)的形態(tài)標記以及RAPD分子標記不易將其區(qū)分開，而利用AFLP標記成功地將其區(qū)分開，這突顯了AFLP標記的重復(fù)性強、多態(tài)性豐富的優(yōu)點[32]。2011年，Vlba等采用SSR標記與AFLP標記成功地鑒別開一對同物異名品種（Glianico Nero與Aglianico del Vulture Nero），而早在2001年Costacurta已提出了這樣的猜測，Vlba等對其進行了驗證，認為AFLP是區(qū)分同名異物或同物異名品種的有效方法[33]。無性系篩選是葡萄品種改良的重要方法，近年來育種家在無性系篩選方面也做了很多工作，Manjari Naveen是依據(jù)形態(tài)學(xué)篩選出的一個無核白雞心的無性系變異品種，2013年Shinde等對Manjari Naveen與無核白雞心的DNA進行了AFLP分析，結(jié)果顯示Manjari Naveen與無核白雞心為2個不同的品種[34]。雖然AFLP分子標記穩(wěn)定性好、準確性高、能有效區(qū)分親緣關(guān)系較近的品種，但其對DNA質(zhì)量要求較高，并且操作復(fù)雜、成本較高。

1.3ISSR技術(shù)

簡單重復(fù)間序列（inter simple sequence repeat，ISSR）是基于微衛(wèi)星標記（SSR）發(fā)展而來的一種分子標記，由Zietkiewicz等于1994年提出[35]。[JP2]它是在微衛(wèi)星序列的3′端或5′端錨定2～4個核苷酸，以其為引物對SSR之間的DNA片段進行擴增。ISSR技術(shù)即利用了豐富的SSR序列信息，同時又克服了RFLP技術(shù)的局限性和RAPD的假陽性[36]，以其簡單迅速、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定高效等特點被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性分析以及遺傳圖譜構(gòu)建等方面。[JP]

Argade等以印度的43份無籽葡萄品種（歐亞種）為材料，利用ISSR分子標記方法對其進行鑒定，篩選出的14個多態(tài)性引物能夠準確地將樣本區(qū)分開，其中有3對ISSR引物（UBC857、888和890）能將該42個無籽葡萄品種全部清楚地區(qū)分開[37]。Hassan等依據(jù)表型、ISSR標記對3份埃及葡萄品種進行分析，經(jīng)UPGMA軟件聚類發(fā)現(xiàn)Red Romy與Matrouh親緣關(guān)系較近，與Bez E1-anza較遠，認為ISSR標記適合于葡萄品種鑒定[38]。2014年，Choudhary等用ISSR分子標記技術(shù)，采用10對ISSR引物對Nanasaheb purple、Sonaka、Thompson seedless和Ganesh的遺傳變異進行了分析，再次證明ISSR標記用于葡萄品種鑒定的可行性[39]。錢春等利用ISSR分子標記方法分別鑒定了白香蕉及其芽變品種和巨峰及其芽變株系，結(jié)果表明，ISSR標記能有效用于芽變鑒定[40-41]。李繼洋等對新疆19份葡萄品種的DNA進行了ISSR分析，建立了14個葡萄品種的DNA指紋圖譜，為葡萄品種的快速鑒定奠定了基礎(chǔ)[42]。張永輝等應(yīng)用ISSR技術(shù)分析了81份葡萄品種的遺傳關(guān)系，根據(jù)聚類結(jié)果，將誤定為毛葡萄的毛葡萄1099確定為桑葉葡萄，并確定福建野葡萄和華東葡萄1058屬于同物異名材料[43]。張娜以新疆的137份葡萄種質(zhì)為試驗材料，采用ISSR標記對其遺傳多樣性進行了分析，根據(jù)聚類結(jié)果得知新疆本地葡萄品種并非野生種，而是由歐亞種演變而來的[44]。綜上所述，ISSR技術(shù)適合用于葡萄品種鑒定，但ISSR也存在一定的缺點，即其只是部分共顯性，不能有效區(qū)分檢測位點的純合與雜合。

1.4SRAP技術(shù)

相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）發(fā)展于2001年，由美國加州大學(xué)的Li等提出[45]。其原理是利用設(shè)計的引物對開放閱讀框（open reading frames，ORFs）進行擴增[46]，正向引物對外顯子進行擴增，反向引物對內(nèi)含子和啟動子區(qū)域進行擴增，由于不同物種以及個體間的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列存在很大的變異，從而擴增出多態(tài)性片段。SRAP分子標記技術(shù)具有操作簡單、可靠性好、重復(fù)性好等特點，且優(yōu)于AFLP、ISSR和RAPD，在種質(zhì)資源遺傳多樣性分析以及品種鑒定上得到廣泛應(yīng)用。

