基于溫度的酶注射式葡萄糖生物傳感器檢測(cè)方法研究

高學(xué)金+李嬌+呂昕雨+王普

摘 要 針對(duì)酶注射式葡萄糖生物傳感器在實(shí)際使用中因?yàn)闃?biāo)定液與被測(cè)液的溫度不同而引起的測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確問(wèn)題，提出一種基于溫度的葡萄糖濃度檢測(cè)方法。首先根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)建立目前酶注射式葡萄糖生物傳感器濃度檢測(cè)模型，之后利用阿倫尼烏斯公式建立溫度與濃度檢測(cè)動(dòng)力學(xué)模型中未知參數(shù)之間的關(guān)系，并將此關(guān)系代入濃度檢測(cè)動(dòng)力學(xué)模型中， 以建立基于溫度的濃度檢測(cè)新模型。此模型以溫度與酶促反應(yīng)的電流初始斜率為輸入值，以被測(cè)葡萄糖濃度為輸出值，利用此模型提出了以反應(yīng)混合液的溫度和反應(yīng)初始電流斜率推導(dǎo)被測(cè)液濃度的檢測(cè)方法。利用改進(jìn)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，不僅能夠降低溫差的影響，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，還可以省略常規(guī)檢測(cè)中的人工標(biāo)定，避免人工標(biāo)定所需的取樣探頭拆卸步驟，更加有利于在線使用。分別在25.0， 30.0和42.0℃下檢測(cè)1.5 mg/mL和2.5 mg/mL葡萄糖溶液，利用原檢測(cè)方法與基于溫度的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，基于溫度的檢測(cè)方法回收率均在95.0%以上，明顯優(yōu)于原檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞 溫度； 葡萄糖； 生物傳感器

1 引 言

在發(fā)酵業(yè)中，葡萄糖作為發(fā)酵液的主要碳源，其用量直接影響產(chǎn)品質(zhì)量，所以對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖濃度的檢測(cè)是十分必要的[1]。酶類(lèi)生物傳感器的諸多優(yōu)點(diǎn)使其廣泛應(yīng)用于發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度的檢測(cè)。葡萄糖生物傳感器多為固定化酶電極[2～4]，由于發(fā)酵工藝的高溫蒸汽滅菌過(guò)程使固定化酶生物傳感器無(wú)法在線使用。本研究組在前期研究中提出了一種用“酶液”代替固定態(tài)“酶膜”的方法，并研制出采用酶注射結(jié)構(gòu)的葡萄糖生物傳感器，可基本滿(mǎn)足實(shí)際需求，但是還存在檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題[5，6]。2015年，本研究組對(duì)此類(lèi)生物傳感器進(jìn)行機(jī)理建模，建立了酶注射式葡萄糖生物傳感器的機(jī)理模型，此模型表述了整個(gè)反應(yīng)的機(jī)理，同時(shí)也對(duì)檢測(cè)方法提供了機(jī)理模型[7]，為改進(jìn)檢測(cè)算法、降低檢測(cè)時(shí)間提供了理論基礎(chǔ)。

酶注射式生物傳感器主要針對(duì)發(fā)酵領(lǐng)域中葡萄糖濃度的檢測(cè)，其檢測(cè)步驟為：首先利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行標(biāo)定，再對(duì)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度進(jìn)行檢測(cè)。但是生物傳感器易受溫度影響[8～10]，在實(shí)際測(cè)量時(shí)，由于發(fā)酵液的溫度是變化的，且通常與室溫狀態(tài)下的標(biāo)定液溫度不同，導(dǎo)致標(biāo)定結(jié)果不準(zhǔn)確，從而使測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生誤差。而且每次測(cè)量都需要標(biāo)定，不僅操作繁瑣，而且也不利于實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)。

