火炬樹枯枝病病原菌鑒定

賈含琪 劉忠玄 陳潔 周儀 董愛榮 劉雪峰

摘? 要：【目的】確定引起火炬樹枯枝病的病原種類，為針對性地防治枯枝病提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎杉l(fā)病階段植物標(biāo)本，對病原菌進(jìn)行分離、純化、致病性測定以及形態(tài)特征觀測、rDNA-ITS序列分析，對病原菌種類進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】經(jīng)單孢分離后，所獲得的菌株對火炬樹枝條可致病，并產(chǎn)生典型癥狀，通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)其載孢體生于皮層下，成熟后子座外露，三角形或燒瓶狀，分生孢子器暗色，埋生，后突起，有孔;分生孢子單孢、無色， 有兩個類型，紡錘形（α分生孢子）和線狀、筆直或折曲柄（β 分生孢子）。對比相關(guān)資料病原菌的分生孢子及分生孢子器的大小和形態(tài)與漆樹擬莖點霉（Phomopsis rhois）一致，以本菌株DNA為模板，擴(kuò)增得到全長為552 bp的DNA 片段，并獲得該菌的rDNA-ITS 序列，發(fā)現(xiàn)其與擬莖點霉（Phomopsis sp）的相似性高達(dá)100%?！窘Y(jié)論】通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，引起火炬樹枯枝病的病原菌為漆樹擬莖點霉Phomopsis rhois，火炬樹為P. rhois國內(nèi)新寄主。

關(guān)鍵詞：火炬樹;枯枝病;病原菌;漆樹擬莖點霉

中圖分類號：S763.15;S482.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-8023（2018）06-0020-05

Pathogen Identification of Rhus typhina Stem Blight Disease

JIA Hanqi， LIU Zhongxuan， CHEN Jie， ZHOU Yi， DONG Airong， LIU Xuefeng*

（College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040）

Abstract： The species of pathogen causing the Rhus typhina stem blight disease were identified to provide a theoretical basis for controlling the disease. Infested branches specimens at developing stages were collected. The pathogens were isolated， purified， pathogenicity tested. After observing morphological characteristics and analyzing rDNA-ITS sequences， the pathogen species were identified. Strains obtained by isolating single spore could cause disease to the Rhus typhina and produce typical symptoms. Microscopic observation revealed that conidiomata was born under the bark layer. When it matured， it would expose out of stroma， showing a triangle of flask shape. At the beginning， pycnidium was dark and immersed， and then it was protuberant and had ostiole. Conidia was one celled and transparent， with two types of fusoid （α conidia） and curved or bent stylospores （β conidia）. Comparing the relevant data， the size and morphology of the pycnidium and conidia of the pathogen were consistent with Phomopsis rhois. The DNA of strain was used as a template， and one rDNA-ITS fragment of 552 bp was amplified. Its similarity to Phomopsis sp. was found to be as high as 100%. The results of morphological and molecular identification showed that Phomopsis rhois was the pathogen causing Rhus typhina stem blight disease and the Rhus typhina was the new host of P. rhois.

Keywords： Rhus typhina; stem blight disease; pathogens; Phomopsis rhois

0 引言

火炬樹（Rhus typhina L.），又名鹿角漆，為漆樹科鹽膚木屬落葉小喬木[1]。原產(chǎn)于北美，在20世紀(jì)50年代，作為觀賞植物被中國科學(xué)院植物研究所引種到北京，由于火炬樹可作為荒山綠化及鹽堿荒地風(fēng)景林樹種[2-3]而被人們關(guān)注并逐漸推廣至全國各地，漸漸地人們發(fā)現(xiàn)其廣泛的用途?；鹁鏄涓Y能力強(qiáng)，易栽培[4-5]，通過根蘗繁殖可以建立種群[6]，被認(rèn)為是水土保持的優(yōu)良樹種[7]，成活率高，適應(yīng)性強(qiáng)，因此具有很好的護(hù)坡效果[8]。由于其油脂少不易燃燒，也可以起到防火作用[9-10]。樹皮、樹葉含有大量單寧[11]，葉還可以提取栲膠[12]，樹皮可入藥，種子含油蠟，可以制造蠟燭等工業(yè)原料[13]。由于該樹種適應(yīng)能力強(qiáng)，抗病性也較強(qiáng)，為此關(guān)于火炬樹病害類文章報道的較少，國內(nèi)韓冰一[14]記載了由變殼孢（Hendersonula sp.）引起的火炬樹枯枝病、裂褶菌引起的腐朽病和鏈格孢（Alternaria sp.）引起的火炬樹葉斑病。

