茉莉酸浸種對(duì)云煙87斜紋夜蛾抗性的影響

馬燦容 燕飛虹 楊飛 湯金香 王蕾

摘 要：為明確茉莉酸（Jasmonic acid，JA）浸種對(duì)煙草抗蟲性的影響，測(cè)定了JA浸種的云煙87對(duì)斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的抗性及植株中JA和茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）的含量。結(jié)果表明，以JA浸種的云煙87為食物的斜紋夜蛾幼蟲重量比未浸種的降低了15%。在模擬斜紋夜蛾取食后，JA浸種的云煙87幼苗誘導(dǎo)出的JA含量比未浸種的增加41%，JA-Ile含量增加42%。斜紋夜蛾取食的JA浸種的云煙87幼苗，其抗蟲次生代謝物如咖啡酰丁二胺、二咖啡酰亞精胺、尼古丁和二萜糖苷的含量分別增加60%，79%，19%和29%，胰蛋白酶抑制劑活性增強(qiáng)80%。同時(shí)，JA浸種后6周，云煙87植株干質(zhì)量與對(duì)照植株差異不顯著。JA浸種可以提高云煙87對(duì)斜紋夜蛾的抗性，同時(shí)不影響其產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：茉莉酸浸種；斜紋夜蛾；抗蟲性

中圖分類號(hào)：S435.72 文章編號(hào)：1007-5119（2018）02-0076-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.011

Effects of Jasmonic acid Seed Treatment on Yunyan 87 Resistance to Spodoptera litura

MA Canrong1，2， YAN Feihong1，2， YANG Fei1，2， TANG Jinxiang1，2， WANG Lei1*

（1. Department of Economic Plants and Biotechnology， Yunnan Key Laboratory for Wild Plant Resources， Kunming Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650201， Yunnan China； 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract： To test whether application of jasmonic acid （JA） to seeds influence the resistance of tobacco （Var. Yunyan87） to insects， the herbivore performance of Spodoptera litura， as well as the contents of JA and JA-Ile of the Yunyan87 plants were measured. The caterpillars feeding on the Yunyan 87 plants from JA-treated seeds gained 15% less weight than those grown on the control plants. After simulated S. litura larval feeding， JA and JA-Ile （a bioactive signal which can induce defenses to arthropod herbivores） accumulation was 41% and 42% higher in tobacco plants from JA-treated seeds， respectively. Meanwhile， several JA-Ile-dependent defensive metabolites including caffeoylputrescine， dicaffeoylspermidine， nicotine， diterpene glycosides， and the activities of trypsin proteinase inhibitors increased 60%， 79%， 19%， 29%， and 80%， respectively， in tobacco grown from JA-treated seeds. Importantly， the JA treatment to seeds did not influence the growth of plants： the dry weight of 6-week-old plants grown from the JA-treated seeds was not reduced. We conclude that application of JA to seeds increases tobacco resistance to S. litura， without reducing the yield.

Keywords： treating seeds with jasmonic acid； Spodoptera litura； insect-resistance

斜紋夜蛾、煙青蟲等鱗翅目夜蛾科咀嚼式口器昆蟲，以幼蟲啃食煙葉嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)及產(chǎn)量。最初，人們采用化學(xué)防治控制煙草蟲害，但是隨著化學(xué)農(nóng)藥的大面積使用和長(zhǎng)時(shí)間的積累，單一防治方法的弊端也開始慢慢顯現(xiàn)。農(nóng)藥的高殘留量、害蟲抗藥性等問題，給生態(tài)環(huán)境和食品安全帶來巨大隱患，人們轉(zhuǎn)而尋找其他方式防治煙草蟲害。

茉莉酸（Jasmonic acid， JA）及其前體和衍生物，統(tǒng)稱茉莉酸類物質(zhì)（Jasmonates， JAs）是調(diào)控植物抵御昆蟲取食的重要植物激素。在未被昆蟲取食的情

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目“茉莉酸-異亮氨酸結(jié)合物羥基化酶基因應(yīng)用于創(chuàng)制高抗蟲性作物的研究”（2017FA015）

