小菜蛾MAP4K4基因上游5′—側(cè)翼序列克隆與結(jié)構(gòu)分析

郭樂 郭兆將 康師 孫丹 周君雷 龔莉君 張友軍

摘要 本實驗室前期研究表明，小菜蛾通過有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號途徑上游轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵基因MAP4K4反式調(diào)控多個中腸受體基因的表達，從而介導其對蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis（Bt）產(chǎn)生的Cry1Ac殺蟲蛋白的高抗性。為進一步明確MAP4K4基因轉(zhuǎn)錄激活而過量表達的順式調(diào)控機制，本文利用小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫中MAP4K4基因序列信息，首先克隆了Bt Cry1Ac敏感小菜蛾種群MAP4K4基因上游5′-側(cè)翼序列，得到了兩種不同形式的5′-側(cè)翼序列：MAP4K4-1和MAP4K4-2。隨后，預測分析了其中的潛在功能順式作用元件，同時發(fā)現(xiàn)其中核苷酸的轉(zhuǎn)換會導致順式作用元件的改變。本研究初步揭示了小菜蛾MAP4K4 基因的5′-側(cè)翼序列的遺傳多樣性，為后續(xù)明確MAP4K4的順式調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 小菜蛾； MAPK信號途徑； MAP4K4； 5′-側(cè)翼序列； 順式調(diào)控機制

中圖分類號： S 433.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017265

Abstract Our previous studies indicated that the crucial gene MAP4K4， a constitutive transcriptionally-activated upstream gene of MAPK signaling pathway， could trans-regulate the expression of multiple midgut receptor genes thereby mediating the high-level resistance to Bt Cry1Ac toxin in Plutella xylostella （L.）. In this study， to further clarify the cis-regulatory mechanism of transcriptional activation and overexpression of MAP4K4 gene， we utilized the genome database of P.xylostella and cloned the 5′-flanking sequence of MAP4K4 gene from Bt Cry1Ac-susceptible P.xylostella for the first time， and two isoforms including MAP4K4-1 and MAP4K4-2 were detected. Subsequently， the potential functional cis-acting elements in both MAP4K4-1 and MAP4K4-2 isoforms were predicted， and the results showed that the transformation between nucleotides could result in alterations of intrinsic cis-elements. This study revealed the genetic diversity of the 5′-flanking sequence of MAP4K4 gene in P.xylostella and lays a foundation for further exploration of the cis-regulatory mechanism of MAP4K4 gene in P.xylostella.

Key words Plutella xylostella； MAPK signaling pathway； MAP4K4； 5′-flanking sequence； cis-regulatory mechanism

小菜蛾P(guān)lutella xylostella （L.），屬于鱗翅目Lepidoptera菜蛾科 Plutellidae，是一種為害十字花科作物的世界性重大農(nóng)業(yè)害蟲，每年在世界范圍內(nèi)引起的經(jīng)濟損失高達40億～50億美元[1]。蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis （Bt）是一種革蘭氏陽性土壤細菌，其在產(chǎn)孢階段能產(chǎn)生多種殺蟲晶體蛋白（又稱δ-內(nèi)毒素），從而能高效專一地殺死多種田間重要害蟲且對人畜及環(huán)境安全無害。Bt制劑被認為是化學殺蟲劑的優(yōu)良替代品，目前，Bt制劑已成為世界上產(chǎn)量最大、用途最廣的微生物殺蟲劑[2]。1990年，首次報道了小菜蛾在田間對Bt噴灑制劑產(chǎn)生抗性[3]，隨后，它成為研究害蟲對Bt產(chǎn)生抗性的模式昆蟲之一。前期研究表明，小菜蛾對Bt產(chǎn)生高抗性的分子機制主要是由于其中腸Bt毒素受體的變化（突變或表達量變化）影響其與Bt毒素的結(jié)合導致的[4]。

近期，Baxter等通過遺傳圖譜定位的方法研究發(fā)現(xiàn)位于小菜蛾BtR-1抗性基因座內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因ABCC2序列突變導致小菜蛾NO-QA種群對Bt Cry1Ac毒素產(chǎn)生高抗性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，本實驗室小菜蛾對Bt Cry1Ac毒素的高抗性與中腸CAD基因和ABC轉(zhuǎn)運蛋白ABCH1基因無關(guān)[67]。本實驗室小菜蛾與NO-QA種群具有相同的BtR-1抗性基因座，因此，利用小菜蛾基因組和家蠶基因組的序列信息和染色體共線性關(guān)系成功組裝了小菜蛾約3.15 Mb的BtR-1抗性基因座，并通過一系列生化、分子生物學、遺傳學和生物信息學等技術(shù)最終在國際上首次發(fā)現(xiàn)小菜蛾對Bt的高抗性是由位于BtR-1抗性基因座內(nèi)的有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號途徑上游恒定轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵基因MAP4K4反式調(diào)控BtR-1抗性基因座內(nèi)外的ALP和ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因（ABCC2、ABCC3和ABCG1）表達下調(diào)導致的[89]。