苑煒建立了適于葡萄SRAP分析的技術(shù)體系，應(yīng)用SRAP分析標記評價了156份葡萄種質(zhì)的親緣關(guān)系及遺傳多樣性水平[47]。Guo等利用19對SRAP引物區(qū)分開了包括歐亞種、歐美雜種、中國野生種在內(nèi)的76份葡萄種質(zhì)，其中包含洛浦早生與京亞、98-1與緋紅、98-2與巨峰，表明SRAP也可鑒定芽變品種[48]。Liu等以中國野生葡萄為試驗材料，應(yīng)用SRAP技術(shù)對其遺傳多樣性進行了分析，在遺傳相似系數(shù)為0.84處可清楚地區(qū)分開所有品種，聚類結(jié)果也驗證了桑葉葡萄是毛葡萄的亞種[49]。張旭彤等也利用SRAP標記技術(shù)對中國野生葡萄進行了研究，進一步證明了SRAP標記鑒定葡萄品種的可行性[50-53]。但是，SRAP標記也存在一定的限制，其沒有通用的退火溫度，研究者需要對不同植物材料的退火溫度進行摸索，從而延長了SRAP標記的試驗周期，且SRAP是針對ORFs區(qū)域進行擴增，對基因組的擴增范圍有限。endprint

1.5SNP技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分子標記是在1996年由Lander提出的第3代DNA遺傳標記[54]，是指基因組DNA序列上單個堿基的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，這種變異是由單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換所致。SNP標記是用于檢測種內(nèi)個體間遺傳變異的分子單位最小的技術(shù)，穩(wěn)定性好、數(shù)量巨大且分布廣泛，其多樣性是目前所有分子標記中最豐富的一種。目前SNP已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、品種鑒定等方面。

Dong等設(shè)計9對SNP引物成功地區(qū)分開了16個葡萄品種，結(jié)果證實SNP標記可用于葡萄品種鑒定以及遺傳多樣性分析[55]。Riahi等利用73個SNP標記對44份突尼斯葡萄品種的[WTBX][STBX]VvmybA1基因、VvmybA2[WTBZ][STBZ]基因進行分析，研究品種之間的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，結(jié)果分別用27個SNP標記和22個SNP標記區(qū)分開了22份突尼斯栽培種以及22份突尼斯野生種，認為開發(fā)的2套SNP標記對今后的品種鑒定有巨大的幫助[56]。Ghaffari等同樣也以突尼斯葡萄品種為試驗材料，采用SNP分子標記技術(shù)對其中的29份野生種與28份栽培種的親緣關(guān)系進行了分析，結(jié)果表明，突尼斯的野生種并非是當(dāng)?shù)仄贩N，可能來自其他地區(qū)，同時發(fā)現(xiàn)2個錯誤命名品種（Turki與Reine de Vignes）[57]。Cabezas等通過對挑選出的11個樣本進行重測序并獲得了300多個SNP標記，對其進行分析后最終篩選出48個均勻分布于葡萄19條染色體上的具有高分辨率的SNP標記，將其作為葡萄基因分型的一套標準，并利用該標準成功鑒定了來自世界各地的一組葡萄品種，充分證明SNP分子標記技術(shù)的可靠性及穩(wěn)定性[58]。所有這些研究都證實了SNP分子標記可以用于葡萄品種的鑒定。但是用于檢測SNP的DNA芯片設(shè)計成本高，且由于DNA樣品的復(fù)雜性，有些SNP不能被檢測到。

1.6SSR技術(shù)

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）別稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），由Moore等于1991年創(chuàng)立[59]，是一類由1～6個堿基為重復(fù)單元組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。這些簡單重復(fù)序列均勻、隨機、廣泛地分布于真核生物的基因組上，具有豐富的多態(tài)性。其基本原理是根據(jù)SSR兩端的保守互補序列設(shè)計1對特異引物，利用PCR對其進行擴增，因重復(fù)單元的次數(shù)不同，擴增片段長度就產(chǎn)生了差異，從而體現(xiàn)出SSR座位上的多態(tài)性。SSR分子標記具有標記數(shù)量多、多態(tài)性高、信息量高、試驗穩(wěn)定性和重復(fù)性強、操作簡單方便、對DNA質(zhì)量要求低、呈共顯性遺傳等獨特優(yōu)勢，已經(jīng)成為目前分子標記技術(shù)的熱點，在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。