本研究主要針對(duì)酶注射式葡萄糖生物傳感器在實(shí)際使用中因?yàn)闃?biāo)定液與被測(cè)液的溫度不同而引起的測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確問(wèn)題，利用熱力學(xué)與酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提出一種新的檢測(cè)方法。首先利用動(dòng)力學(xué)建立酶注射式葡萄糖生物傳感器濃度檢測(cè)機(jī)理模型，再利用阿倫尼烏斯公式建立溫度與動(dòng)力學(xué)模型中未知參數(shù)之間的關(guān)系，并將此關(guān)系代入該模型中建立基于溫度的濃度檢測(cè)新模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)據(jù)擬合確定了基于溫度的濃度檢測(cè)模型中的參數(shù)值，得到檢測(cè)新模型。利用新模型提出了一種以反應(yīng)混合液的溫度和反應(yīng)初始電流斜率推導(dǎo)葡萄糖濃度的檢測(cè)方法。分別利用動(dòng)力學(xué)模型檢測(cè)方法與溫度模型檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果表明，基于溫度的檢測(cè)方法在溫度變化的情況下具有更好的穩(wěn)定性，檢測(cè)準(zhǔn)確性也優(yōu)于原檢測(cè)方法，同時(shí)改進(jìn)后的檢測(cè)方法避免每次測(cè)量前人工標(biāo)定所需的拆卸步驟，更加有利于在線使用。

2 濃度檢測(cè)動(dòng)力學(xué)模型建立

酶注射式生物傳感器[5]反應(yīng)池中發(fā)生酶促反應(yīng)，由米氏方程可知，葡萄糖發(fā)生酶促反應(yīng)時(shí)，首先生成中間絡(luò)合物，中間產(chǎn)物分解產(chǎn)生H2O2，H2O2在鉑電極處分解產(chǎn)生電子，其反應(yīng)機(jī)理：

E+Sk1k

該機(jī)理模型中，指數(shù)部分存在的原因是由于在反應(yīng)初始中間絡(luò)合物的逐漸形成而引起的； 但根據(jù)米氏方程，底物與酶發(fā)生反應(yīng)生成中間絡(luò)合物的可逆反應(yīng)會(huì)瞬間達(dá)到平衡，短時(shí)間內(nèi)絡(luò)合物濃度保持不變，使得H2O2的濃度增加速率是不變的，所以可省略指數(shù)部分。H2O2生成速率以線性形式增長(zhǎng)，而電子由H2O2分解得到，即電流可表示為I=neD PEFP，其中， ne為反應(yīng)過(guò)程中交換電子數(shù)， D PE為H2O2擴(kuò)散系數(shù)， F為法拉第常數(shù)[7]。故可知其電流變化初始斜率為：

本研究組前期工作中建立的酶注射式葡萄糖生物傳感器檢測(cè)方法基于公式（3）所得，稱(chēng)為動(dòng)力學(xué)模型檢測(cè)方法：首先利用酶注射式葡萄糖生物傳感器得到已知葡萄糖濃度為[S1]、[S2]的兩種標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)電流初始斜率K1、K2，并利用公式（3）確定濃度檢測(cè)動(dòng)力學(xué)模型中的參數(shù)C和Km； 測(cè)量待測(cè)液，得到反應(yīng)過(guò)程中電流的初始斜率K； 最后將已標(biāo)定的參數(shù)C、Km以及初始斜率K代入公式（3），得到待測(cè)液的葡萄糖濃度[S]。簡(jiǎn)單概括為：首先利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定葡萄糖生物傳感器濃度檢測(cè)動(dòng)力學(xué)模型中的參數(shù)C和Km，之后利用已知模型進(jìn)行待測(cè)液的檢測(cè)。

在實(shí)際使用中，標(biāo)準(zhǔn)液處于室溫狀態(tài)，與發(fā)酵液溫度之間存在溫差。而參數(shù)C和Km中存在反應(yīng)速率k1，k

1，k2，所以C和Km會(huì)受溫度的影響。這樣就導(dǎo)致了在存在溫差的情況下，室溫狀態(tài)下標(biāo)定的參數(shù)C和Km并不能用于待測(cè)液的檢測(cè)。本研究利用溫度改進(jìn)檢測(cè)方法，消除了溫度對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。

3 基于溫度的濃度檢測(cè)模型研究

3.1 基于溫度的濃度檢測(cè)模型

式中a、b、lna′， lnb′均為定值，未知量為溫度T以及反應(yīng)初始電流斜率K?；诖四Ｐ?，得到改進(jìn)后檢測(cè)方法，稱(chēng)為溫度模型檢測(cè)方法：生物傳感器對(duì)待測(cè)液葡萄糖濃度進(jìn)行檢測(cè)，得到反應(yīng)的初始電流斜率K′； 與此同時(shí)，通過(guò)反應(yīng)池中的溫度傳感器得到混合液的溫度T′； 之后利用公式（6）將得到的初始斜率K′與T′同時(shí)代入，以得到被測(cè)葡萄糖濃度[S′]。

