鈣粘蛋白多肽修飾的透明質酸水凝膠誘導牙本質—牙髓再生的研究

黃健萍 王君 林思恩

[摘要] 該研究利用牙髓間充質干細胞具有往牙本質-牙髓組織分化的潛能，結合新型生物材料擬鈣粘蛋白多肽修飾的透明質酸優(yōu)越的生物學活性，綜合運用細胞生物學和動物實驗手段，探討了此支架材料對人牙髓干細胞誘導為牙本質-牙髓組織的能力的影響。

[關鍵詞] 間充質干細胞；牙再生；水凝膠；生物材料；組織工程

[中圖分類號] R7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2018）03（c）-0162-02

保留有功能的牙髓或者促進牙髓再生對于復雜牙髓疾病的治療具有重要意義。隨著對組織工程學和再生醫(yī)學的深入研究，牙髓來源的干細胞與生物材料、誘導細胞生長或分化的相關因子進行復合為牙源性組織再生帶來了新的希望。該研究充分利用牙髓間充質干細胞（DPSCs）多向分化的潛能，以鈣粘蛋白多肽修飾的透明質酸（HA）水凝膠為載體，發(fā)揮 DPSCs 在牙本質-牙髓再生中的作用及新型生物材料HA的理想的組織相容性、生物降解性、良好的孔隙率和機械性能，為復雜牙髓疾病尋求新的治療手段，具有良好的應用前景。

1 方法

1.1 制備鈣粘蛋白多肽修飾的HA多孔水凝膠

配備1%透明質酸鈉（74kDa）溶液，加入94%甲基丙烯酸酐，調整pH至8.0，冰上反應24 h。以透析法將溶液中分子量大小為6～8 k的大分子單體進行純化。將鈣粘蛋白多肽（Ac-HAVDIGGGC）、亂序多肽（Scr， Ac-AGVGDHIGC）分別與親和素結合分子RGD（Ac-HAVDI GGGC）相連接。隨后與HA骨架在堿性磷酸鹽緩沖液于37℃過夜。以上材料混合致孔劑（PMMA）可以在紫外照射下以I2959催化交聯(lián)成2%水凝膠樣多孔支架結構。

1.2 牙髓間充質干細胞（DPSCs）的分離

牙齒完整拔出后沖洗消毒，無菌條件取出牙髓，D-Hanks液反復沖洗，剪成小塊，加入3 g/LⅠ型膠原酶和4 g/L dispase 消化1～1.5 h；直徑70 μm尼龍篩過濾成單細胞懸液，500 g/min 離心5 min，將細胞以含15%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液重懸后接種于塑料培養(yǎng)瓶。細胞生長接近融合時常規(guī)傳代，擴增培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.3 體外誘導條件水凝膠對DPSCs分化的影響

1.3.1 水凝膠對DPSCs成牙、成脂分化作用 制備鈣粘蛋白水凝膠二維涂層種植DPSCs，體外以成牙、成脂肪培養(yǎng)液培養(yǎng)。其中成牙誘導液組分為H-DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素、地塞米松1 nM、抗壞血酸50 μM和β-磷酸甘油20 mM，行茜素紅或堿性磷酸酶（ALP）染色。成脂誘導液組分為H-DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清、100 μ/mL青鏈霉素、地塞米松50 nM、異丁基甲基黃嘌吟0.5 mM、胰島素10 μg/mL和吲哚美辛50 μM，誘導后行油紅O染色。

1.3.2 水凝膠對DPSCs成神經(jīng)分化影響 鈣粘蛋白水凝膠二維涂層種植DPSCs，以含20%FBS及3 mmol/L巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液預誘導24 h，洗滌后換成二甲基亞砜（DMSO）和200 mmol/L丁化羥基苯甲醚（BHA）的DMEM培養(yǎng)液進行誘導。取培養(yǎng)48 h后行免疫熒光染色觀察DPSCs成神經(jīng)分化潛能，觀察中間絲（Nestin）表達水平。

1.3.3 Real Time PCR檢測水凝膠對DPSCs的成牙分化影響 成牙分化誘導7 d后，以Trizol提取總RNA。逆轉錄獲得cDNA后，參照Takara一步法，檢測Osterix（OSX）、I型膠原（Col 1a1）基因表達水平。

