非洲豬瘟的診斷和防治

賈良梁

摘? 要：本文是《非洲豬瘟及其傳入美國的趨勢以及隨后在野豬和當?shù)仳缰写_立的可能性（綜述）》的第三部分，重點介紹非洲豬瘟的診斷、疫苗研發(fā)和防治策略。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟;診斷;防治;疫苗

中圖分類號：S855 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）12-0007-04

1? 診斷

病毒分離可以用于非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）的診斷，因為活的病毒可以從活的動物或剖檢組織中分離到，不過這種方法通常僅用于參考，需實驗室進行確診。脾臟、腎臟、扁桃體和淋巴結(jié)是收集非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）的最佳組織。豬白細胞、骨髓培養(yǎng)物、豬肺泡巨噬細胞和豬血單核細胞都可以用于ASFV的培養(yǎng)。研究人員已經(jīng)開發(fā)了可用來檢測ASFV的傳統(tǒng)實時定量PCR法，同時開發(fā)了多種引物，以便構(gòu)建快速檢測工具。人們已經(jīng)可以在ASFV感染下幸存的家豬體內(nèi)檢測到強烈的IgG反應(yīng)。同時，血清學分析也是非常有用的方法，尤其在非洲豬瘟呈地方性流行的地區(qū)。酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫印跡和間接熒光抗體分析是最常用的方法，ELISA再聯(lián)合免疫印跡經(jīng)常出于國際貿(mào)易的目的被利用。

2? 疫苗

研發(fā)有效的ASF疫苗相當具有挑戰(zhàn)性。到目前為止，由于受一些關(guān)鍵因素的影響全世界尚沒有可用的疫苗，這些因素包括保護性抗原的鑒定不足、對病毒-宿主細胞相互作用的了解不完全和對關(guān)于當前在自然儲庫中流行的毒株多樣性的了解不充足。研究人員已經(jīng)嘗試了一些疫苗方案，并且獲得了不同程度的成功，包括運用自然或試驗敲除基因的疫苗、基于重組蛋白的亞單位疫苗和DNA疫苗。然而，這些疫苗均無法提供完全的保護力。研究人員開發(fā)了一種弱毒活疫苗，對同源毒株攻毒能產(chǎn)生免疫保護;然而，在伊比利亞半島的使用被認為已經(jīng)成為1960年到1995年期間引發(fā)慢性型非洲豬瘟的一些低毒力毒株的來源。盡管這次嘗試受挫，但是研究人員仍繼續(xù)對弱毒疫苗的保護力進行了評估。

研究人員已經(jīng)評估了ASFV基因敲除突變株的免疫效力，不過獲得的結(jié)果不一致。Afonso等介紹了被稱為NL的一個高保守基因，并發(fā)現(xiàn)將ASFV歐洲致病性毒株中的該基因剔除會使該病毒在家豬體內(nèi)完全弱化。研究人員為非洲豬瘟的高毒力非洲株構(gòu)建了兩個NL敲除突變株，接種家豬后發(fā)現(xiàn)不論NL缺失與否這些毒株均保持毒力。這些發(fā)現(xiàn)表明，NL基因的功能不是這些ASFV毒株需要的，僅敲除NL基因不足以設(shè)計出ASFV弱毒疫苗。9GL基因高度保守，體外評估表明該基因編碼的蛋白質(zhì)會影響巨噬細胞培養(yǎng)的病毒粒子的成熟和病毒的生長。9GL基因的敲除會使病毒在培養(yǎng)中產(chǎn)生生長缺陷的突變株，并發(fā)現(xiàn)在家豬中高度弱化。接種9GL基因敲除的病毒后再用野生型ASFV毒株攻毒，結(jié)果會產(chǎn)生充足的保護力，研究人員正在對該毒株作為ASFV疫苗候選毒株進行進一步的評估。9GL基因也高度保守，研究發(fā)現(xiàn)剔除后會造成病毒在家豬體內(nèi)完全弱化。接種該突變株后再感染同源野毒株，結(jié)果會產(chǎn)生完全的保護作用。然而，值得注意的是，研究人員對抗ASFV的特異性抗體、ASFV特異性IFNγ反應(yīng)和循環(huán)細胞因子水平進行評估后發(fā)現(xiàn)，不論感染確立與否均發(fā)生了復(fù)雜的免疫情況。