3.2 基于溫度的濃度檢測(cè)模型參數(shù)測(cè)定

3.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為確定公式（6）中的參數(shù)a、b、lna′、lnb′，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)原理：利用公式（4）、（5）可以分別得到C和Km與溫度T的另一種關(guān)系表達(dá)式： lnC=b′T+lna′、lnKm=bT+lna。由此可知， lnC與lnKm分別與1T成比例關(guān)系。首先在不同溫度下利用酶注射式葡萄糖生物傳感器得到不同葡萄糖糖濃度的反應(yīng)初始斜率； 再利用公式（3）得到不同溫度下的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)C和Km； 分別對(duì)lnC＼，lnKm與1T進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，最終得到a、b、lna′＼，lnb′的值。

3.2.2 儀器與試劑 酶注射式葡萄糖生物傳感器（自制）； 金屬浴加熱器（一恒 TU.100C）； 不同濃度葡萄糖溶液（分析滴定用標(biāo)準(zhǔn)溶液）； 葡萄糖氧化酶（Solarbio）； 緩沖液（山東省科學(xué)院生物研究所）。

3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)北京某發(fā)酵廠數(shù)據(jù)可知，一般發(fā)酵液溫度約為30℃，其中個(gè)別發(fā)酵過(guò)程因工藝要求會(huì)出現(xiàn)溫度略高于40℃的情況。為了盡可能包含實(shí)際生產(chǎn)中多種發(fā)酵工藝的不同溫度要求，本實(shí)驗(yàn)分別在25.0， 30.0， 35.0和40.0℃下利用酶注射式生物傳感器得到葡萄糖濃度為1.5， 2.5和3.0 mg/mL的反應(yīng)初始斜率： 首先利用金屬浴加熱器加熱葡萄糖溶液、葡萄糖氧化酶溶液以及緩沖液到設(shè)定的溫度，以此模擬實(shí)際反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)池中的溫度，利用酶注射式葡萄糖生物傳感器進(jìn)行反應(yīng)過(guò)程中初始斜率的測(cè)量。

3.2.4 模型參數(shù)的測(cè)定 表1為在不同的溫度條件下由酶注射式葡萄糖生物傳感器測(cè)得的不同濃度的葡萄糖溶液的反應(yīng)斜率。從表1可知，在溫度與葡萄糖溶液濃度不變的情況下，生物傳感器得到的斜率不同，這是由于酶促反應(yīng)產(chǎn)生的電流為nA級(jí)別，易受干擾，三電極電路及放大濾波電路設(shè)計(jì)不合理造成傳感器穩(wěn)定性差，此處通過(guò)多次測(cè)量的方式使其相對(duì)偏差在3%內(nèi)，以保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

根據(jù)公式（3）推導(dǎo)可得到1[S]=CKm×1K×1Km，利用此方程進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合得到不同溫度下動(dòng)力學(xué)參數(shù)力學(xué)參數(shù)C（nA/S）與Km （mg/mL）的值，見(jiàn)表2。

4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

4.1 系統(tǒng)檢測(cè)流程圖

別泵入到定量環(huán)中進(jìn)行定量，之后利用緩沖液將其壓入反應(yīng)池中進(jìn)行反應(yīng)，三電極檢測(cè)電路檢測(cè)其反應(yīng)初始電流斜率，同時(shí)溫度傳感器檢測(cè)反應(yīng)池中混合液的溫度，最后將得到的兩參數(shù)傳遞給上位機(jī)進(jìn)行濃度的計(jì)算與顯示。

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

利用酶注射式葡萄糖生物傳感器測(cè)量濃度為1.5和2.5 mg/mL葡萄糖溶液，得到斜率，并分別用溫度模型檢測(cè)方法和動(dòng)力學(xué)模型檢測(cè)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（表3），得到檢測(cè)結(jié)果的回收率，回收率表示測(cè)量值與真值的接近程度，其計(jì)算公式為：P=1-|yi-y|y×100%， 式中，P為回收率， yi為測(cè)量得到的葡萄糖濃度值， y為實(shí)際葡萄糖濃度值。