1.5.2 模擬斜紋夜蛾取食和JA、JA-Ile的含量測(cè)定 用云煙87葉片飼喂100頭3～5齡期的斜紋夜蛾幼蟲，用移液槍吸取幼蟲吐出的口腔分泌物，轉(zhuǎn)移到離心管中，離心管置于冰上以防口腔分泌物受熱失效。播種后5周的JA浸種與對(duì)照的植株各5株，用劃布輪統(tǒng)一在第4片真葉上平行中脈左右兩邊各劃3下，并立刻在劃出的小孔中涂抹25 ?L用去離子水按1：1稀釋的斜紋夜蛾口腔分泌物。上述方法處理0.5 h后，每株取200 mg處理部位的葉片，用含有JA的內(nèi)標(biāo)（D6-JA，20 ng/mL）和JA-Ile的內(nèi)標(biāo)（D6-JA-Ile，5 ng/mL）的乙酸乙酯溶液提取200 mg煙葉中的激素，提取的詳細(xì)步驟參考LUO等[7]使用的方法，激素測(cè)定儀器為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀。

1.5.3 抗蟲次級(jí)代謝物質(zhì)以及TPI活性測(cè)定 播種后5周的JA浸種與對(duì)照的云煙87植株各5棵，在斜紋夜蛾幼蟲取食7 d后，稱取2份第4片煙葉樣品200 mg，其中一份用于提取尼古丁、CP、DCS和DTG，提取液包含40 %（V/V，溶劑為去離子水）甲醇，0.1 %（V/V，溶劑為去離子水）乙酸，50 ng/mL的尼古丁內(nèi)標(biāo)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀測(cè)定；另一份用于TPI活性測(cè)定，參考VAN DAM等[8]的方法。

1.5.4 煙草植株的總干重測(cè)定 播種后6周的JA浸種與對(duì)照植株各10株，取地上部分，100 ℃干燥箱內(nèi)烘3 h，稱重。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。文中數(shù)據(jù)均為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）格式，顯著性分析方法為t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 JA浸種對(duì)云煙87抗蟲性的影響

利用萌發(fā)后5周的JA浸種處理和對(duì)照葉片飼喂斜紋夜蛾2齡幼蟲，7 d后稱量幼蟲的重量來明確JA浸種對(duì)云煙87抗蟲性的影響。結(jié)果顯示（圖1），JA浸種植株相對(duì)于對(duì)照，斜紋夜蛾幼蟲重量呈降低趨勢(shì)，對(duì)照植株上幼蟲平均重量為100.9 mg，JA浸種植株上幼蟲平均重量為86.9 mg，降低了15%，差異顯著。這說明JA浸種顯著抑制了斜紋夜蛾幼蟲對(duì)云煙87植株葉片的取食。

2.2 JA浸種對(duì)云煙87中JA和JA-Ile含量的影響

對(duì)JA浸種與對(duì)照植株葉片進(jìn)行模擬斜紋夜蛾取食，0.5 h后取樣，提取并通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀器測(cè)定植物激素JA及JA-Ile的含量。結(jié)果顯示，模擬取食前，JA浸種及對(duì)照植株葉片中的JA及JA-Ile本底水平的含量均非常低：對(duì)照浸種植株中JA本底含量?jī)H為6.95 ng/g鮮質(zhì)量，JA-Ile本底含量為0.34 ng/g鮮質(zhì)量，JA浸種植株中JA本底含量?jī)H為3.19 ng/g鮮質(zhì)量，JA-Ile本底含量為0.4 ng/g鮮質(zhì)量；模擬斜紋夜蛾取食后，JA浸種植株與對(duì)照植株的JA和JA-Ile含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且JA浸種植

株的JA和JA-Ile的含量分別是對(duì)照植株的1.69倍及1.74倍（圖2）；經(jīng)分析，兩個(gè)處理組之間JA和JA-Ile的含量差異顯著。說明模擬斜紋夜蛾取食后，JA浸種的云煙87植株可以合成更多的JA和JA-Ile。

2.3 JA浸種對(duì)云煙87植株中的抗蟲化合物含量的影響

JA浸種顯著減少斜紋夜蛾幼蟲對(duì)其植株的取食（圖1），JA浸種與對(duì)照植株被斜紋夜蛾幼蟲取食7 d后，取樣測(cè)定抗蟲次生代謝物尼古丁、CP、DCS和DTG的含量及TPI活性。結(jié)果表明（圖3），JA浸種植株相對(duì)于對(duì)照植株，其上述抗蟲化合物含

注：**， p<0.01（n=60）。Note： **， p<0.01（n=60）.