1.3.4 MAP4K4基因5′-側(cè)翼區(qū)序列差異性及順式作用元件（cis-acting elements）預測及分析

利用Clustal Omega軟件（http：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）及GeneDoc 2.7進行多重序列差異性比較。將克隆成功的序列利用啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點分析網(wǎng)站BDGP（http：∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）進行轉(zhuǎn)錄起始位點預測，而后手動校正TATA box所在位置。利用順式作用元件預測網(wǎng)站PROMO（http：∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB=TF_8.3）和JASPAR（http：∥jaspar.genereg.net/）進行轉(zhuǎn)錄起始位點分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAP4K4基因組信息

基于GenBank中小菜蛾基因組數(shù)據(jù)以及自寫的Perl腳本信息，可知MAP4K4位于Scaffold NW_011952173.1上，基因編號為LOC105387010。MAP4K4的走向與鄰近基因的走向相反。截取的5 000 bp位于MAP4K4及鄰近基因之間，該片段除了涵蓋全部MAP4K4的5′-側(cè)翼區(qū)外，還包括了MAP4K4的部分近端編碼區(qū)以及臨近基因的小部分側(cè)翼區(qū)，保證了截取5′-側(cè)翼區(qū)的完整性（圖1）。

2.2 小菜蛾基因組DNA的提取

用整頭4齡小菜蛾幼蟲提取基因組DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性，結(jié)果表明，提取的單頭小菜蛾DNA濃度較高，部分樣品（MS1～MS7）電泳結(jié)果見圖2。用紫外分光光度計測定DNA的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，表明所有模板均可用來MAP4K4基因5′-側(cè)翼區(qū)的克隆。

2.3 引物篩選及MAP4K4的5′-側(cè)翼區(qū)序列截短

設(shè)計的6對引物中，前5對均能克隆出包含目的片段的條帶（圖3a），連接轉(zhuǎn)化后，菌液測序，結(jié)果表明，這些區(qū)域中存在高級結(jié)構(gòu)而無法測通。引物P′能成功克隆出3 250 bp左右的片段（圖3b），同樣，用啟動子預測網(wǎng)站進行分析，該區(qū)域已經(jīng)包含了MAP4K4基因的整個5′啟動子核心區(qū)、5′非翻譯區(qū)（5′-UTR）以及近端編碼區(qū)。

2.4 序列差異性分析

為了保證克隆結(jié)果的真實性，本試驗以10頭未區(qū)分雌雄的生長狀況好的小菜蛾4齡初期或中期幼蟲基因組DNA為模板，用引物P′-F/P′-R進行了大量的克隆及測序，得到了兩種不同形式的目的片段：MAP4K4-1和MAP4K4-2，它們與基因組序列的相似度分別為97.04%、77.58%。隨后又分別用1頭4齡雌蟲和1頭4齡雄蟲的基因組DNA為模板進行克隆，兩個樣本中均擴增出MAP4K4-2（表2）。測序結(jié)果表明，從未區(qū)分雌雄的10個樣本中共得到50條MAP4K4序列，其中從5個樣本中獲得28條MAP4K4-1序列，從5個樣本中獲得22條MAP4K4-2序列。從雌雄樣本中分別得到4條MAP4K4-2序列。MAP4K4-1和 MAP4K4-2分別占據(jù)總測序量的48.3%、51.7%。表明這兩種形式的MAP4K4的 5′-側(cè)翼區(qū)在試驗小菜蛾種群中趨向于均勻分布，且與雌雄無關(guān)。

2.5 MAP4K4的5′-側(cè)翼區(qū)順式作用元件分析

MAP4K4-1及MAP4K4-2與基因組序列相互比較發(fā)現(xiàn)，后兩者之間具有明顯差異，MAP4K4-2中間插入了260 bp的長片段。經(jīng)轉(zhuǎn)錄起始位點預測網(wǎng)站分析，三者的轉(zhuǎn)錄起始位點為同一個胸腺嘧啶T（圖4）。TATA box位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游48-38 bp，序列為TATAAATTAA。5′-UTR區(qū)長83 bp，說明長片段的插入未改變MAP4K4基因的轉(zhuǎn)錄起始位點。利用多重序列比較，對MAP4K4基因5′-側(cè)翼的基因組數(shù)據(jù)24個位點進行了校正，分別為18個突變位點，5個缺失區(qū)以及1個插入位點（圖4）。MAP4K4-1與基因組序列及MAP4K4-2相比，存在27個差異位點。MAP4K4-2與MAP4K4-1及基因組序列比較，除了1個大片段的插入之外，還存在21個差異位點。

MAP4K4-1及MAP4K4-2的順式作用元件分析后，保留MAP4K4-2中與MAP4K4-1存在位點差異順式作用元件。結(jié)果顯示，在這些差異位點中，MAP4K4-1丟失了16個順式作用元件，而MAP4K4-2引入了21個新的元件。其中在長片段插入?yún)^(qū)，引入的12個順式作用元件中有5個為Mad元件（圖4），該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點在該區(qū)域出現(xiàn)富集的現(xiàn)象。5′-UTR區(qū)沒有位點變化。這表明，位點的突變、插入和缺失可能導致順式作用元件的改變和丟失，同時也可能引入新的順式作用元件，且一個位點的改變甚至能引入多個順式作用元件。