Thomas等相繼在1993、1996、1999年報道了VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD32、VVMD28、VVMD27、VVMD25[60-62]等7個適合葡萄品種鑒定的SSR引物。1999年，Sefc等為了豐富SSR標記多態(tài)性，又開發(fā)了2對SSR引物VrZAG79和VrZAG62[63]。因該9對引物均勻分布于葡萄19條染色體上且具有高的多態(tài)性而被國外視為通用引物，并且法國、意大利、德國、瑞士、美國等國研究者利用該9對引物構(gòu)建了數(shù)據(jù)庫。2006年Kiss等利用SSR分子標記方法構(gòu)建了109個葡萄品種的SSR指紋圖譜，可以方便其他研究者利用該指紋圖譜進行品種鑒定[64]。韓國研究者Cho等利用SSR-PCR標記技術(shù)對30個葡萄品種進行了鑒定，研究表明Jinok與康拜爾早生相似系數(shù)為1，可能為同一品種，同時僅用3對SSR引物（VVIt60、VVIn61、VVIu20）就將剩余的28份種質(zhì)區(qū)分開[65]。Durán等采用SSR技術(shù)從分子水平上分析了阿根廷品種Pedro Giménez和西班牙品種Pedro Ximénez的差異，證明了兩者并非是同一品種，并認為Pedro Giménez是Muscat of Alexandria和Criolla Chica的后代[66]。Jahnke等依據(jù)SSR分子標記技術(shù)完成了砧木品種的分析鑒定[67]。2015年Mihaljevic等以克羅地亞和黑山的284個地方品種為試驗材料，利用9對SSR引物對其進行遺傳多樣性分析，結(jié)果檢測出25個之前未曾報道過的基因型，并將得到的數(shù)據(jù)與歐洲數(shù)據(jù)庫以及其他已報道的相關(guān)研究結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn)了一些新的同名異物和同物異名品種[68]。SSR分子標記還可用于親本鑒定[69]、無性系鑒定[70-71]以及同物異名和同名異物品種的鑒定[72-74]。目前國內(nèi)也開展了SSR標記鑒定葡萄品種的研究，例如樊秀彩等以山葡萄、河岸葡萄以及239株二者的雜交后代為材料，從12對SSR引物中篩選出7對能擴增出父本特異條帶的引物，作為雜種鑒定的標記，利用該7對特異引物對供試材料進行快速鑒定，結(jié)果表明，雜交后代中有161株被確認為真雜種，認為SSR標記可有效地對葡萄屬種間雜種進行鑒定[75]。杜晶晶應(yīng)用9對SSR引物鑒別了80份葡萄種質(zhì)，并構(gòu)建了80份葡萄種質(zhì)的有效分子身份證[76]。李慧等利用SSR標記和IRAP標記對關(guān)口葡萄的親緣關(guān)系進行了分析，結(jié)果表明關(guān)口葡萄屬于歐美雜交種，既不是尼加拉也不是白香蕉[77]。成冰等對13個釀酒白葡萄品種進行了SSR分析與鑒定，研究表明引物VrZAG62和VVIb66都可以將這13個釀酒白葡萄品種區(qū)分開[78]。憲立杰等對取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所葡萄資源圃的45份葡萄種質(zhì)進行了SSR分析，利用19對核心引物擴增出76條帶，其中74條具有多態(tài)性，并利用SSR標記初步建立了一個SSR基因型指紋庫，為鑒定葡萄品種或品系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[79]。郭春苗等以新疆44個適宜制干葡萄品種為試材，從52對引物中篩選出8對多態(tài)性高的引物并對其進行SSR分析，利用4條引物構(gòu)建了品種DNA指紋圖譜，通過統(tǒng)計測驗可將44份葡萄種質(zhì)區(qū)分開來，認為SSR分子標記技術(shù)可準確地鑒定葡萄品種[80]。李雪雁等以75個葡萄栽培品種為材料，選用19對核心SSR引物對其進行研究，建立了一套適合于葡萄DNA指紋圖譜構(gòu)建的技術(shù)體系，為葡萄種質(zhì)資源的鑒定提供了依據(jù)[81]。尹玲等對我國新育成的24份葡萄種質(zhì)進行了SSR分析，結(jié)果表明，所用的6對SSR引物可以明確地區(qū)分開供試葡萄品種，還能正確地鑒定出品種的倍性，并建立了24份葡萄品種的SSR指紋圖譜，為品種鑒定、親緣關(guān)系分析以及植物品種權(quán)保護提供參考依據(jù)[82]。研究者普遍認為，SSR分子標記具有高的多態(tài)性，非常適用于葡萄品種鑒定和DNA指紋圖譜的構(gòu)建。endprint

