四個國家雪茄外包皮煙葉表面細菌分離與活性測定

張鴿 梁開朝 辛玉華 王娟 李書貴 王帆 張海波 劉好寶

摘 要：研究不同國家雪茄外包皮煙葉表面細菌差異，并為篩選菌株在雪茄外包皮煙葉發(fā)酵中的利用奠定基礎(chǔ)。利用常規(guī)分離方法對美國、巴西、多米尼加及中國4個國家的7個雪茄外包皮煙樣表面細菌進行分離鑒定，并初步測定篩選細菌的功能活性。結(jié)果表明，4個不同國家雪茄外包皮煙葉表面共分離獲得細菌100株；屬水平上不同地區(qū)雪茄外包皮煙葉表面細菌多樣性及數(shù)量存在差異，基本以芽孢桿菌和葡萄球菌為主，尤其芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬；細菌種類多米尼加>美國-2=中國-1>巴西-1>巴西-2 >中國-2>美國-1?；钚苑治鼋Y(jié)果顯示，具有纖維素酶、果膠酶和蛋白酶分泌功能的菌株分別為24株、20株和22株，耐煙堿菌株46株，有7株芽孢桿菌同時具有上述4種活性。本研究證明國內(nèi)外不同地區(qū)雪茄外包皮煙葉表面細菌種類存在差異，以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢細菌，其次是葡萄球菌，且芽孢桿菌屬酶活更全面，不同菌株間活性差異較大。

關(guān)鍵詞：雪茄外包皮煙葉；表面細菌；分離鑒定；活性測定

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）02-0082-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.012

Isolation and Activity Determination of Surface Bacteria in Cigar Wrapper Leaves from Four Different Countries

ZHANG Ge1，2，3， LIANG Kaichao2， XIN Yuhua2， WANG Juan2， LI Shugui1，3，

WANG Fan4， ZHANG Haibo4， LIU Haobao1，2，3*

（1. Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China； 2. Hainan Cigar research Institute Hainan Provincial Branch of China National Tobacco Corporation， Haikou 571100， China； 3. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China； 4. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology， Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： In order to study the difference of surface bacteria of cigar wrapper leaves from different countries， and lay the foundation for further research on utilization of bacteria in tobacco fermentation， surface bacteria from seven different regions， such as US， Brazil， Dominica and China， were isolated and bioactivities determined. The results showed that 100 strains of bacteria were isolated from different cigar wrapper tobacco. At the level of genus in different regions of cigar wrapper tobacco， surface bacterias diversity and numbers were different， and Bacillus and Staphylococcus were the main species. The microbial diversity at the level of genus gradually reduced from Dominica， America-2， China-1， Brazil-1， Brazil-2， China-2 to America-1. The results of bioactivity analysis showed that 24 strains had the ability to excrete cellulase， 20 strains had the ability to excrete pectinase， 22 strains had the ability to excrete protease， and 46 strains can grow in nicotine. Especially， 7 of the strains， which all belong to bacillus， had all four functions. This study showed that there were different species of bacteria on the surface of cigar wrapper in different regions. Bacillus was the dominant bacteria， followed by Staphylococcus. The activity of Bacillus was more comprehensive， and the bioactivity of different strains was different.

Keywords： cigar wrapper； surface bacteria； isolation and identification； activity determination

雪茄煙由3部分組成：茄衣、茄套和茄芯，其中茄衣是雪茄的精華部分[1]。由于生產(chǎn)水平差異，不同國家地區(qū)生產(chǎn)的雪茄外包皮煙葉品質(zhì)不同，生產(chǎn)中對雪茄外包皮煙葉的物理特性要求較高。發(fā)酵

基金項目：海南省科技計劃項目“海南省特色雪茄發(fā)酵微生物的分離與表征”（ZDYF2017155）；中國煙草總公司海南省公司科技重點項目“海南雪

茄煙葉常規(guī)發(fā)酵技術(shù)研究”（201746000024052），“優(yōu)質(zhì)雪茄外包皮煙葉關(guān)鍵栽培技術(shù)研究”（201746000024056）