擬莖點霉屬[Phomopsis（Sacc）Bubak]是半知菌亞門（Deuteromycotina）、腔孢綱（Coelomycetes）、球殼孢目（Sphacropsidales）中的真菌屬、有性態(tài)是間座殼屬（Diaporthe）[15-16]。1882年，P.A.Saccardo首次提出Phomopsis，僅看作是莖點霉（Phoma）屬下的非特定分類等級[17]。在1980年，Suton B.C在其專著中確定其屬的定界[18]，在1988年，Uecker搜集其7 800多個種及亞種的資料匯編成書。在1905年，Bubak將其用于屬級水平，作為獨立屬的屬名由此延用至今[18]。近年來，姜子德采用的RAPD以及核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析這兩種技術(shù)均可對擬莖點霉屬種類進(jìn)行鑒定[19-20]。其分布廣泛，熱帶及亞熱帶種類較多，主要為害被子植物及裸子植物，有時侵染苔蘚和蕨類植物，引起潰瘍、爛莖、果腐、葉枯、枝枯、根腐、樹皮壞死等多種癥狀 [18]。本文則介紹了以Phomopsis rhois為病原菌的火炬樹枯枝病，是火炬樹生產(chǎn)中最主要的病害之一，可為害枝條，潛伏期較短，爆發(fā)性強(qiáng)，造成火炬樹樹勢衰弱及枯死。

為了該病的防治和進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，通過病害癥狀、病原菌的形態(tài)學(xué)、致病性測定及rDNA-ITS區(qū)序列分析，明確火炬樹枯枝病病原菌為Phomopsis rhois，國內(nèi)未有記載，為國內(nèi)新病害。

1 研究方法

1.1 病樣采集

2017年4-5月從東北林業(yè)大學(xué)林場進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，觀察火炬樹枯枝病的癥狀特點，采集具有典型癥狀的發(fā)病標(biāo)樣，用塑料袋密封并帶回實驗室及時分離。

1.2 方法

1.2.1 病害癥狀觀察

取火炬樹枯枝病病害標(biāo)本，利用實體解剖鏡觀察發(fā)病部位的癥狀特征。

1.2.2 病原菌的分離培養(yǎng)

將帶有分生孢子器的枝條用75%的酒精消毒2 ～ 3 s，切取病部帶有分生孢子器的組織5 mm×3 mm，在超凈工作臺下接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行病菌分離，放入培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長到適當(dāng)大小，分離不同的菌落于PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化[22]，觀察各子實體的形態(tài)特征，各分離物接種于PDA 斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行保存留以備用。

1.2.3 致病性測定

按照柯赫氏法則，采集健康的火炬樹枝條室內(nèi)水培，進(jìn)行針刺、燒傷和無傷接種。刺傷接種時，用滅菌針刺傷至木質(zhì)部，燒傷接種時，用酒精燈燒傷枝條表皮，大約5s聽到滋滋的響聲。純菌種接入PDA液體培養(yǎng)基中，放入25 ℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右至搖培出菌絲體，用紗布蘸取菌絲體液體2 ml覆蓋在刺傷、燒傷、無傷傷口的枝條各15株，用紗布蘸取2 ml的無菌水覆蓋在枝條的刺傷、燒傷、無傷傷口處上，各5株設(shè)為對照實驗組，接種后在覆蓋有紗布的接種處套袋保濕48 h。將接種后的枝條室溫培養(yǎng)，作好標(biāo)記，觀察發(fā)病癥狀變化情況。發(fā)病后從病斑上再分離、純化菌株。

