豬傳染性胃腸炎病毒S1融合蛋白的構(gòu)建及其免疫原性研究

王芳　徐進(jìn)平

摘要 [目的]研究豬傳染性胃腸炎病毒S1融合蛋白的免疫原性。[方法]表達(dá)和純化了豬傳染性胃腸炎病毒S1與TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列的融合蛋白S1-TAT，將融合蛋白S1-TAT經(jīng)腹腔注射和灌胃方式免疫昆明小鼠，采集免疫小鼠血液和糞便樣品，檢測血清IgG抗體和黏膜IgA抗體水平，期間觀察小鼠體重變化。[結(jié)果]腹腔注射組誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清IgG抗體水平明顯高于其他試驗(yàn)組（P<0.01），但其黏膜IgA抗體水平較低；而灌胃組能夠誘導(dǎo)中等水平的血清IgG抗體和較高水平的黏膜IgA抗體（P<0.01）；在試驗(yàn)周期中，各組小鼠體重均正常。融合蛋白S1-TAT的穿腸活性較好，與對照組之間差異極顯著（P<0.01）。[結(jié)論]融合蛋白S1-TAT經(jīng)口服或注射小鼠后，能夠有效誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，并且融合蛋白S1-TAT經(jīng)口服可誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答；融合蛋白S1-TAT具有穿腸功能；融合蛋白S1-TAT經(jīng)口服或注射小鼠，均安全。

關(guān)鍵詞 豬傳染性胃腸炎病毒S1基因；轉(zhuǎn)導(dǎo)肽；免疫原性

中圖分類號 S852.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）13-0104-04

Construction and Immunogenicity of Transmissible Gastroenteritis Virus S1 Fusion Protein

WANG Fang，XU Jinping

（State Key Lab of Viral，School of Life Science，Wuhan University，Wuhan，Hubei 430072）

Abstract [Objective] To investigate the immunogenicity of fusion protein S1TAT consisting of transmissible gastroenteritis virus S1 and transcriptional activator protein （TAT）. [Method] The recombinant plasmid S1TAT was expressed in prokaryotic system and purified. Kunming mice were immunized with fusion protein S1TAT by intraperitoneal injection and intragastric administration respectively， collected the blood and stool samples of mice and determined for serum IgG and mucosal IgA antibody， observed the change of bodyweight. [Result] The level of serum IgG antibody of intraperitoneal injection group was significantly higher than other groups （P<0.01）， but mucosal IgA antibody was lower. However， the intragastric administration group induced a moderate level of serum IgG antibody and higher level of mucosal IgA antibody （P<001）. Throughout the immune process， the bodyweight of each group was within the normal range. The intestine activity of fusion protein S1TAT was better compared with the control group （P<0.01）. [Conclusion] The fusion protein S1TAT can effectively induce the humoral immune response in mice after oral administration or injection， and the mucosal immune response can be induced by oral administration. The fusion protein S1TAT has intestinal function. It is safe to immune mice by oral administration or injection.

Key words Transmissible gastroenteritis virus S1 gene；Transduction peptide； Immunogenicity

豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是一種可以引起以幼豬嘔吐、腹瀉和高死亡率為主要特征的急性傳染腸道疾病的RNA病毒[1]。纖突糖蛋白S作為誘導(dǎo)保護(hù)免疫的主要結(jié)構(gòu)蛋白[2-3]，在其氨基末端S1區(qū)域含有4個主要抗原位點(diǎn)，從N端到C端依次是C、B、D和A[4]。A位點(diǎn)是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵糖基化位點(diǎn)[5]，存在于病毒粒子的表面上；D位點(diǎn)雖不經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)的糖基化修飾作用，但應(yīng)用僅含D抗原位點(diǎn)基因免疫小鼠產(chǎn)生的血清特異性抗體也具有中和活性。如果S基因中缺乏A、D這2個位點(diǎn)，那么表達(dá)的蛋白質(zhì)就不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6-7]。另外有研究表明，TGEV S1基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫效果要優(yōu)于S全基因[8-9]。