作者簡介：張 鴿（1992-），女，在讀碩士，研究方向為煙葉發(fā)酵。E-mail：zhangge_0315@163.com。*通信作者，E-mail：liuhaoboa@caas.cn

收稿日期：2017-11-23 修回日期：2018-04-18

是改善雪茄外包皮煙葉外觀質(zhì)量、物理特性、內(nèi)在成分、吸食品質(zhì)的重要工序，是雪茄外包皮煙葉生產(chǎn)中的核心步驟[2]。氧化作用、微生物作用及酶作用是煙葉發(fā)酵三大機理，且隨科技發(fā)展及研究深入，發(fā)現(xiàn)微生物在煙葉發(fā)酵中起著重要作用[2-3]，表現(xiàn)為微生物自身利用煙葉、微生物代謝產(chǎn)物作用于煙葉。不同研究者從不同煙葉表面分離的微生物種類存在差別，總體分為細菌、霉菌、放線菌及酵母菌4大類[3]，其中細菌占絕對優(yōu)勢，目前利用細菌促進煙葉發(fā)酵進而提升煙葉品質(zhì)，縮短發(fā)酵周期的研究逐漸增多[4-5]。

國內(nèi)雪茄外包皮煙葉發(fā)酵過程中的微生物研究已有報道[6]，但國內(nèi)雪茄外包皮煙葉與國外優(yōu)質(zhì)雪茄外包皮煙葉品質(zhì)差距較大，國內(nèi)外雪茄外包皮煙葉表面細菌種類差異還未見報道，且目前可用于雪茄外包皮煙葉發(fā)酵，改善煙葉物理特性的菌株較少?；谝陨蠁栴}，分析不同國家雪茄外包皮煙葉表面細菌種類，以及篩選菌株活性，對后期雪茄外包皮煙葉微生物發(fā)酵具有重要意義。本實驗對取自美國、巴西、多米尼加及中國4個國家的7個地區(qū)雪茄外包皮煙樣表面細菌利用常規(guī)分離方法進行分離鑒定，并對獲得菌株進行功能活性鑒定，以期獲得不同地區(qū)雪茄外包皮煙葉表面菌株的差異，并為篩選菌株在雪茄外包皮煙葉發(fā)酵中的應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 煙葉材料

煙葉材料來自4個國家，按其來源及地區(qū)不同將雪茄外包皮煙葉分別編號為：美國-1、美國-2、巴西-1、巴西-2、多米尼加、中國-1、中國-2。

1.2 細菌分離純化及活性鑒定培養(yǎng)基

1.2.1 分離及純化培養(yǎng)基 （1）牛肉膏蛋白胨培

養(yǎng)基為細菌篩選培養(yǎng)基。（2）煙葉培養(yǎng)基（補充培養(yǎng)基）：海南雪茄外包皮煙葉，高壓粉碎：煙葉粉末20 g/L（沸水中煮20 min），瓊脂15 g/L，自然pH，115 ℃高壓滅菌30 min。（3）LB固體培養(yǎng)基為純化培養(yǎng)基。

1.2.2 細菌功能活性分析培養(yǎng)基 蛋白酶活初篩培養(yǎng)基：酪蛋白水解圈法，參考文獻[7]中的培養(yǎng)基成分配制。果膠酶活初篩培養(yǎng)基：剛果紅染色法，參考文獻[8]中的培養(yǎng)基成分配制。纖維素酶活初篩培養(yǎng)基：剛果紅染色法，參考文獻[9]中的培養(yǎng)基成分配制。煙堿耐受菌株初篩培養(yǎng)基：利用含有煙堿的培養(yǎng)基[10]進行篩選。

以上所用試劑均為微生物培養(yǎng)常規(guī)試劑。

1.3 菌懸液制備及細菌分離培養(yǎng)方法

稱取煙樣1.0 g，置于含有50 mL 0.85%的無菌生理鹽水中，37 ℃恒溫搖床中振蕩60 min，獲得菌懸液，菌懸液梯度稀釋獲得涂布液：100，10-1，10-2，10-3，10-4五個梯度。將涂布液涂至篩選平板中，平板置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，48 h后根據(jù)菌落形態(tài)將菌株劃線至LB固體培養(yǎng)基中進行純化篩選。

