基于生物傳感器的動(dòng)物源性制品中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)新進(jìn)展

馬文娟　姜金融

摘要 動(dòng)物源性制品中抗生素殘留給人類健康和環(huán)境帶來(lái)巨大危害，生物傳感器具有檢測(cè)快、靈敏度高、便攜等優(yōu)勢(shì)，在抗生素殘留檢測(cè)領(lǐng)域有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＶ亟榻B了基于分子識(shí)別元件和轉(zhuǎn)換元件的不同類型生物傳感器以及其在動(dòng)物源性制品中抗生素殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用，納米材料的摻入為新型生物傳感器的開(kāi)發(fā)提供了有效途徑，并展望了未來(lái)的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞 生物傳感器；動(dòng)物源性制品；抗生素殘留；檢測(cè)技術(shù)

中圖分類號(hào) S851.34+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）18-0022-03

Recent Advances of Antibiotic Residues Detection Technology in Animalderived Food Based on Biosensor

MA Wenjuan，JIANG Jinrong （Gansu Institute of Business and Technology Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.， Ltd.，Lanzhou，Gansu 730010）

Abstract Antibiotic residues in animalderived food cause great harm to human health and the environment.Biosensors have the advantages of rapid detection， high sensitivity and portability， and have great potential for development in the field of antibiotic residue detection. The different types of biosensors based on molecular recognition elements and conversion elements and their application in the detection of antibiotic residues in animal origin products had been emphatically introduced. The incorporation of nanomaterials provided an effective way for the development of new biosensors， and future development trends of biosensors were also discussed.

Key words Biosensors；Animalderived food；Antibiotic residues；Detection technology

隨著物質(zhì)消費(fèi)和生活水平的不斷提高，人們對(duì)動(dòng)物源性制品的需求也日益增長(zhǎng)，特別是對(duì)動(dòng)物源性制品的質(zhì)量和安全問(wèn)題尤為關(guān)注?？股乇粡V泛用于動(dòng)物疾病的治療和預(yù)防，甚至被作為飼料添加劑來(lái)提高畜禽的產(chǎn)量，這極大地增加了抗生素在動(dòng)物源性制品中殘留的風(fēng)險(xiǎn)?？股貧埩魰?huì)對(duì)動(dòng)物和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，例如會(huì)造成人體超敏反應(yīng)、產(chǎn)生耐藥性等一系列問(wèn)題[1]。基于這些不利因素，許多國(guó)家專門立法來(lái)保護(hù)消費(fèi)者免受動(dòng)物源性制品中獸藥和抗生素殘留帶來(lái)的危害，并且規(guī)定了最高殘留限量（maximum residue limits，MRLs），將殘留檢測(cè)列入國(guó)家監(jiān)督管理計(jì)劃。

許多學(xué)者致力于研究動(dòng)物源性制品中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)，目前主要常規(guī)方法包括微生物法、免疫學(xué)方法、儀器分析法等。微生物法是基于細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[2-3]；免疫學(xué)方法基于抗原-抗體間特異的識(shí)別[4-5]；儀器分析是目前抗生素殘留定量檢測(cè)的主要手段，包括液相色譜（liquid chromatography，LC）和氣相色譜（gas chromatography，GC）技術(shù)，以及將它們與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析的技術(shù)[6-8]。這些常規(guī)的分析方法一般要涉及到樣品的前處理等步驟，操作費(fèi)時(shí)、繁瑣。隨著新興技術(shù)的不斷發(fā)展，生物傳感器被應(yīng)用于食品中抗生素殘留的檢測(cè)及其他領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。基于某種特異性反應(yīng)的生物傳感器主要由生物分子識(shí)別元件和轉(zhuǎn)換元件組成，可以識(shí)別目標(biāo)分析物并轉(zhuǎn)化為光電信號(hào)[9]。生物傳感器用于動(dòng)物源性制品中抗生素殘留的檢測(cè)，在保持了特異性強(qiáng)、靈敏度高優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，簡(jiǎn)化了分析過(guò)程，并且傳感器體積小，便于攜帶，可滿足實(shí)時(shí)檢測(cè)的新要求。筆者著重介紹了基于分子識(shí)別元件和轉(zhuǎn)換元件的不同類型生物傳感器及其在動(dòng)物源性制品中抗生素殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用。