此外，A238L是一種能夠抑制NF?B和NFAT通路活化的ASFV免疫調(diào)制蛋白，這兩個通路負責調(diào)控促炎因子的合成。這種蛋白被認為是一種有效的免疫抑制因子，可能有助于病毒逃避宿主的免疫反應(yīng)。不出所料，給豬接種ASFV的A238L突變毒株能夠提高TNFα——一種有效的促炎因子——的水平。研究人員還需要進行更多的研究以確定用改變免疫調(diào)制蛋白的病毒進行免疫接種是否可以用于促進宿主對強毒攻毒的免疫反應(yīng)。

研究人員已經(jīng)利用多種恰當?shù)牟《镜鞍讓χ亟M蛋白疫苗進行了定性。p30蛋白和p54蛋白位于病毒表面，且分別參與病毒附著和病毒內(nèi)化。給家豬接種重組的p54蛋白或p30蛋白能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生中和抗體，但是不能使豬對致死劑量的攻毒產(chǎn)生免疫力且病程不變。接種聯(lián)合了p54蛋白和p30蛋白的疫苗不僅能使動物產(chǎn)生中和抗體而且還會改變病程，產(chǎn)生一系列保護。Ivanov等對能夠模擬病毒蛋白的46個縮氨酸建立一個保護性免疫反應(yīng)的能力進行了評估。研究發(fā)現(xiàn)，給家豬接種這些縮氨酸的混合物可以推遲動物的死亡，但有待進一步研究。研究人員將可以表達ASFV血凝素的桿狀病毒載體用作疫苗，結(jié)果所有豬在免疫后都抗過了強毒毒株的攻毒。

研究人員也將作為ASF疫苗候選者的DNA疫苗進行了評估，在構(gòu)建疫苗時將p54蛋白和p30蛋白用作抗原可提供部分保護。CD8+細胞的強力激活對于激發(fā)保護似乎至關(guān)重要。

感染葡萄牙的ASFV無毒力毒株（OURT88/3 基因1型），隨后感染其有毒力的毒株（OURT88/1基因1型），結(jié)果接種動物對ASFV的非洲野外分離株產(chǎn)生了免疫保護。這種免疫策略可防止大多數(shù)豬發(fā)病和出現(xiàn)病毒血癥。多個ASFV毒株的交叉反應(yīng)性可以通過IFNγ刺激實驗檢測，并與產(chǎn)生的保護程度高度相關(guān)。

除了評估新的疫苗產(chǎn)品外，Blome等使用先進的佐劑尤其是多價抗體和Emulsigen-D再次評估了ASFV滅活疫苗制劑的功效，后兩種佐劑被認為可以刺激體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)，包括IFNγ。ASFV滅活疫苗的免疫效力沒有提高，動物免疫后再用相同的毒株攻毒后未能產(chǎn)生保護作用。事實上，免疫的動物發(fā)病更快，這表明抗體依賴性有增加的可能性。

ASFV的疫苗研發(fā)正在進行中且富有挑戰(zhàn)性，因為遺傳和抗原變異范圍廣以及病毒為逃避宿主免疫反應(yīng)采取的策略眾多。要開發(fā)一種既具有生物安全性又能為ASFV各種強毒毒株提供高水平交叉保護的疫苗需要進一步研究。該論題專家認為，弱毒活疫苗因其在實驗上取得的成功在短期內(nèi)是最有應(yīng)用前景的疫苗，然而，如果需要確定疫苗的安全性、鑒別自然感染和免疫接種動物（Discrimination of Infected from Vaccinated Animals，DIVA）的能力和長期效力則需要進行更多的研究。

