瓶式平板培養(yǎng)制備稻曲病菌薄壁分生孢子

蒲相君　王忠文　張麗麗　張君成

摘要

利用三角瓶裝納馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基制備稻曲病菌薄壁分生孢子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瓶裝培養(yǎng)基的體積與產(chǎn)孢量無關(guān)。各菌株在瓶式培養(yǎng)平板上均能正常形成后代孢子。瓶式培養(yǎng)比常規(guī)培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)具有更高的產(chǎn)孢效率。產(chǎn)孢平板上產(chǎn)生的孢子收取后，菌落繼續(xù)培養(yǎng)，新形成的孢子數(shù)量大幅下降。由于三角瓶能高效避免污染，因而認為瓶式培養(yǎng)是制備稻曲病菌薄壁分生孢子的理想技術(shù)。

關(guān)鍵詞

稻曲病菌； 薄壁分生孢子； 產(chǎn)孢； 瓶式培養(yǎng)

中圖分類號：

S 432.1

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017323

Culture method with plate in flask for sporulation of thinwalled

conidia of Villosiclava virens

PU Xiangjun， WANG Zhongwen， ZHANG Lili， ZHANG Juncheng

（College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China）

Abstract

A culture method with potato agar plate in flask （flask method） for sporulation of thinwalled conidia of Villosiclava virens was established. The results indicated that no relations existed between conidial yield and medium volume of the potato agar inside the flask. Conidia of new generation were formed normally by the flask method for all isolates examined. Efficiency of sporulation cultured by plate in the flask was higher than that by plate inside a common dish. Conidial yield of new generation was decreased greatly when a plate colony was cultured repeatedly after the conidia were moved out. It was concluded that the flask method was an ideal technique for sporulation culture of thinwalled conidia of V.virens due to the high efficiency of sporulation as well as anticontamination.

Key words

Villosiclava virens； thinwalled conidia； sporulation； culture method with plate in flask

病原真菌的孢子在植物真菌病害的發(fā)生與流行中發(fā)揮重要作用，因而在植物病害研究中孢子的生長發(fā)育等生物學(xué)特征受到特別關(guān)注。在實驗室對孢子進行恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)，不僅能探索孢子的相關(guān)生物學(xué)特征，也能為研究工作提供直接的試驗材料。稻曲病是國內(nèi)外水稻生產(chǎn)的重大病害之一，其病原菌Villosiclava virens （Nakata） E. Tanaka & C. Tanaka可產(chǎn)生子囊孢子、厚壁分生孢子和薄壁分生孢子三種形態(tài)的孢子[12]。在田間該病菌可形成大量的厚壁分生孢子，也容易形成可發(fā)育產(chǎn)生子囊孢子的菌核，但在實驗室內(nèi)培養(yǎng)厚壁分生孢子存在相當(dāng)大的技術(shù)困難，也未見通過培養(yǎng)獲得具產(chǎn)孢能力菌核的報道。目前，通過培養(yǎng)較易獲得的是稻曲病菌的薄壁分生孢子，因而在稻曲病的有關(guān)研究中，使用的繁殖體材料主要是薄壁分生孢子[35]，即便如此，至今對薄壁分生孢子生長發(fā)育生物學(xué)的了解仍較為膚淺。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)稻曲病菌能產(chǎn)生大量的薄壁分生孢子，因而長期以來國內(nèi)外學(xué)者均習(xí)慣采用液體培養(yǎng)方法制備薄壁分生孢子[68]，并將該方法用于產(chǎn)孢基因或致病相關(guān)基因研究[910]。稻曲病菌在固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢特性很少被關(guān)注，也鮮有報道采用固體培養(yǎng)基制備薄壁分生孢子。作者在實際工作中發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌的薄壁分生孢子在PSA平板上萌發(fā)后，初期生長的菌絲可形成大量新一代孢子，培養(yǎng)5～6 d后可形成密集孢子的小菌落，然而小菌落不斷長出大量的非產(chǎn)孢菌絲，逐步將原來的產(chǎn)孢小菌落掩蓋，表現(xiàn)出平板培養(yǎng)具有初期小菌落產(chǎn)孢的特點。而薄壁分生孢子在馬鈴薯瓊脂（PA）平板上萌發(fā)，生長的產(chǎn)孢菌絲似乎可持續(xù)形成后代孢子，較少分化形成非產(chǎn)孢菌絲。長期以來，利用普通培養(yǎng)皿制備的平板進行病菌培養(yǎng)（皿式培養(yǎng)）幾乎是國內(nèi)外瓊脂平板培養(yǎng)的默認標(biāo)準(zhǔn)，很少有利用三角瓶裝納瓊脂進行固體培養(yǎng)（瓶式培養(yǎng)）的報道。試驗發(fā)現(xiàn)，瓶式培養(yǎng)稻曲病菌同樣能正常產(chǎn)孢，并表現(xiàn)出更高的產(chǎn)孢效率，有關(guān)的試驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