目前，TGEV S1基因已在多種不同的表達(dá)系統(tǒng)中得到了有效的表達(dá)[10]，但在通過口服方式免疫動物時，由于各種消化酶作用以及本身大分子性質(zhì)，達(dá)不到很好的免疫效果。該研究借助能夠攜帶外源蛋白穿過細(xì)胞膜的TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列[11-13]，將其與S1基因進(jìn)行融合表達(dá)，比較融合蛋白S1-TAT以不同給藥方式免疫小鼠產(chǎn)生的免疫效果，為TGEV口服疫苗的研究提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒。大腸桿菌E.coli BL21 （DE3）、質(zhì)粒pGEX-6p-1為武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 生化試劑。質(zhì)粒小提取試劑盒和ELISA試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，Bio-Rad ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（170-5061）、GST-Resin純化柱購自七海生物，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgA購自佰泰科生物技術(shù)有限公司，抗GST血清為武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試驗(yàn)動物。SPF級別6～8周齡的雄性昆明小鼠購自湖北省疾控中心的實(shí)驗(yàn)動物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 基因合成與鑒定。參照TGEV TH-98株S1基因序列（KU729220），在S1基因C端融合TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列，并將重組基因S1-TAT克隆至表達(dá)載體pGEX- 6p-1中。用pGEX -6p-1通用引物（上游引物F：5'-GGGCTGGCAAGCCACG TTTGGTG-3'；下游引物R：5'-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3'）擴(kuò)增S1-TAT基因，經(jīng)BamH Ⅰ/EcoRⅠ雙酶切及基因測序鑒定重組質(zhì)粒為pGEX-6p-1-S1-TAT。

1.2.2 重組工程菌的制備。將實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌E.coli BL21 （DE3） 接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右。取1.5 mL菌液離心，棄上清，加入200 μL預(yù)冷的0.1 mol/L氯化鈣輕輕搖動重懸菌體沉淀，冰浴30 min。4 ℃、4 000 r/min離心10 min后棄上清，加入100 μL預(yù)冷的0.1 mol/L氯化鈣重懸菌體，得到制備好的E.coli BL21 （DE3） 感受態(tài)細(xì)胞。取1 μL重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-S1-TAT轉(zhuǎn)化E.coli BL21 （DE3） 感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌液PCR鑒定陽性重組子。

1.2.3 融合蛋白S1-TAT的表達(dá)與純化。挑取轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的單菌落接種于5 mL選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，按1 ∶100的比例轉(zhuǎn)接到20 mL選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時，加入0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。將菌液在4 ℃、10 000 r/min離心1 min，收集菌體沉淀，加入pH 7.4 PBS緩沖液進(jìn)行重懸，400 W超聲破碎至菌液不再黏稠后，12 000 r/min離心10 min，取少量樣品加入適當(dāng)上樣緩沖液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和Western blot分析。將破碎上清溶液與GST純化柱在4 ℃孵育過夜，4 ℃、3 000 r/min離心5 min。緩慢去除上清液，加入PBS清洗雜蛋白，4 ℃、3 000 r/min離心5 min。緩慢去除上清液后，加入pH 8.0 Elution buffer，室溫輕搖10 min，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，收集上清液，SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況。

1.2.4 試驗(yàn)動物分組、免疫和采樣。將昆明小鼠隨機(jī)分4組，每組8只。融合蛋白S1-TAT分別經(jīng)腹腔注射和灌胃給藥免疫昆明小鼠，每只小鼠每次免疫劑量100 μg，共免疫3次，間隔14 d以相同劑量加強(qiáng)免疫1次，同時設(shè)置PBS對照。在首次免疫后的第7、14、21、28、35和42天收集免疫小鼠血液和糞便樣品：全血37 ℃靜置1 h后，4 ℃放置過夜，次日4 ℃、2 000 r/min離心20 min，分離血清；每0.1 g糞便用200 μL 0.01 mol/L的PBS充分混勻，4 ℃作用1.5 h，離心收集上層液體。

1.2.5 抗體檢測。將融合蛋白S1-TAT以100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4 ℃放置過夜；次日棄除孔中液體，PBST反復(fù)洗滌3次，按200 μL/孔加入5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h；棄除孔中液體，PBST洗滌3次，按100 μL/孔加入適當(dāng)倍數(shù)稀釋好的待檢樣品，37 ℃孵育2 h；棄除孔中液體，PBST洗滌5次，按100 μL/孔加入1 ∶5 000稀釋的二抗（HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體或HRP標(biāo)記羊抗鼠IgA抗體），37 ℃孵育2 h；棄除孔中液體，PBST洗滌5次，每孔加入100 μL OPD底物溶液，避光顯色5 min后終止反應(yīng)，測定樣品的OD值。