1 基于不同分子識(shí)別元件的生物傳感器

生物受體是具有生物化學(xué)識(shí)別機(jī)制的有機(jī)分子物質(zhì)（如抗體、酶、蛋白質(zhì)或核酸）或生物體系（如細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體）[10]。生物傳感器以這些受體作為分子識(shí)別元件，與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)。根據(jù)生物傳感器中分子識(shí)別元件的不同可分為酶?jìng)鞲衅鳌⒚庖邆鞲衅?、?xì)胞傳感器、分子印跡聚合物傳感器和適體傳感器5類。不同類型生物受體傳感器的優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

1.1 酶?jìng)鞲衅?/p>

在酶?jìng)鞲衅髦忻钢饕蛔鳛楣δ苄詷?biāo)記物，其識(shí)別抗生素物質(zhì)的原理主要基于2種檢驗(yàn)機(jī)制，第1種機(jī)制是對(duì)目標(biāo)分析物的催化轉(zhuǎn)化，第2種機(jī)制是對(duì)可抑制酶活性的分析物進(jìn)行檢測(cè)。酶?jìng)鞲衅骼锰禺愋缘拿竵?lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的捕獲和催化，然后用換能器進(jìn)行直接測(cè)定。目前，酶?jìng)鞲衅髟诳股貧埩魴z測(cè)方面的應(yīng)用較少。Kiran 等[11]將青霉素酶固定在pH電極上開(kāi)發(fā)了一種用于青霉素檢測(cè)的傳感器，該傳感器濃度響應(yīng)范圍為10-10～10-4mol/L，初始響應(yīng)時(shí)間為20～30 s。

1.2 免疫傳感器

免疫傳感器是利用抗體與抗原間的特異性識(shí)別功能而研制的生物傳感器，抗體通常被固定于檢測(cè)器表面，抗體的類型可以是多克隆、單克隆或取決于它們的選擇特性及合成方式。目前，抗體作為生物傳感器的主要受體已經(jīng)在分析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，特別是動(dòng)物源性制品中抗生素殘留檢測(cè)。Tochi等[12]利用碳二亞胺活性酯法合成恩氟沙星（ENFX），接種雄性小鼠產(chǎn)生ENFX單克隆抗體，該抗體對(duì)ENFX具有高靈敏性和特異性，最低檢測(cè)量達(dá)0.028 ng/mL。Pinacho等[13]利用電磁免疫傳感器檢測(cè)牛奶中氟喹諾酮類抗生素，將可識(shí)別氟喹諾酮類抗生素的半抗原酶與磁珠結(jié)合，可直接對(duì)樣品進(jìn)行定量測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）通常側(cè)重于檢測(cè)單個(gè)分析物，Jiang 等[14]通過(guò)雙比色酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法同時(shí)對(duì)牛奶中13種氟喹諾酮類和22種磺酰胺類抗生素殘留進(jìn)行測(cè)定，且檢出限分別達(dá)2.4和5.8 ng/mL，該方法為高通量檢測(cè)多種抗生素提供了有效途徑。