稻曲病菌菌株Uv34、Uv105、Uv108、Uv110、Uv111為廣西大學(xué)植物病理學(xué)實驗室保存菌株，均自南寧市普通生產(chǎn)稻田采集的稻曲球分離。

1.2 方法

1.2.1 移植用孢子懸浮液的制備

從試管斜面保存的各菌株材料中取少量菌絲團移入PS培養(yǎng)液（馬鈴薯100 g，蔗糖10 g，蒸餾水1 000 mL），置于搖床150 r/min、28℃培養(yǎng)7 d，然后用一層滅菌紗布過濾，除去菌絲體，將僅含孢子的液體離心沉淀，用無菌水將沉淀的孢子懸浮洗滌1次，重新離心收集沉淀，再用無菌水將孢子懸浮和稀釋，并用血球計數(shù)板檢測計數(shù)，最后用無菌水調(diào)配成濃度為106個/mL的孢子懸浮液，分裝于5 mL冷凍管，存于25℃恒溫箱備用。所用的5個菌株材料的備用孢子懸浮液的制備存貯時間不完全一樣。

1.2.2 瓶式培養(yǎng)平板的制備

用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基PA（馬鈴薯100 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL）作為產(chǎn)孢培養(yǎng)基，常規(guī)高溫高壓滅菌。用250 mL三角瓶裝納PA制成瓶式培養(yǎng)平板，除注明外，每瓶裝納30 mL。

1.2.3 菌體移植和產(chǎn)孢培養(yǎng)

于超凈工作臺上，將1.2.1制備的孢子懸浮液充分懸浮，用微量移液槍定量吸取孢子懸浮液，移植到1.2.2制備的瓶式培養(yǎng)平板上，用T形玻棒將孢子懸浮液均勻涂抹分散于平板面上，于28℃下恒溫培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)基體積對產(chǎn)孢量的影響

將20、40、60、80 mL PA培養(yǎng)基分別裝入250 mL三角瓶，制成瓶式培養(yǎng)平板，每個體積重復(fù)3瓶，統(tǒng)一植入菌株Uv110孢子懸浮液50 μL，28℃下產(chǎn)孢培養(yǎng)5 d后檢測后代孢子形成數(shù)量。

1.2.5 不同培養(yǎng)方式對產(chǎn)孢量的影響

按1.2.2方法制備瓶式培養(yǎng)平板，同時用直徑9 cm的培養(yǎng)皿制備常規(guī)培養(yǎng)平板。統(tǒng)一植入菌株Uv110孢子懸浮液80 μL，轉(zhuǎn)到28℃恒溫箱進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)5、10、20、40 d后檢測后代孢子形成數(shù)量，3個重復(fù)，比較瓶式培養(yǎng)與皿式培養(yǎng)的產(chǎn)孢量。

1.2.6 瓶式及培養(yǎng)皿培養(yǎng)的菌落再培養(yǎng)產(chǎn)孢表現(xiàn)

在瓶式培養(yǎng)平板及培養(yǎng)皿平板上分別植入菌株Uv111孢子懸浮液80 μL，轉(zhuǎn)到28℃恒溫箱進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，5 d后用無菌水及滅菌小毛刷洗滌、收集首次培養(yǎng)的后代孢子并檢測孢子數(shù)量，隨后，將瓶式培養(yǎng)平板及培養(yǎng)皿平板重新放入28℃恒溫箱進行第二次產(chǎn)孢培養(yǎng)，5 d后用同樣的方法洗滌、收集孢子，檢測孢子數(shù)量，并按同樣的方法進行第三次產(chǎn)孢培養(yǎng)，試驗重復(fù)3次。

1.2.7 不同菌株在瓶式培養(yǎng)平板上的產(chǎn)孢表現(xiàn)