1.2.6 遲發(fā)型超敏反應(yīng)。將融合蛋白S1-TAT與氟氏完全佐劑按比例充分混勻后注射于小鼠的右后足墊皮下，注射量為10 μg，并在同一小鼠左后足墊皮下注射PBS緩沖液。用千分卡尺測量注射抗原后24、48、72 h以及7、14 d小鼠的左右足墊厚度，觀察腫脹的發(fā)生和消長情況，結(jié)果以++、+、-表示（++代表明顯腫脹；+代表輕度腫脹；-代表無腫脹）。

1.2.7 融合蛋白S1-TAT的穿腸活性檢測。取5 cm昆明小鼠腸管，用PBS緩沖液沖洗小鼠腸管，將腸管一端扎緊，用移液槍吸取濃度為100 μg/mL的融合蛋白S1-TAT至扎好的小鼠腸管，扎好腸管另一端，投入裝有10 mL PBS緩沖液的試管中，并使PBS緩沖液完全浸沒小鼠腸管，設(shè)置陰性對照，30 ℃下靜置，間隔1 h取樣，ELISA方法檢測待檢樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-S1-TAT為模板，用引物擴(kuò)增S1-TAT序列，PCR鑒定重組質(zhì)粒。用BamH Ⅰ 和EcoR Ⅰ 酶雙酶切重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-S1-TAT，酶切鑒定重組質(zhì)粒。結(jié)果如圖1所示，PCR和雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳均見有1.2 kb的S1-TAT基因。經(jīng)后續(xù)測序鑒定，重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-S1-TAT構(gòu)建正確。

2.2 融合蛋白S1-TAT的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-S1-TAT轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21 （DE3） 以0.5 mmol/L IPTG、30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。誘導(dǎo)后的S1-TAT原核表達(dá)重組大腸菌在分子量

約為70 kD出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小基本一致（圖2）。

相對應(yīng)未經(jīng)誘導(dǎo)的重組大腸菌沒有出現(xiàn)此條帶，而誘導(dǎo)的空載體pGEX-6p-1對照重組大腸菌在26 kD左右出現(xiàn)GST蛋白條帶，上述結(jié)果初步表明融合蛋白S1-TAT在大腸桿菌中獲得表達(dá)。

2.3 融合蛋白S1-TAT的Western blot鑒定結(jié)果 將重組表達(dá)菌E.coli BL21（DE3） （pGEX-6p-1-S1-TAT） 進(jìn)行小量誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移到NC膜上，ECL化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，這些表達(dá)與GST融合的蛋白能被抗GST的單克隆抗體識別，蛋白條帶大小與預(yù)期符合，證實(shí)融合蛋白S1-TAT在大腸桿菌中得以表達(dá)正確（圖3）。

2.4 融合蛋白S1-TAT的純化 收集誘導(dǎo)后E.coli BL21（DE3） （pGEX-6p-1-S1-TAT） 破碎液上清，將其與GST純化柱4 ℃過夜孵育后，用適量PBS洗去雜蛋白，最后用pH 8.0的還原性谷胱甘肽洗脫液洗脫目的蛋白，從而獲得純化蛋白（圖4）。

2.5 免疫小鼠的血清IgG抗體水平 融合蛋白S1-TAT經(jīng)腹腔注射和灌胃給藥方式免疫昆明小鼠的42 d內(nèi)，間隔7 d隨機(jī)取3只試驗(yàn)小鼠斷尾取血，分離血清。血清IgG抗體ELISA檢測結(jié)果顯示（圖5），腹腔注射組小鼠在免疫后第7天即產(chǎn)生了特異性IgG抗體，與陰性對照組之間差異極顯著（P<0.01），其抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加和時間的延長逐漸升高。而灌胃組小鼠在免疫后第14天才開始有抗體產(chǎn)生，且抗體水平上升緩慢，與陰性對照組之間差異極顯著（P<0.01），整個免疫過程中抗體水平低于腹腔注射組。

2.6 免疫小鼠的黏膜IgA抗體水平 在首次免疫后的第7、14、21、28、35和42天，采集腹腔注射組和灌胃組免疫小鼠的糞便樣品，間接ELISA檢測腸道黏膜IgA抗體。結(jié)果顯示（圖6），灌胃組小鼠在免疫7 d后，體內(nèi)產(chǎn)生了較高水平的黏膜IgA抗體，與陰性對照組的差異達(dá)到極顯著（P<0.01）。隨著免疫次數(shù)的增加，灌胃組黏膜IgA抗體在第35天上升至最高，免疫后第42天抗體略微下降，但仍處于相對較高的水平（P<0.01）。而腹腔注射組小鼠在整個免疫過程中，體內(nèi)的黏膜IgA抗體一直處于較低水平。