1.7iPBS技術(shù)

引物結(jié)合位點間擴增（inter primer binding site，iPBS）標記是一種新型、簡單、快速、高效的分子標記方法，該技術(shù)由Kalendar等在2010年建立[83]。它是以長末端重復(fù)序列（long terminal repeats，LTR）類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點設(shè)計引物對該類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中2個引物結(jié)合位點（PBS）區(qū)間進行擴增的一種分子標記技術(shù)，與早期基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標記方法不同，不須要預(yù)先獲知LTR的序列。iPBS標記技術(shù)是葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及鑒定的一種新的技術(shù)手段。近些年，iPBS標記在杏[84]、楊梅[85]、雪蓮果[86]、虎杖[87]、牡丹[88]等植物上都有所研究。

2014年張瀟玉等以巨峰葡萄為試材，iPBS引物2249為擴增引物，對葡萄iPBS-PCR反應(yīng)體系的各個成分以及退火溫度進行優(yōu)化，利用優(yōu)化后的iPBS-PCR反應(yīng)體系對18份葡萄種質(zhì)進行擴增檢測，獲得的條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性高，為葡萄種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性評價提供了重要的技術(shù)支持[89]。Guo等對35份葡萄種質(zhì)進行了iPBS分析，利用15對iPBS引物擴增出99條DNA譜帶，其中86.3%具有多態(tài)性，由軟件UPGMA進行聚類，結(jié)果表明葡萄栽培種和野生種存在明顯的差異，且擁有豐富的遺傳多樣性[90]。iPBS也存在自身的限制，其對模板DNA純度和片段大小要求較高。iPBS作為一種剛發(fā)展起來的新型分子標記，在葡萄品種鑒定上的應(yīng)用剛起步。

2小結(jié)與展望

葡萄品種的鑒定方法從最初的形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)展到同工酶鑒定，再到現(xiàn)在常用的分子標記鑒定，經(jīng)歷了從形態(tài)學(xué)到分子生物學(xué)，從外部到內(nèi)部的過程。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標記及同工酶鑒定易受環(huán)境因素的影響，同時也受不同發(fā)育時期的限制。而分子標記則不存在上述問題，它是從分子的角度展示了不同品種間存在的差異。本文所介紹的幾種DNA分子標記技術(shù)在葡萄品種鑒定應(yīng)用中各有優(yōu)缺點，在鑒定一些不易區(qū)分的親緣關(guān)系較近的品種或芽變品種時，可將幾種分子標記方法相結(jié)合以達到最終目標。DNA分子標記的發(fā)展是永無止境的，今后不僅要加速開發(fā)新型的DNA指紋技術(shù)，還要對現(xiàn)有DNA分子標記技術(shù)加以改進，建立快速鑒定葡萄品種的方法體系，從而實現(xiàn)品種鑒定的簡單化、自動化。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以DNA分子標記為基礎(chǔ)的指紋圖譜構(gòu)建逐漸成為熱點，因其具有準確可靠、簡便快速、易于自動化等優(yōu)點已成為品種鑒定的重要技術(shù)手段。國際植物品種權(quán)保護保護聯(lián)盟（UPOV）在BMT測試指南草案中已經(jīng)將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標記方法確定為SSR和SNP[4]，SSR標記以其獨特的優(yōu)勢，成為當(dāng)前構(gòu)建指紋圖庫以及品種鑒定的首選標記。隨著生物技術(shù)和互聯(lián)網(wǎng)信息技術(shù)的發(fā)展壯大，構(gòu)建品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫和全國統(tǒng)一查詢平臺勢在必行?？梢栽诶眯螒B(tài)學(xué)鑒定品種的同時，通過篩選適合葡萄品種鑒定的核心引物，建立現(xiàn)有葡萄品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，并利用計算機技術(shù)將該指紋數(shù)據(jù)庫與對應(yīng)品種的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合建立一個平臺，從而實現(xiàn)快速鑒定葡萄品種的目的。該平臺的建立可以使試驗數(shù)據(jù)在不同實驗室得到共享，可有效保護葡萄育成品種的知識產(chǎn)權(quán)和育種者的權(quán)益，保證葡萄產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

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