用動(dòng)力學(xué)模型檢測(cè)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，系統(tǒng)在室溫下進(jìn)行標(biāo)定，隨著反應(yīng)時(shí)混合液的溫度與標(biāo)定時(shí)的溫差增大，測(cè)量結(jié)果的回收率逐漸降低； 而用溫度模型檢測(cè)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其回收率檢測(cè)結(jié)果會(huì)維持在一定范圍內(nèi)，不會(huì)隨著溫度的改變而變化，這是由于每次檢測(cè)都會(huì)根據(jù)溫度重新計(jì)算濃度檢測(cè)動(dòng)

力學(xué)模型中的C和Km，降低了溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。說(shuō)明溫度模型檢測(cè)方法減小了由溫度變化而引起的誤差，提高了實(shí)際測(cè)量中測(cè)量結(jié)果的回收率，同時(shí)減少溫度影響，也增強(qiáng)了其穩(wěn)定性。

驗(yàn)證結(jié)果表明，當(dāng)溫度改變時(shí)，溫度模型檢測(cè)方法能較好地維持其檢測(cè)結(jié)果的回收率，而動(dòng)力學(xué)模型檢測(cè)方法由于標(biāo)定液與待測(cè)液溫度不同使得檢測(cè)的精確度受到嚴(yán)重影響，說(shuō)明溫度模型檢測(cè)方法能更好地消除溫度引進(jìn)的誤差，使得測(cè)量結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

5 結(jié) 論

針對(duì)應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中的酶注射式葡萄糖生物傳感器在實(shí)際使用時(shí)，標(biāo)定液與待測(cè)液溫度不同而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題，以及為簡(jiǎn)化反復(fù)標(biāo)定的繁瑣步驟，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)利用Arrhenius equation建立了溫度與原濃度檢測(cè)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的關(guān)系，并利用此關(guān)系改進(jìn)了目前已有的檢測(cè)方法，避免了在發(fā)酵領(lǐng)域使用時(shí)溫度引起的誤差，同時(shí)省略標(biāo)定部分，更加有利于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵工業(yè)中的自動(dòng)化控制。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可得到，基于溫度模型的檢測(cè)方法能減小溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果引起的誤差，同時(shí)也增強(qiáng)了此傳感器的穩(wěn)定性，能更好地提升傳感器的性能。將改進(jìn)后的傳感器直接與發(fā)酵工業(yè)中的發(fā)酵罐相連，獨(dú)特的酶注射式結(jié)構(gòu)使得可以忽略高溫滅菌引起的酶失活問(wèn)題，同時(shí)，利用新的檢測(cè)方法，更有利于在線檢測(cè)、控制補(bǔ)料一體化的發(fā)酵操作系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)。

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Abstract To avoid the inaccuracy measurement caused by the different temperature between calibration solution and test solution in actual use of enzyme injection glucose biosensor， a detection method was established for enzyme injection glucose biosensors based on temperature. Firstly， the concentration detection model of the enzyme injection glucose biosensor is established according to enzymatic reaction kinetics. Then， the relationship between the temperature and the unknown parameters in the dynamic model of concentration detection is built using Arrhenius equation， and this relationship is substituted into the original detection dynamics model to establish the new model based on temperature. In this model， the current initial slope of the enzymatic reaction and the temperature are the inputs， and the concentration of glucose is output. Based on this new model， a detection method which is derived by the temperature of the mixture and the slope of the initial current is proposed. The new detection method can not only reduce the impact of temperature difference to improve detection accuracy， but also avoid the removal procedure of sampling probe causing by the calibration before each measurement， and it is more conducive to online use. A comparison was made by detecting the glucose solution with a concentration of 1.5 mg/mL， 2.5 mg/mL at the temperature of 25， 30， and 42℃ using both the original detection method and the new detection method based on temperature. The result shows that the recovery rate of the new method is more than 95.0%， significantly better than that of the original detection method.

Keywords Temperature； Glucose； Biosensor