1.4 篩選菌株活性測定

利用1.2.2中篩選培養(yǎng)基進行篩選鑒定。具體操作：將分離純化培養(yǎng)基中得到的細菌，分別點接至篩選培養(yǎng)基中，每個平板點接3個菌落，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后通過觀察篩選平板中透明圈，根據(jù)透明圈有無判定菌株的活性。

1.5 篩選菌株鑒定

初步根據(jù)細菌形態(tài)進行篩選，再利用16S rDNA序列測序比對進行分子鑒定。所用引物為16S rDNA通用引物：27F（5' to 3'）：AGAGTTTGATCCTGGCT CG；1492R（5' to 3'）：ACGGCTACCTTGTTACGA CTT。

細菌鑒定體系（表1）。PCR程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖電泳檢測，DNA片段大小符合理論大小PCR產(chǎn)物送至北京六合華大科技公司（http：//www.genomics.cn/index）測序，測序結(jié)果利用Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對獲得菌株的初步鑒定結(jié)果。

表1 細菌鑒定體系表

Table 1 Bacteria identification PCR system

PCR體系 PCR system 體積/?L

Volume/?L

引物27F Primer 27F（10 pmol/?L） 0.5

引物1492R Primer 1492R（10 pmol/?L） 0.5

模板 Template 0.5

DNA聚合酶 rTaq enzyme（2×mix） 10.0

蒸餾水 dd H2O 8.5

總體積 Total Volume 20.0

2 結(jié) 果

2.1 屬水平上7個地區(qū)雪茄外包皮煙葉表面細菌菌株的分離篩選

利用細菌篩選培養(yǎng)基，對4個國家7個地區(qū)雪

茄外包皮煙葉表面的易培養(yǎng)細菌進行分離鑒定，共篩選鑒定到100株細菌（表2），屬于不同細菌種屬，以芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬為優(yōu)勢細菌，芽孢桿菌屬共62株，葡萄球菌屬共22株。不同地區(qū)的雪茄外包皮煙葉表面細菌種類有差異：美國-1和美國-2雪茄外包皮煙葉表面細菌種類以芽孢桿菌屬為絕對優(yōu)勢微生物；其余煙樣中，除芽孢桿菌屬（Bacillus），葡萄球菌屬（Staphylococcus）也占較大比重，葡萄球菌屬是目前國內(nèi)雪茄煙葉發(fā)酵中首次報道的細菌種類。供試煙葉中，以美國-1和中國-2雪茄外包皮煙葉表面易培養(yǎng)細菌種類及數(shù)量較少，分別為6種和7種；其余供試雪茄外包皮煙葉表面易培養(yǎng)細菌數(shù)量相差較小。此外，在美國-2和中國-1煙樣中分離到少量不動桿菌；在巴西-1中得到少量泛菌屬；巴西-1、中國-1和中國-2中分離到蒼白桿菌屬；巴西-2中還分離得到少量短桿菌和類芽孢桿菌。

2.2 四個國家雪茄外包皮煙葉表面細菌功能活性

煙葉中的細胞壁物質(zhì)含量（如纖維素和果膠）對雪茄外包皮煙葉的物理性狀影響較大。分離到細菌的纖維素酶活、果膠酶活、蛋白酶活以及耐煙堿

表2 屬水平上7個地區(qū)雪茄外包皮煙葉表面細菌種類差異分析

Table 2 Diversity of surface bacteria of cigar wrapper at genus level in different regions

材料

Materials 菌株編號

No. 菌株種屬

Species of strain 材料

Materials 菌株編號

No. 菌株種屬

Species of strain

美國-1

America-1 1 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium 巴西-1

Brazil-1 1 葡萄球菌Staphylococcus sp.