1.3 細(xì)胞傳感器

細(xì)胞傳感器以活細(xì)胞作為分子識(shí)別元件。一些含有由啟動(dòng)子誘導(dǎo)的報(bào)告基因的單細(xì)胞微生物被用于全細(xì)胞生物傳感器的開(kāi)發(fā)，在目標(biāo)分析物存在的情況下，誘導(dǎo)基因被激活從而導(dǎo)致報(bào)道基因表達(dá)或抑制，這一過(guò)程可轉(zhuǎn)化為光信號(hào)被測(cè)量，基于光學(xué)檢測(cè)的微生物細(xì)胞傳感器可同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測(cè)[15-16]，這也是一種利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的微生物細(xì)胞用于抗生素殘留檢測(cè)的新型傳感器[17]，全細(xì)胞生物傳感器可分為組成型和誘導(dǎo)型[18]。Cheng等[19]構(gòu)建了一個(gè)含有質(zhì)粒pRecAlux3的轉(zhuǎn)基因菌種pK12，其響應(yīng)目標(biāo)分析物的機(jī)理是基于誘導(dǎo)存在于質(zhì)粒pRecAlux3上的recA啟動(dòng)子融合的熒光素酶報(bào)告基因，該傳感器可檢測(cè)二氟沙星、恩氟沙星、環(huán)丙沙星等11種氟喹諾酮類抗生素，可應(yīng)用于多種動(dòng)物源性制品的檢測(cè)。

1.4 分子印跡聚合物傳感器

分子印跡聚合物傳感器是以一些天然化合物或合成化合物模擬的生物體系作為分子識(shí)別元件，分子印跡聚合物敏感材料與近年來(lái)研究較熱的生物敏感材料相比，具有耐高溫、高壓、酸、堿和有機(jī)溶劑，不易被降解破壞，可重復(fù)使用，易于保存等優(yōu)點(diǎn)[20]。Karaseva等[21]以納米顆粒分子印跡聚合物（NMIP）作為分子識(shí)別元件用于檢測(cè)青霉素，通過(guò)沉淀聚合的方式獲得NMIP，并在壓電傳感器的表面形成受體層。Luo等[22]則以納米分子印跡聚合物（MIP）為分子識(shí)別元件開(kāi)發(fā)了表面等離子體共振（SPR）傳感器， MIP-SPR傳感器對(duì)環(huán)丙沙星具有高選擇性、高靈敏度和良好的穩(wěn)定性。

1.5 適體傳感器

適體是經(jīng)體外篩選技術(shù)篩選出的能特異性結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段（RNA或單鏈DNA），適體與分析物靶分子的結(jié)合方式與抗原-抗體作用機(jī)理相似，與免疫傳感器相比，適體具有靶分子范圍廣、與配體作用親和力高、特異性強(qiáng)、高度穩(wěn)定性、制備方法簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)[23]。近年來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種類型的適體傳感器對(duì)動(dòng)物源性制品中的抗生素殘留物進(jìn)行檢測(cè)，如氯霉素[24-25]、卡那霉素[26]、達(dá)氟沙星[27]等。仿生生物傳感器與傳統(tǒng)受體生物傳感器相比具有體外制備的優(yōu)點(diǎn)，分子印跡聚合物和適體傳感器的商業(yè)化正處于起步階段，未來(lái)有很好的應(yīng)用前景。

2 基于不同轉(zhuǎn)換元件的生物傳感器

2.1 電化學(xué)生物傳感器

對(duì)于電化學(xué)生物傳感器的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究已近60年，由于其應(yīng)用范圍廣，易商業(yè)化，未來(lái)還有很大的發(fā)展?jié)摿Αｋ娀瘜W(xué)生物傳感器的工作原理是固定化的生物分子與分析物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生或消耗電子，這種化學(xué)反應(yīng)信息可被電位計(jì)、電流計(jì)或阻抗傳感器轉(zhuǎn)換成可測(cè)量分析的電信號(hào)[28]。近年來(lái)，以適體為分子識(shí)別元件的電化學(xué)生物傳感器在動(dòng)物源性食品抗生素殘留檢測(cè)方面得到了廣泛應(yīng)用[29-30]。納米材料的引入使得電化學(xué)生物傳感器響應(yīng)速度更快，靈敏度更高。Qin等[31]以石墨烯和納米合金為傳感材料，制備了一種用于定量檢測(cè)卡那霉素的超敏電化學(xué)適體傳感器，在最優(yōu)系統(tǒng)條件下具有廣泛的線性范圍（5×10-7～5×10-2 μg/mL）、較低的檢測(cè)限（4.2×10-7μg/mL）。