3? 結(jié)論

美國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局已經(jīng)出臺了針對家豬經(jīng)典豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）的監(jiān)督方案，在傳入風險提高的疫情中，家豬可以用于評估ASFV。具體內(nèi)容如下：（1）監(jiān)督美國豬群中CSFV的快速檢測;（2）監(jiān)測經(jīng)典豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）傳入美國豬群的風險;（3）監(jiān)測國際CSF疫情;（4）監(jiān)督明確CSF的自由度。那些增重困難，換言之，有點生病的豬，被稱為僵豬，通常被賣給非流通市場的小販。美國動植物衛(wèi)生檢驗署（Animal and Plant Health Inspection Service，APHIS）獸醫(yī)局職員或其輔助人員收集這些市場上的豬扁桃體樣本作為調(diào)查病原體包括CSFV的一種方法。該方法被視為一種有效的監(jiān)督策略，因為來自周邊地區(qū)生產(chǎn)性能欠佳的豬通常集中在這些市場中，這使得該方法成為采集來自更廣泛區(qū)域病豬樣本的一種有效手段。此外，飼喂泔水的豬場、庭院式豬場、野豬獵捕俱樂部、軍事基地、國際機場或碼頭、雇傭國際勞動力的農(nóng)場以及/或從事跨國生豬轉(zhuǎn)運的組織所在的地區(qū)被APHIS認定為暴發(fā)非洲豬瘟的高風險區(qū)，這些地區(qū)屬于扁桃體采集的經(jīng)常性監(jiān)督范圍;美國25個州被視為高風險地區(qū)。在美國，所有用泔水飼喂的豬場需要獲得批準并需定期檢查，所有飼料均需強制進行熱處理。德克薩斯和佛羅里達州被認定為暴發(fā)非洲豬瘟的極高風險區(qū);同樣，APHIS會對佛羅里達州的2個和得克薩斯州的3個屠宰場隨機采集血樣，采集的樣本會送至外來動物疾病診斷實驗室（Foreign Animal Disease Diagnostic Laboratory，F(xiàn)ADDL）以備進一步檢測，尤其是來自各州南部地區(qū)體重輕的或處于轉(zhuǎn)移期的豬樣本。對家豬進行經(jīng)常性的CSFV監(jiān)督機制可以立即擴展到對ASFV的監(jiān)督中，因為樣本已經(jīng)采集到且送至FADDL用于篩查。

需要注意的是，ASF在東歐和高加索地區(qū)的傳播大多數(shù)很可能是受到人為因素的驅(qū)動，如感染豬和產(chǎn)品的運輸以及飼喂泔水。然而，蜱的作用不能忽視，因為它們造成了ASFV在葡萄牙流行超過6年之久，當時該國僅單個豬場重新出現(xiàn)該病，在此之前宣布無ASF。人們往往很少了解媒介在病原維持和傳播中的作用，而這些壽命長的蜱協(xié)同可能會促進ASFV傳播的人類活動在ASF的暴發(fā)上起著重要的作用。

對非法進口和隨后充公的、意外死亡的野豬及其產(chǎn)品抽樣也將會提供與傳入病原的類型相關(guān)的有效數(shù)據(jù)。據(jù)美國審計總署（General Accounting Office）估計，旅客攜帶的非法進口野生動物中僅1%～3%被查獲，1%～10%非法進口野生動物公然以貨物運輸。Smith等進行了一項初步研究，評估來自紐約州紐約市約翰肯尼迪機場的充公動物產(chǎn)品中的動物傳染病病原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒毒株出現(xiàn)在一些非人靈長動物樣本中。有關(guān)以非法進口豬肉產(chǎn)品的方式傳入美國的病原體類型的知識，對了解豬特異性病原和動物傳染病病原風險可能非常有幫助。

ASF對家豬和野豬物種的健康均會構(gòu)成實質(zhì)性威脅。對ASFV傳入美國的擔心已經(jīng)促使人們采取了一系列用于活體動物及其產(chǎn)品進口的預(yù)防措施。盡管人們對ASFV進行了大量的研究，但是研究的不足仍然存在，它們已被列為進一步評估的重點領(lǐng)域。