2 芽孢桿菌Bacillus sp. 2 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

3 芽孢桿菌Bacillus sp. 3 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

4 短小芽孢桿菌Bacillus pumilusstrain 4 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

5 地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis 5 腐生性葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus

6 解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 6 腐生性葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus

美國-2

America-2 1 鮑氏不動桿菌Acinetobacter baumannii 7 雞葡萄球菌Staphylococcus gallinarum

2 鮑氏不動桿菌Acinetobacter baumannii 8 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium

3 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 9 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium

4 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 10 短小芽孢桿菌Bacillus pumilus

5 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 11 短小芽孢桿菌Bacillus pumilus

6 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 12 短小芽孢桿菌Bacillus pumilus

7 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 13 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis

8 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 14 嗜氣芽孢桿菌Bacillus aerophilus

9 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 15 芽孢桿菌Bacillus sp.

10 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 16 腸泛菌Pantoea intestinalis

11 解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 17 蒼白桿菌Aeribacillus pallidus

12 解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 巴西-2

Brazil-2 1 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

13 巨大芽孢桿菌Bacillus meqaterium 2 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

14 巨大芽孢桿菌Bacillus meqaterium 3 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

15 貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis 4 尼泊爾葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

16 貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis 5 尼泊爾葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

17 高地芽孢桿菌Bacillus altitudinis 6 松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri

18 短小芽孢桿菌Bacillus pumilus 7 貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis

19 特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis 8 貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis

表2 （續(xù)）

Table 2 （Continued）

材料

Materials 菌株編號

No. 菌株種屬

Species of strain 材料

Materials 菌株編號

No. 菌株種屬

Species of strain

9 高地芽孢桿菌Bacillus altitudinis 15 解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens

10 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium 16 阿耶波多氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai

11 短桿菌Brevibacterium sp. 17 不動桿菌Acinetobacter sp.

12 類芽孢桿菌Paenibacillus sp. 18 不動桿菌Acinetobacter sp.

中國-2

China-2 1 腐生性葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus 19 蒼白桿菌Aeribacillus pallidus

2 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium 多米尼加

Dominican 1 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

3 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium 2 阿爾萊葡萄球菌Staphylococcus arlettae

4 纖維微細菌桿菌Cellulosimicrobium sp. 3 尼泊爾葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

5 纖維化纖維微細菌Cellulosimicrobium cellulans 4 尼泊爾葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

6 蒼白桿菌Aeribacillus pallidus 5 尼泊爾葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

7 短小桿菌Curtobacterium sp. 6 尼泊爾葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

中國-1

China-1 1 尼泊爾葡萄球菌Staphylococcus nepalensis 7 科氏葡萄球菌Staphylococcus cohnii

2 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium 8 巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium

3 短小芽孢桿菌Bacillus pumilus 9 芽孢桿菌Bacillus sp.

4 短小芽孢桿菌Bacillus pumilus 10 芽孢桿菌Bacillus sp.

5 短小芽孢桿菌Bacillus pumilus 11 芽孢桿菌Bacillus sp.

6 芽孢桿菌Bacillus sp. 12 蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis

7 芽孢桿菌Bacillus sp. 13 解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens

8 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 14 阿耶波多氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai

9 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 15 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis

10 沙福芽孢桿菌Bacillus safensis 16 沙福芽孢桿菌Bacillus safensis

11 彎曲芽孢桿菌Bacillus flexus 17 蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus

12 彎曲芽孢桿菌Bacillus flexus 18 斯氏假單胞菌pseudomonas stutzeri

13 蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus 19 蒼白芽孢桿菌Ochrobactrum sp.