2.2 質(zhì)量感應(yīng)生物傳感器

質(zhì)量感應(yīng)生物傳感器可以響應(yīng)單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)的溶質(zhì)質(zhì)量，其質(zhì)量敏感元件一般基于壓電材料和表面聲波技術(shù)。壓電效應(yīng)是某些壓電材料（如晶體、陶瓷、高分子材料等）中的電荷對(duì)加載壓力的響應(yīng)，其中應(yīng)用較多的是石英晶體微天平，一種可將不易測(cè)得的生化信號(hào)轉(zhuǎn)化為頻率信號(hào)的超敏質(zhì)量傳感器（ng級(jí)）[32]。Ebarvia等[33]開(kāi)發(fā)了一種基于MIP生物識(shí)別的QCM生物傳感器，該傳感器可以在低于MRPL的濃度下檢測(cè)豬肉、牛奶、蜂蜜和蝦中的氯霉素。表面聲波傳感器根據(jù)不同的波型分類，主要包括瑞利波、樂(lè)甫波等[34]。Gruhl等[35]首次將表面聲波（SAW）生物傳感器用于牛奶中青霉素G的快速無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。

2.3 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器以被測(cè)物質(zhì)與生物受體發(fā)生反應(yīng)所引發(fā)的光信號(hào)為檢測(cè)基礎(chǔ)，根據(jù)光學(xué)原理的不同可分為時(shí)間分辨熒光分析（TR-FIA）、表面等離子共振（SPR）、流式細(xì)胞免疫分析（FCIA）、 化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）等。Zhou等[36] 采用時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)檢測(cè)蜂蜜、蝦、雞肉等食品中氯霉素的殘留情況，檢測(cè)范圍為0.008～100.000 μg/L。Pan等[37]開(kāi)發(fā)的SPR芯片可檢測(cè)常見(jiàn)動(dòng)物源性食品中4種磺胺類抗生素，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，每個(gè)檢測(cè)周期可以在5 min內(nèi)完成。Evidence investigator system是基于化學(xué)發(fā)光免疫分析開(kāi)發(fā)的生物芯片，目前已商業(yè)化，可對(duì)肉制品中喹諾酮類、頭孢噻呋、甲砜霉素、鏈霉素、泰樂(lè)菌素和四環(huán)素6類抗生素進(jìn)行檢測(cè)[38]。

3 基于納米材料的生物傳感器

納米材料的摻入可以增加響應(yīng)速度、選擇性和靈敏度，許多納米材料如金屬納米材料、二氧化硅納米顆粒、碳納米材料等已用于生物傳感器的構(gòu)建[39]。近年來(lái)，學(xué)者們基于納米材料開(kāi)發(fā)了熒光生物傳感器、比色生物傳感器、表面等離子體共振生物傳感器等應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的檢測(cè)，為生物傳感器的小型化和抗生素殘留檢測(cè)的快速化提供了有效途徑。Ramezani等[40]設(shè)計(jì)了納米金顆粒（AuNPs）和FAM標(biāo)記的熒光適體傳感器，用于檢測(cè)牛奶和血清中的氨基糖苷類抗生素，對(duì)卡那霉素和慶大霉素具有高選擇性，其中對(duì)卡那霉素的檢測(cè)限（LOD）低至3.21×10-4 μmol/L。Sari等[41]結(jié)合微乳液聚合、分子印跡和SPR技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種基于分子印跡納米顆?？焖贆z測(cè)紅霉素的SPR生物傳感器，線性范圍和檢測(cè)限分別為0.99（R2）和0.29 μg/mL。然而，與其他傳感器的應(yīng)用相比，生物傳感器在抗生素殘留檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用還處于相對(duì)不成熟的階段，許多技術(shù)障礙需要解決，包括納米材料與生物識(shí)別分子的相容性、非均質(zhì)納米材料對(duì)傳感器性能的影響，以及納米分子、生物識(shí)別分子和抗生素分子間的交叉干擾等問(wèn)題。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年