2.7 對小鼠體重的影響 體重是衡量個體體質(zhì)狀況的重要標(biāo)志之一，在一定程度上可以反映出小鼠的生長發(fā)育水平。首次免疫后間隔14 d稱量計算小鼠的平均體重，比較各組小鼠的體重變化，結(jié)果顯示（圖7），各組之間差異不顯著（P>0.05），表明融合蛋白S1-TAT不影響小鼠的體重變化，可以初步評價為比較安全可靠的免疫原。

2.8 遲發(fā)型超敏反應(yīng) 小鼠足墊腫脹試驗(yàn)是用于測定動物能否出現(xiàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)及其強(qiáng)度的一種方法[14]。由表1可知，昆明小鼠的右后足墊在注射融合蛋白S1-TAT后的24 h左右出現(xiàn)輕度紅腫，隨著時間的延長紅腫明顯，至72 h反應(yīng)達(dá)到高峰。此后，腫脹反應(yīng)減輕，第14天小鼠足墊厚度基本恢復(fù)正常。而同一昆明小鼠的左后足墊免疫PBS緩沖液后未見足墊腫脹反應(yīng)。

2.9 融合蛋白S1-TAT的穿腸活性 取小鼠腸管作為研究融合蛋白S1-TAT穿腸功能的生物膜屏障，檢測腸管外環(huán)境中融合蛋白S1-TAT的吸光值。結(jié)果如圖8所示，小鼠腸管外融合蛋白S1-TAT在靜置1 h后開始上升，隨著時間的延長，管外的融合蛋白S1-TAT持續(xù)上升，在靜置4 h后達(dá)到最大值，5 h略有下降，與PBS對照組之間的差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），證實(shí)S1蛋白在TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域介導(dǎo)下能夠有效地穿過小鼠腸壁細(xì)胞。

3 討論

近年來，對如何防治豬傳染性胃腸炎病毒的研究越來越多，TGEV S1基因作為誘導(dǎo)免疫中和反應(yīng)的核心序列，利用其翻譯的S1蛋白制作亞單位疫苗具有良好的可行性。然而，在將S1蛋白亞單位疫苗通過注射方式免疫小鼠時，雖然能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的血清IgG抗體，但TGEV主要攻擊宿主的腸道組織，腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型IgA抗體才是抵抗該病毒的有效抗體，而IgG等血清抗體對黏膜感染的病毒免疫保護(hù)效果并不理想。相比之下口服免疫作為一種簡單可行的免疫接種途徑，有著可以誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜IgA抗體的優(yōu)勢。但亞單位疫苗本身是蛋白質(zhì)，在經(jīng)口服免疫時容易被胃環(huán)境中的各種消化酶降解而最終失去免疫原性，且很難穿過腸系膜進(jìn)入到血液循環(huán)中，導(dǎo)致了能夠產(chǎn)生有效的黏膜IgA抗體的基因工程疫苗依舊缺乏。但有研究發(fā)現(xiàn)，在自然界中存在著一類能夠安全有效地實(shí)現(xiàn)外源生物大分子穿過生物膜結(jié)構(gòu)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域家族，其中研究較多且較為深入的便是TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，它的發(fā)現(xiàn)為TGEV口服亞單位疫苗的研究提供了新的思路。

該研究基于TGEV S1基因的誘導(dǎo)中和抗體作用及TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，首次將S1與TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽進(jìn)行融合，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-S1-TAT，并表達(dá)與純化了融合蛋白S1-TAT。為了研究融合蛋白S1-TAT經(jīng)口服和注射小鼠后體內(nèi)的免疫應(yīng)答方式，該研究比較了2種不同給藥方式誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平。結(jié)果顯示，腹腔注射組能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的血清IgG抗體，產(chǎn)生速度較快，但其黏膜IgA抗體一直處于較低水平；而灌胃組除了可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中等水平的血清IgG抗體之外，其黏膜IgA抗體水平也是顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.01）。以上結(jié)果說明融合蛋白S1-TAT經(jīng)口服或注射小鼠后，能夠有效誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，并且融合蛋白S1-TAT經(jīng)口服可誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答，為口服抗TGEV基因工程疫苗的研制提供一定的參考價值。

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