14 蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus 20 短短芽孢桿菌Brevibacillus brevis

活性測定結(jié)果顯示（表3），分別篩選到能分泌纖維素酶、果膠酶、蛋白酶及耐煙堿菌株24株、20株、22株及46株，共有7株芽孢桿菌同時具有所鑒定的4種功能活性。其中美國-2雪茄外包皮煙葉表面細菌的活性較全面，有5株芽孢桿菌同時具有4種功能活性；其他雪茄外包皮煙葉表面細菌活性鑒定結(jié)果活性較單一，尤其中國-2雪茄外包皮煙葉表面分離得到的細菌活性僅有4株具有耐煙堿活性，不具備其他所鑒定的活性；同一屬間細菌活性差異較大。菌株功能活性的鑒定對后期雪茄外包皮煙葉的微生物發(fā)酵提供了菌株，也為菌株的進一步利用提供了研究方向。

3 討 論

3.1 四個國家雪茄外包皮煙葉表面細菌差異

本實驗利用常規(guī)分離方法，對4個國家7個地區(qū)的雪茄外包皮煙葉表面細菌進行分離，細菌數(shù)量及種類存在差異，其中芽孢桿菌屬占比重最高，與杜佳等[11]的研究結(jié)果一致。但本研究中葡萄球菌數(shù)量所占比重較大，與目前報道的雪茄煙葉發(fā)酵中表面微生物種類有較大差異[11-12]：國內(nèi)雪茄煙葉發(fā)酵微生物表征中，均為芽孢桿菌，未見葡萄球菌的報道。該結(jié)果可能與煙株的生長環(huán)境、煙葉所處的發(fā)酵階段以及所采取的分離手段有較大關(guān)系，還可能由于芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬是該發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌株，易于分離。但由于樣品數(shù)量受限，不能全面反映國內(nèi)外雪茄外包皮煙葉表面細菌種類差異。

此外，本實驗利用常規(guī)分離方法對雪茄外包皮煙葉表面細菌進行分離存在較大局限性。自然界中可培養(yǎng)微生物僅占所有微生物的1%左右[13]，大量不可培養(yǎng)微生物在雪茄外包皮煙葉發(fā)酵中可能發(fā)揮重要作用。研究表明，陳化煙葉表面微生物種類和數(shù)量隨著陳化時間而改變[14]。目前煙葉發(fā)酵中關(guān)于微生物演替的研究方法有：常規(guī)分離方法、

表3 四個國家雪茄外包皮煙葉表面細菌功能活性差異比較

Table 3 Comparison of the function activity of surface bacteria in different cigar wrapper

材料

Materials 菌株編號

No. 菌株活性

Activity of strain 材料

Materials 菌株編號

No. 菌株活性

Activity of strain

纖維素酶活

Cellulase 果膠酶活

Pectase 蛋白酶活

Protease 耐煙堿

Tolerance to

nicotine 纖維素酶活

Cellulase 果膠酶活

Pectase 蛋白酶活

Protease 耐煙堿

Tolerance to

nicotine

美國?1

American?1 1 ? ? ? ? 10 ? ? ? ?

2 ? ? ? + 11 + ? ? +

3 ? ? ? ? 12 ? ? ? +

4 ? ? ? ? 小計Subtotal 3 0 2 8

5 + ? ? + 多米尼加

Dominican 1 ? + ? ?

6 + + + + 2 ? ? ? ?

小計Subtotal 2 1 1 3 3 ? ? ? ?

美國?2

American?2 1 ? ? ? + 4 ? ? ? ?

2 ? + + + 5 ? ? ? ?

3 ? + ? + 6 ? ? ? ?

4 + ? + + 7 ? ? ? ?

5 + + + + 8 ? ? ? +

6 + + + ? 9 ? ? ? +

7 + + + + 10 ? ? ? +

8 + + + + 11 ? ? ? ?

9 ? + + + 12 + ? ? ?

10 + + + + 13 ? + + +

11 + ? ? ? 14 ? ? ? ?

12 + + + + 15 ? + + ?

13 ? ? ? + 16 ? + ? ?

14 ? ? ? ? 17 ? ? ? ?

15 + + + ? 18 ? ? ? ?

16 + + + + 19 ? ? + +

17 ? + ? ? 20 ? ? ? ?

18 + ? ? ? 小計Subtotal 1 4 3 5

19 ? + + + 中國-1

China-1 1 + ? ? ?