4 展望

與傳統(tǒng)方法相比，生物傳感器無(wú)需樣品前處理，具有檢測(cè)快、成本低、便攜的優(yōu)點(diǎn)，分子識(shí)別元件、轉(zhuǎn)換元件、納米技術(shù)依然是未來(lái)生物傳感器發(fā)展的主要方向。動(dòng)物源性制品中抗生素殘留給人類健康和環(huán)境帶來(lái)巨大威脅，實(shí)現(xiàn)抗生素殘留高通量、實(shí)時(shí)快速檢測(cè)是未來(lái)生物傳感器發(fā)展的新要求。到目前為止，大多數(shù)新型傳感器的應(yīng)用僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，因此，開(kāi)發(fā)出能夠?qū)崿F(xiàn)快速生產(chǎn)高質(zhì)量且成本相對(duì)較低的生物傳感器技術(shù)是亟待解決的創(chuàng)新課題，這種技術(shù)是任何生物傳感器成功商業(yè)化應(yīng)用的先決條件。今后的工作重點(diǎn)應(yīng)放在開(kāi)發(fā)多功能納米材料、強(qiáng)化納米材料與分子識(shí)別元件及轉(zhuǎn)換元件間的應(yīng)用兼容性，使抗生素生物傳感器更加完善，未來(lái)在抗生素殘留檢測(cè)方面發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1]

PLETINCKX L J，VERHEGGHE M，CROMB F，et al.Evidence of possible methicillinresistant Staphylococcus aureus ST398 spread between pigs and other animals and people residing on the same farm[J].Preventive veterinary medicine， 2013， 109（3/4）：293-303.

[2] BOGAERTS R，DEGROODT J M，DE VOS D.The microbiological assay of chloramphenicol hemisuccinate and application of the method with pyrrolidinomethyltetracycline （rolitetracycline）（author′s transl）[J].Annales pharmaceutiques francaises，1982，40（1）：37-41.

[3] TUMINI M，NAGEL O，MOLINA M P，et al.Microbiological assay with Bacillus licheniformis for the easy detection of quinolones in milk[J].International dairy journal，2017，64： 9-13.

[4] JESTER E L E，ABRAHAM A，WANG Y S，et al.Performance evaluation of commercial ELISA kits for screening of furazolidone and furaltadone residues in fish[J].Food chemistry，2013，145：593-598.

[5] MI T J，WANG Z H，EREMIN S A，et al.Simultaneous determination of multiple （fluoro） quinolone antibiotics in food samples by a onestep fluorescence polarization immunoassay[J].Journal of agricultural and food chemistry，2013， 61（39）：9347-9355.

[6] SAJID M，NA N，SAFDAR M，et al.Rapid trace level determination of sulfonamide residues in honey with online extraction using short C18 column by highperformance liquid chromatography with fluorescence detection[J].Journal of chromatography A， 2013，1314：173-179.

[7] TAO Y F，ZHU F W，CHEN D M，et al.Evaluation of matrix solidphase dispersion （MSPD） extraction for multifenicols determination in shrimp and fish by liquid chromatographyelectrospray ionisation tandem mass spectrometry[J].Food chemistry，2014，150：500-506.

[8] CHUGHTAI M I，MAQBOOL U，IQBAL M，et al.Development of inhouse ELISA for detection of chloramphenicol in bovine milk with subsequent confirmatory analysis by LCMS/MS[J].Journal of environmental science and health：Part B，2017，52（12）：871-879.