3 討論

MAPK信號途徑是一個十分復雜而且龐大的調(diào)控網(wǎng)絡。多年來，盡管MAPK信號途徑在人類等哺乳動物中得以廣泛研究，但是它目前仍是醫(yī)學研究領(lǐng)域的熱點及難點，而這一重要信號途徑的上游關(guān)鍵基因MAP4K4在哺乳動物以及包括昆蟲在內(nèi)的無脊椎動物中研究甚少。研究表明，位于MAPK信號途徑上游的MAP4K4基因在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans和果蠅Drosophila spp.等物種中發(fā)揮著重要的生理功能[1618]。在Bt研究領(lǐng)域，MAPK信號途徑已被證實參與了線蟲和昆蟲對Bt毒素的免疫防御反應調(diào)控[1923]。

研究發(fā)現(xiàn)，MAPK途徑可以調(diào)控哺乳動物ALP[2426]以及人類ABCC基因表達量[23，2729]，而本實驗室郭兆將等也首次研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號途徑可以調(diào)控小菜蛾中腸ALP和ABCC基因表達量從而導致小菜蛾對Bt產(chǎn)生高抗性，而這一調(diào)控過程中MAP4K4基因在Bt抗性小菜蛾中過量表達發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用[6]。目前，基因調(diào)控研究主要集中在啟動子區(qū)的順式作用元件（cis-acting elements）及下游包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的反式作用元件（trans-acting elements）的研究。為進一步了解MAPK信號途徑中MAP4K4基因在Bt敏感和抗性小菜蛾中的調(diào)控模式，本文對該基因的5′-側(cè)翼區(qū)進行了解析。利用小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫序列信息，克隆了Bt Cry1Ac敏感種群DBM1Ac-S的MAP4K4 基因5′-側(cè)翼區(qū)序列，與基因組原始序列相比，得到了兩種不同形式的側(cè)翼區(qū)序列MAP4K4-1及MAP4K4-2，它們基因組序列的相似度分別為97.04%、77.58%，測序結(jié)果表明，兩種形式的側(cè)翼序列在試驗種群中趨向均勻分布，且與雌雄無關(guān)。MAP4K4-1與基因組序列的差異主要集中在小位點的突變、插入和缺失，MAP4K4-2則主要為中間260 bp長片段的插入。此外，兩種形式的序列與基因組數(shù)據(jù)比較后，對基因組MAP4K4 的5′-側(cè)翼序列24個位點進行了校正。利用啟動子預測及順式作用元件預測軟件對克隆的序列進行分析可知，一個位點的改變會引起原有順式作用元件的消失，同時也可能引入一個或者多個新的順式作用元件，而在MAP4K4-2插入的長片段中，則出現(xiàn)了Mad轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的富集。

目前，DNA側(cè)翼序列的生物學功能，尤其是對基因的表達調(diào)控機制，是功能基因組學的研究熱點?；蚪M中大量的DNA非編碼序列都有某些特殊的功能[30]，非編碼區(qū)中分布著許多功能元件，它們有些可作為順式調(diào)節(jié)元件發(fā)揮作用[31]?；?′-側(cè)翼區(qū)核苷酸的突變引起順式作用元件的變化，從而調(diào)控基因在同一物種或不同物種時空表達發(fā)生差異[32]。

Mad（max dimerization protein）屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix， bHLH）蛋白家族B亞族成員[33]。在小鼠中，該家族有4個成員，包括Mad1、Mxi1（max interactor 1）、Mad3和Mad4。它們均能與轉(zhuǎn)錄因子Max形成二聚體，阻遏細胞增殖循環(huán)[34]，或者阻止啟動子中含有CACGTG位點的基因轉(zhuǎn)錄[35]。而線蟲僅有1個Mad家族成員，即Mdl-1（mad like 1），它能與Max家族的Mxl-1形成二聚體，在線蟲胚胎發(fā)育后期發(fā)揮著重要作用[36]。果蠅中未發(fā)現(xiàn)該家族成員[36]。目前在小菜蛾中未報道過Mad家族的作用機制及其功能。MAP4K4-2中長片段的插入中產(chǎn)生的多個Mad結(jié)合位點，是否同樣參與了相關(guān)功能仍是未知的。同時，該基因中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點在調(diào)控小菜蛾MAPK信號途徑下游基因的表達中的作用也值得重視。

總之，本文基于本實驗室前期MAPK4K4基因的研究基礎(chǔ)，對小菜蛾MAP4K4發(fā)揮調(diào)控功能的5′-側(cè)翼區(qū)進行了解析，明確了基因突變、插入和缺失引起的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的改變情況，為進一步研究MAP4K4基因在小菜蛾Bt抗性種群中過量表達的順式調(diào)控機制提供了良好的實驗基礎(chǔ)，為研究昆蟲順式作用元件突變在進化過程中的作用提供借鑒，這也為全面理解MAPK信號途徑在小菜蛾乃至其他昆蟲的Bt抗性調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

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（責任編輯：田 喆）