小計Subtotal 11 13 12 13 2 ? ? ? +

巴西-1

Brazil-1 1 ? ? ? + 3 + ? ? ?

2 ? ? ? + 4 + ? ? ?

3 ? ? ? + 5 ? ? ? ?

4 ? ? ? ? 6 + ? ? ?

5 ? ? ? ? 7 ? ? ? ?

6 ? ? ? ? 8 ? ? + +

7 ? ? ? + 9 ? ? + +

8 ? ? ? + 10 ? ? ? ?

9 ? ? ? + 11 ? ? ? +

10 ? ? ? + 12 ? ? ? ?

11 ? ? ? ? 13 ? ? ? ?

12 ? ? ? ? 14 + ? ? ?

13 ? + + + 15 ? ? + +

14 ? ? ? ? 16 ? ? ? ?

15 ? ? ? ? 17 ? ? ? ?

16 ? ? ? ? 18 + + ? ?

17 ? ? ? ? 19 + ? ? ?

小計Subtotal 0 1 1 8 小計Subtotal 7 1 3 5

巴西?2

Brazil?2 1 ? ? ? ? 中國?2

China?2 1 ? ? ? +

2 ? ? ? + 2 ? ? ? +

3 ? ? ? + 3 ? ? ? +

4 ? ? ? ? 4 ? ? ? +

5 ? ? ? + 5 ? ? ? ?

6 ? ? ? + 6 ? ? ? ?

7 + ? + + 7 ? ? ? ?

8 + ? + + 小計Subtotal 0 0 0 4

9 ? ? ? ? 共計Total 24 20 22 46

注：“+”表示陽性，有酶活；“?”表示陰性，沒有酶活或酶活較小可忽略。Note：“+”positive； “?”negative， no enzyme activity or negligible.

DGGE[15]，限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)[16]等。利用上述方法對烤煙發(fā)酵前后煙葉表面細菌群落變化進行了深入研究，但關(guān)于雪茄煙葉表面細菌群落演替研究較少。16S rDNA高通量測序技術(shù)，在細菌群落演替及種類分析中具有較大優(yōu)勢[17-19]?？刹扇「咄繙y序與常規(guī)分離相結(jié)合的方法，對煙葉表面細菌多樣性進行更深入分析，以及對菌株種類進行更豐富的分離表征，以期對煙葉的微生物發(fā)酵機理及應用研究進行更深入研究。

3.2 篩選菌株活性測定結(jié)果分析

篩選細菌的酶活測定結(jié)果顯示，芽孢桿菌屬活性較全面，有7株同時具有所檢測的4種活性。目前煙葉微生物發(fā)酵中，研究集中在添加芽孢桿菌提升煙葉品質(zhì)[4]、降解煙葉成分以及煙葉增香提質(zhì)等[7，10，20]，芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵中發(fā)揮重要作用。此外，本實驗中分離得到較多葡萄球菌，但葡萄球菌的活性檢測結(jié)果較差。有研究報道葡萄球菌屬在臘肉香腸等發(fā)酵產(chǎn)香中發(fā)揮重要作用[21]。葡萄球菌代謝產(chǎn)生氨基酸，氨基酸與還原糖的美拉德反應是煙葉中香氣物質(zhì)的重要來源，葡萄球菌屬在煙葉中的研究對煙葉發(fā)酵可能具有重要意義。

4 結(jié) 論

利用微生物常規(guī)分離方法對4個國家雪茄外包皮煙葉表面細菌種類進行分離鑒定及活性分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)雪茄外包皮煙葉表面細菌種類及數(shù)量有差異，主要以芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬為主，且葡萄球菌屬是目前國內(nèi)雪茄煙葉研究中首次分離到的菌株。對分離細菌的功能活性分析結(jié)果顯示，同一屬間菌株的功能存在差別，芽孢桿菌屬酶活性較全面，其他種屬的細菌活性較差。本研究為雪茄外包皮煙葉的微生物發(fā)酵提供了菌株來源。

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