1.4 裸鼠體內(nèi)條件下水凝膠復合DPSCs的成牙髓分化效果

按上述體外實驗部分準備含鈣粘蛋白、亂序多肽及對照組水凝膠包裹DPSCs，細胞密度為2×107/mL。在特制的模具內(nèi)光交聯(lián)成型。在苯巴比妥鈉腹腔麻醉條件下，8周齡的裸鼠（n=12）背部皮下分別種植含有鈣粘蛋白多肽的水凝膠、亂序多肽修飾的水凝膠及對照組HA水凝膠。8周后，麻醉下處死裸鼠并取樣冰凍切片后作茜素紅和Von Kossa檢測。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 體外條件下水凝膠對DPSCs的成牙、成脂肪、成神經(jīng)分化的影響

經(jīng)成牙分化誘導液誘導后，鈣粘蛋白多肽組ALP和茜素紅染色均顯著增強；經(jīng)成神經(jīng)誘導后，免疫熒光檢測到鈣粘蛋白多肽組中間絲（Nestin）的表達較其它兩組顯著增強，見圖2。取RNA行RT-PCR分析提示，成骨分化指標OSX和Col1a1的表達量較對照組HA顯著增強（均P<0.01），見圖1。

2.2 裸鼠體內(nèi)水凝膠對DPSCs成牙分化的影響

各組三維水凝膠經(jīng)裸鼠體內(nèi)種植8周后，經(jīng)von Kossa染色和茜素紅染色結果發(fā)現(xiàn)，在每組水凝膠內(nèi)都有不同程度的鈣沉積，以鈣粘蛋白多肽組鈣沉積量最為顯著，見圖2。

3 討論

該研究探討了體內(nèi)和體外人牙髓干細胞在鈣粘蛋白多肽修飾的HA水凝膠條件下的牙本質-牙髓再生能力，結果提示，鈣粘蛋白多肽修飾的HA水凝膠可以作為牙髓間充質干細胞分化的理想支架，有助于牙本質-牙髓再生。

牙髓具有自我修復及再生能力，當牙髓組織受到外來刺激時，DPSCs 可遷移至牙髓暴露之處并取代退化的成牙本質細胞。DPSCs除了具有自我更新的能力之外，還具有多種分化潛能，包括成牙本質、成骨、成脂肪、成神經(jīng)及成血管內(nèi)皮的能力[1-2]。鈣粘蛋白是存在于細胞膜的一種跨膜蛋白，被認為是牙和骨發(fā)育過程中細胞-細胞聯(lián)接及間充質的緊密聚集的關鍵因子。有報道認為，如果將間充質干細胞（MSC）或者成骨細胞表面的 鈣粘蛋白用特定的抗體進行封閉，MSC 及成骨細胞的成骨能力均會受到顯著的抑制[3]。此外，還有研究報道鈣粘蛋白基因變異會導致骨髓來源 MSC 成骨功能受損，造成骨發(fā)育遲緩，并趨向成脂分化[4]。該研究中生物材料的原料透明質酸HA來源于自然資源提取物，與其他材料相比，HA 不僅在生物相容性和促進細胞增殖方面具有優(yōu)勢，而且其可控的物理機械性能及促進成骨分化特性使其在牙本質-牙髓再生組織工程領域具有很好的應用前景。

[參考文獻]

[1] Francisco-Javier Rodríguez-Lozano， Carmen-Luisa Insausti， Francisca Iniesta， et al. Mesenchymal dental stem cells in regenerative dentistr[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal，2012，17（6）：e1062-1067.

[2] Yang X， van den Dolder J， Walboomers XF， et al.The odontogenic potential of STRO-1 sorted rat dental pulp stem cells in vitro[J].J Tissue Eng Regen Med，2007，1（1）：66-73.

[3] Castro CH， Shin CS， Stains JP， et al. Targeted expression of a dominant-negative N-cadherin in vivo delays peak bone mass and increases adipogenesis[J].J Cell Sci，2004，117（Pt 13）：2853-2864.

[4] Di Benedetto A， Watkins M， Grimston S， et al. N-cadherin and cadherin 11 modulate postnatal bone growth and osteoblast differentiation by distinct mechanisms[J].J Cell Sci，2010，123（Pt 15）：2640-2648.

（收稿日期：2017-12-20）