在瓶式培養(yǎng)平板上分別植入菌株Uv34、Uv105、Uv108、Uv110、Uv111的孢子懸浮液100 μL，培養(yǎng)5 d后檢測后代孢子數(shù)量，每菌株重復(fù)2瓶，觀察不同菌株在瓶式培養(yǎng)中的產(chǎn)孢表現(xiàn)。其中菌株Uv111孢子懸浮液已貯存4 d，而菌株Uv34、Uv105、Uv108、Uv110的孢子懸浮液已貯存123 d。

1.2.8 孢子數(shù)量檢定

每瓶/皿平板加入無菌水15 mL，用小毛刷刷下平板表面的孢子，用血球計數(shù)板計數(shù)，每重復(fù)瓶/皿觀察80個中方格的孢子數(shù)，并換算成每毫升孢子液的孢子數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基體積對產(chǎn)孢量的影響

在三角瓶內(nèi)裝納不同體積的培養(yǎng)基進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，結(jié)果表明，20 mL瓶式培養(yǎng)平板上孢子產(chǎn)量明顯低于40、60、80 mL的處理，40、60、80 mL處理的孢子產(chǎn)量處于較高的水平，但3個處理之間差異不顯著（圖1），表明培養(yǎng)基達到一定體積后，增加培養(yǎng)基體積對產(chǎn)孢量沒有顯著影響。也暗示產(chǎn)孢量主要取決于平板面積，與平板厚度關(guān)系不大。后續(xù)試驗瓶裝量采用30 mL，既保證培養(yǎng)基具有一定的厚度，也利于平板面積最大化。

2.2 不同培養(yǎng)方式對產(chǎn)孢量的影響

稻曲病菌在瓶式培養(yǎng)和皿式培養(yǎng)兩種方式下分別培養(yǎng)5、10、20、40 d后測定產(chǎn)孢量，結(jié)果表明，盡管在相同時間點，瓶式培養(yǎng)與皿式培養(yǎng)的產(chǎn)孢量差異不顯著，但所測4個時點，瓶式培養(yǎng)的產(chǎn)孢量均高于皿式培養(yǎng)（圖2），體現(xiàn)出瓶式培養(yǎng)產(chǎn)孢較有優(yōu)勢。

2.3 瓶式及培養(yǎng)皿培養(yǎng)的菌落再培養(yǎng)產(chǎn)孢表現(xiàn)

首次培養(yǎng)5 d后，瓶式平板上形成的孢子數(shù)量達20.4×106個/mL，與皿式平板培養(yǎng)的產(chǎn)孢量差異顯著；洗脫并移去孢子，將培養(yǎng)瓶重新放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后，新形成的孢子數(shù)量只有2.7×106個/mL；重復(fù)洗脫、移去孢子后進行第3次培養(yǎng)，新形成的孢子數(shù)量減少到0.7×106個/mL（圖3）。皿式平板重復(fù)再培養(yǎng)測試結(jié)果與瓶式平板培養(yǎng)基本一致（圖3），表明產(chǎn)孢平板菌落重復(fù)培養(yǎng)再產(chǎn)孢，新形成孢子數(shù)量呈大幅減少的趨勢。

2.4 不同菌株瓶式培養(yǎng)的產(chǎn)孢表現(xiàn)

在瓶式培養(yǎng)平板上培養(yǎng)5 d后，5個菌株都能形成較多的后代孢子（圖4），說明稻曲病菌在瓶式培養(yǎng)平板上可普遍正常產(chǎn)孢。不同菌株后代孢子數(shù)量存在較大的差異是由于移植用的各菌株孢子貯備液中活性孢子數(shù)量不等，該差異反映的不是菌株的產(chǎn)孢能力差異。

3 討論

常規(guī)的平板產(chǎn)孢培養(yǎng)主要是采用培養(yǎng)皿，極少見有報道采用三角瓶裝納瓊脂平板的瓶式培養(yǎng)。本文用瓶式培養(yǎng)的方法進行稻曲病菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)測試的菌株均可正常產(chǎn)孢（圖4），對其中一個菌株進行4個時間段的產(chǎn)孢測試，瓶式培養(yǎng)的產(chǎn)孢量總是高于皿式培養(yǎng)的產(chǎn)孢量（圖2），考慮到瓶式平板面積（直徑為8 cm）比皿式平板面積（直徑為9 cm）更小，相對而言，瓶式培養(yǎng)表現(xiàn)出比皿式培養(yǎng)更高的產(chǎn)孢效率。三角瓶內(nèi)部的微環(huán)境可能比培養(yǎng)皿內(nèi)的環(huán)境更適宜產(chǎn)孢菌絲形成孢子。