圖1 JA浸種和對(duì)照的云煙87上斜紋夜蛾幼蟲質(zhì)量比較

Fig. 1 Comparison in larval mass of Spodoptera litura after fed on Yunyan87 plants grown from JA-treated or control-treated seeds

注：*，p<0.05；**，p<0.01（n=3或4）。mf，鮮質(zhì)量。Note： *， p<0.05； **， p<0.01 （n=3 or 4）. mf， fresh mass.

圖2 JA浸種和對(duì)照浸種的云煙87在模擬斜紋夜蛾取食后JA和JA-Ile含量的比較

Fig. 2 Comparison in contents of JA or and JA-Ile in tobacco （var. Yunyan87） plants grown from JA-treated or control-treated seeds after simulated Spodoptera litura feeding

量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。JA浸種煙株的尼古丁、CP、DCS、煙堿Ⅶ的相對(duì)含量分別是對(duì)照植株的1.2倍，2.5倍，4.7倍和1.4倍，JA浸種煙株的TPI活性是對(duì)照植株的5.7倍。除尼古丁和煙堿Ⅶ外，CP、DCS含量和TPI活性在對(duì)照植株和JA浸種植株之間差異顯著。結(jié)果說明JA浸種促使植株在斜紋夜蛾取食后合成更多的抗蟲化合物，幼蟲取食量降低，這是導(dǎo)致斜紋夜蛾幼蟲重量減少的直接原因。

2.4 JA浸種對(duì)云煙87植株干質(zhì)量的影響

為了明確JA浸種是否影響云煙87植株的干質(zhì)量，稱量了萌發(fā)6周后JA浸種和對(duì)照云煙87植株的干質(zhì)量。結(jié)果顯示（圖4），10棵JA浸種云煙植株的總干質(zhì)量為57.37 g，10棵對(duì)照植株總干質(zhì)量為55.15 g，差異不大，說明JA浸種對(duì)其植株的總干質(zhì)量影響較小。

3 討 論

大量研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸是重要的抗蟲響應(yīng)激素，昆蟲取食直接誘導(dǎo)茉莉酸含量的增加，從而將導(dǎo)致抗蟲化合物含量的上升[9]；但是，茉莉酸浸種這一方式對(duì)植物抗蟲性影響的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在茉莉酸浸種后的煙株上的斜紋夜蛾幼蟲，害蟲體質(zhì)量較生長(zhǎng)在對(duì)照煙株上的斜紋夜蛾幼蟲輕，且差異顯著，進(jìn)一步的研究表明，茉莉酸浸種造成煙草植株對(duì)斜紋夜蛾抗性的增加，同樣與茉莉酸含量升高有關(guān)。由于植株被昆蟲取食后，能產(chǎn)生更多的

注：*， p<0.05；**，p<0.01（n=3或4）。mf，鮮質(zhì)量；mp，總蛋白質(zhì)量。

Note： *， p<0.05； **， p<0.01（n=3 or 4）. mf， fresh mass. mp， total protein mass.

圖3 JA浸種和對(duì)照浸種的云煙87植株斜紋夜蛾幼蟲取食后抗蟲次級(jí)代謝物含量的比較

Fig. 3 Comparison in contents of secondary metabolites in tobacco （var. Yunyan87） plants grown from JA-treated or control-treated seeds after Spodoptera litura feeding

圖4 JA浸種和對(duì)照浸種云煙87植株總干質(zhì)量的比較

Fig. 4 Comparison in total dry mass of tobacco （Yunyan87） plants grown from JA-treated and control-treated seeds.

茉莉酸，轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘钚攒岳蛩帷狫A-Ile，受JA-Ile調(diào)控的抗蟲次生代謝物的合成隨之增加，這些抗蟲次生代謝物包括TPI、二萜糖苷類物質(zhì)等。JA浸種提高植物對(duì)咀嚼式昆蟲的抗性可能具有一定的普遍性，先前的研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸浸種同樣可提高番茄對(duì)咀嚼式口器昆蟲—煙草天蛾（M. sexta）的抗性[5]。我們的研究更進(jìn)一步地從代謝水平解釋JA浸種如何提高植株對(duì)咀嚼式昆蟲的抗性。茉莉酸途徑是否參與對(duì)刺吸式昆蟲的防御還很不清楚，因?yàn)榇涛嚼ハx通常誘導(dǎo)植物水楊酸（SA）防御途徑[10]。有趣的是，茉莉酸浸種還能提高番茄對(duì)白粉虱（O. neolycopersici）、紅蜘蛛（T. urticae）、桃蚜（M. persicae）等刺吸式昆蟲的抗性[5]。茉莉酸浸種能否提高栽培煙草對(duì)刺吸式昆蟲的抗性還有待進(jìn)一步研究。此外，我們的研究顯示，茉莉酸浸種這一處理方式使云煙87對(duì)斜紋夜蛾的抗性增強(qiáng)的效果至少可以持續(xù)到萌發(fā)后6周，這種效果能否持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間，也還需要進(jìn)一步研究。