[9] VELUSAMY V，ARSHAK K，KOROSTYNSKA O，et al.An overview of foodborne pathogen detection：In the perspective of biosensors[J].Biotechnology advances，2010，28（2）： 232-254.

[10] SUN K，CHANG Y，ZHOU B B，et al.Gold nanoparticlesbased electrochemical method for the detection of protein kinase with a peptidelike inhibitor as the bioreceptor[J].International journal of nanomedicine，2017，12：1905-1915.

[11] KIRAN B R，KALE K U.Transformed E. coli JM109 as a biosensor for penicillin[J]. Indian journal of pharmaceutical sciences，2002，64（3）：205.

[12] TOCHI B N，KHAEMBA G，ISANGA J，et al.Monoclonal antibody for the development of specific immunoassays to detect Enrofloxacin in foods of animal origin[J].Food and agricultural immunology，2016，27（4）：435-448.

[13] PINACHO D G，SNCHEZBAEZA F，PIVIDORI M I，et al.Electrochemical detection of fluoroquinolone antibiotics in milk using a magneto immunosensor[J].Sensors， 2014，14（9）：15965-15980.

[14] JIANG W X，WANG Z H，BEIER R C，et al.Simultaneous determination of 13 fluoroquinolone and 22 sulfonamide residues in milk by a dualcolorimetric enzymelinked immunosorbent assay[J].Analytical chemistry，2013，85（4）：1995-1999.

[15] BIANCO S，PITELLI R A，BIANCO M S.Estimativa da área foliar de Brachiaria plantaginea usando dimenses lineares do limbo foliar[J].Planta daninha，2005，23（4）： 597-601.

[16] HANSEN L H，SRENSEN S J.The use of wholecell biosensors to detect and quantify compounds or conditions affecting biological systems[J].Microbial ecology， 2001，42（4）：483-494.

[17] MICHELINI E，CEVENINI L，CALABRETTA M M，et al.Fielddeployable wholecell bioluminescent biosensors：So near and yet so far[J].Analytical and bioanalytical chemistry，2013，405（19）：6155-6163.

[18] TING C，CHENG G Y，AHMED S，et al.New methodologies in screening of antibiotic residues in animalderived foods：Biosensors[J].Talanta，2017，175：435-442.

[19] CHENG G Y，DONG X B，WANG Y L，et al.Development of a novel genetically modified bioluminescentbacteriabased assay for detection of fluoroquinolones in animalderived foods[J].Analytical and bioanalytical chemistry，2014，406（30）： 7899-7910.

[20] BRGGEMANN O，HAUPT K，YE L，et al.New configurations and applications of molecularly imprinted polymers[J].Journal of chromatography A，2000，889（1/2）：15-24.

[21] KARASEVA N，ERMOLAEVA T，MIZAIKOFF B.Piezoelectric sensors using molecularly imprinted nanospheres for the detection of antibiotics[J].Sensors and actuators B：Chemical，2016，225：199-208.

[22] LUO Q H，YU N，SHI C F，et al.Surface plasmon resonance sensor for antibiotics detection based on photoinitiated polymerization molecularly imprinted array[J]. Talanta，2016，161：797-803.

[23] 徐敦明，吳敏，鄒遠(yuǎn)，等.核酸適體技術(shù)在食品安全分析中的應(yīng)用[J].分析化學(xué)，2011，39（6）：925-933.

[24] MEHTA J，VAN DORST B，ROUAHMARTIN E，et al.In vitro selection and characterization of DNA aptamers recognizing chloramphenicol[J].Journal of biotechnology，2011，155（4）：361-369.

[25] DUAN Y，WANG L H，GAO Z Q，et al An aptamerbased effective method for highly sensitive detection of chloramphenicol residues in animalsourced food using realtime fluorescent quantitative PCR[J].Talanta，2017，165：671-676.