當(dāng)前實驗室用的普通培養(yǎng)皿，其皿底與皿蓋間的縫隙可導(dǎo)致空氣交換及螨蟲出入通暢無阻，很容易造成培養(yǎng)污染及試驗失敗。目前主要的解決方法仍是利用Parafilm封口膜或其他膠膜將培養(yǎng)皿封口[1114]，該方法的實踐操作非常不便。而實驗室用的普通三角瓶，其瓶塞可阻濾普通微生物的通過，尤其是當(dāng)前已普遍使用硅膠橡皮塞，其阻濾效果更佳，因而三角瓶培養(yǎng)能高效避免污染。作者日常工作已采用三角瓶進行稻曲病菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其確能長期并高效避免污染。顯然，稻曲病菌的瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)相較于皿式培養(yǎng)具有較高的孢子產(chǎn)量，并且可防止污染，是薄壁分生孢子制備培養(yǎng)的理想方式，在需要獲得無污染孢子的試驗中，瓶式培養(yǎng)更突顯其實用價值。實際上，瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)還具另一特點，就是后期洗滌收集孢子的操作更為方便。

用水洗滌、收集孢子后，培養(yǎng)平板面上的殘液存在大量的孢子，這些殘留孢子具有萌發(fā)和生長發(fā)育形成新的產(chǎn)孢菌落的能力，在適宜溫度下再行培養(yǎng)，理應(yīng)可再產(chǎn)生大量的新一代孢子，但實際測試并非如此。本文瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)初始植入孢子液80 μL（濃度1×106個/mL），首次產(chǎn)孢培養(yǎng)5 d后，獲得的后代孢子液達到20.4×106個/mL（圖3），移出洗滌孢子懸浮液后，平板面上的殘留孢子液超過80 μL，這意味著第二次產(chǎn)孢培養(yǎng)的初始孢子數(shù)量超過首次培養(yǎng)初始孢子數(shù)量的20倍，但第二次產(chǎn)孢培養(yǎng)獲得的后代孢子數(shù)量為2.7×106個/mL，未達首次產(chǎn)孢培養(yǎng)獲得的后代孢子數(shù)量的1/7，皿式培養(yǎng)結(jié)果也類似（圖3），而作者另外的試驗發(fā)現(xiàn)，在瓊脂平板上孢子萌發(fā)并生長發(fā)育形成的新一代孢子的數(shù)量與初始植入的孢子數(shù)量呈正相關(guān)。顯然，在第二次產(chǎn)孢培養(yǎng)中，多數(shù)孢子不能正常萌發(fā)和形成新一代孢子，其原因值得關(guān)注。此現(xiàn)象也說明至今對薄壁分生孢子萌發(fā)及生長發(fā)育生物學(xué)的了解依然不夠。不過，從實踐工作角度看，本文結(jié)果表明用已收集孢子后的產(chǎn)孢平板菌落再行孢子制備培養(yǎng)，其實用價值不高。

本研究各菌株孢子貯備液的活性孢子數(shù)量不等，原因是各菌株備用孢子液的貯備時長各不相同。作者另外的試驗已經(jīng)明確，薄壁分生孢子在純水中可存活，但存活率隨貯存時間的延長而逐漸下降。因而盡管初始植入培養(yǎng)平板的貯備孢子液的體積相同，但具活力的孢子數(shù)量并不相同。

在培養(yǎng)基體積與產(chǎn)孢量的關(guān)系測試中，40、60和80 mL 3個處理之間差異不顯著，而20 mL處理比裝入40 mL以上處理的產(chǎn)孢量大幅減少（圖1），原因可能與試驗操作有關(guān)，因為三角瓶底內(nèi)部通常為曲凸面，裝入20 mL培養(yǎng)基時，中間部位的培養(yǎng)基較薄，收集后代孢子的刷洗操作容易破損培養(yǎng)基，因而采取輕刷洗滌的保守操作，進而造成菌落上的孢子洗脫不充分。因此，用三角瓶進行孢子的制備培養(yǎng)，裝入的培養(yǎng)基不宜過少。但考慮到培養(yǎng)基過多對提高產(chǎn)孢量并無明顯增益，卻大量消耗培養(yǎng)基，因而實際應(yīng)用采取裝入30 mL的折中處理，既保證培養(yǎng)基不易破損，也避免浪費。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）