外源施加茉莉酸或提高植物中內(nèi)源茉莉酸含量，雖然可以提高植物的抗蟲性，但是同時(shí)也會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)[11]，而茉莉酸浸種并沒有降低煙草植株在萌發(fā)后6周內(nèi)的生長(zhǎng)，我們推測(cè)這是由于茉莉酸浸種并未引起植物體內(nèi)茉莉酸的本底水平升高，因而也不足以抑制煙株的生長(zhǎng)發(fā)育。JA浸種后，只有煙株被斜紋夜蛾取食后，才可誘導(dǎo)JA和JA-Ile含量的增加，并造成抗蟲次生代謝物的合成增加，煙株抗蟲性增強(qiáng)；而未受到斜紋夜蛾取食時(shí)，煙株

中的JA及JA-Ile水平與對(duì)照植物的同樣低，不會(huì)造成煙株生長(zhǎng)受抑制。

4 結(jié) 論

茉莉酸浸種使云煙87植株至少在萌發(fā)后6周內(nèi)，對(duì)斜紋夜蛾的抗性明顯增強(qiáng)，對(duì)植株的干質(zhì)量沒有影響。因而，茉莉酸浸種是一種綠色有效的煙草害蟲防治措施，有潛在的推廣應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] WU J， BALDWIN I T. New insights into plant responses to the attack from insect herbivores[J]. Annual Review of Genetics， 2010， 44： 1-24.

[2] WANG L， WU J. The essential role of jasmonic acid in plant-herbivore interactions--using the wild tobacco Nicotiana attenuata as a model[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2013， 40（12）： 597-606.

[3] BALDWIN I T. Jasmonate-induced responses are costly but benefit plants under attack in native populations [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1998， 95（14）： 8113-8118.

[4] HEINRICH M， HETTENHAUSEN C， LANGE T， et al. High levels of jasmonic acid antagonize the biosynthesis of gibberellins and inhibit the growth of Nicotiana attenuata stems[J]. Plant Journal， 2013， 73（4）： 591-606.

[5] WORRALL D， HOLROYD G H， MOORE J P， et al. Treating seeds with activators of plant defence generates long-lasting priming of resistance to pests and pathogens[J]. New Phytologist， 2012， 193（3）： 770-778.

[6] 涂業(yè)茍，曾吉華. 斜紋夜蛾的人工飼養(yǎng)技術(shù)[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010（1）：87-88.

TU Y X， Zeng J H. A method for artificial rearing of common cutworm spodoptera litura[J]. Acta Agriculturae Jiangxi， 2010 （1）： 87-88.

[7] LUO J， WEI K， WANG S， et al. COI1-Regulated hydroxylation of jasmonoyl-L-isoleucine impairs Nicotiana attenuata's resistance to the generalist herbivore Spodoptera litura[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2016， 64（14）： 2822-2831.

[8] VAN DAM N M， HORN M， MARES M， et al. Ontogeny constrains systemic protease inhibitor response in Nicotiana attenuata[J]. Journal of Chemical Ecology， 2001， 27（3）： 547-568.

[9] HOWE G A， JANDER G. Plant Immunity to Insect Herbivores[J]. Annual Review of Plant Biology， 2008， 59（1）： 41-66.

[10] 劉勇，孫玉誠(chéng)，王國(guó)紅. 植物和刺吸式口器昆蟲的誘導(dǎo)防御與反防御研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2011（4）：1052-1059.

LIU Y， SUN Y B， WANG G H. The induced defense and anti-defense between host plant and phloem sucker insect[J]. Chinese Journal of Applied Entomology， 2011， （4）： 1052-1059.

[11] YANG D L， YAO J， MEI C S， et al. Plant hormone jasmonate prioritizes defense over growth by interfering with gibberellin signaling cascade [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2012， 109（19）： 1192-1200.