1.2.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

（1）取野外以及新接種的發(fā)病枝條，徒手切片制作水載玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌分生孢子器、分生孢子梗、分生孢子的形態(tài)，利用電子顯微鏡觀察、測量數(shù)據(jù)大小、拍攝顯微圖片。

（2）病原菌菌落觀察：將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，放于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫并黑暗條件下培養(yǎng)，每日觀察并記錄菌落形態(tài)、顏色和生長速率等特征。

1.2.5 r DNA-ITS 的 PCR 擴(kuò)增與序列分析

（1）病原菌DNA 的提?。簩⒉≡杲臃N于PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d，挑取直徑為5 mm大小的菌絲塊5塊于PD培養(yǎng)液中，在25 ℃、

150 r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，收集菌絲體。采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司），按照使用說明書提取基因組DNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）rDNA-ITS 序列擴(kuò)增：選用真菌擴(kuò)增的通用正向引物ITS1 （5 ′ -TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3 ′）和反向引物ITS4（5 ′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ′）擴(kuò)增。反應(yīng)在25μL體系中進(jìn)行，包括：1μLdNTPs（2.5mmol/L），0.2μLTaq酶（5U/μL），2.5μL10×PCR buffer，0.5μL primer ITS1（10μmol/L），0.5μL primer ITS4（10μmol/L），0.5 μL（約20 mg/L）基因組DNA，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃

下保存。反應(yīng)結(jié)束后，取μLL擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（3）測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)回收目標(biāo)DNA片段由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

（4）測序結(jié)果分析：測序結(jié)果用BLAST程序與NCBI中的核酸序列進(jìn)行同源性分析比較，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定來確定病原菌的種類和分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性測定

燒傷接種15株，其中13株感染病癥，發(fā)病率為86%，刺傷接種15株，均無感病。此時的發(fā)病狀態(tài)與自然發(fā)病狀態(tài)相同，對接種枝條發(fā)病部位進(jìn)行病菌再分離，分離的菌株與原枝條分離得到菌株的培養(yǎng)形狀和形態(tài)特征一致。如圖1所示。

2.2 火炬樹枯枝病癥狀

火炬樹枯枝病主要發(fā)生在枝條上，接種此病害后的枝條上嫩綠的葉片從葉片周邊向葉基漸漸轉(zhuǎn)至黃色，直至干枯，脫落，樹勢整體衰弱。接種20d時可觀察到燒傷接種部位周邊出現(xiàn)丘狀突起，為病原菌的分生孢子器，嫩葉枯黃，當(dāng)其遇水或空氣潮濕的條件時，病枝突起處膨脹不規(guī)則開裂，露出埋生黑色的表面不光滑的分生孢子器。后期枝條枯死變?yōu)榛液稚?/p>

2.3 病原菌形態(tài)特征

載孢體為真子座，生于皮層下，散生，初埋生，成熟后突起，三角形或燒瓶狀，有孔口，孔口直徑約為96.6 μm、單腔。分生孢子器內(nèi)壁接有無色的分生孢子梗，分隔，合軸分枝，大小為（10.0 ～ 20）μm×（1.8 ～ 2.4） μm。甲型分生孢子，無色，單孢，紡錘型，孢子兩端有兩個大油球，（6 ～ 10） μm×（1.8 ～ 2.0） μm。乙型分生孢子無色，單孢，線狀、筆直或彎曲或折曲柄，（13 ～ 20）μm×（0.9 ～ 1.2） μm。

2.4 病原菌的菌落形態(tài)

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d左右菌落為白色絨毛狀，從接種點開始逐漸向周邊生長，自然光培養(yǎng)15 d左右，接種點周圍的菌落產(chǎn)生色素，菌落白色絨毛的背面漸變成墨綠色呈放射型散亂分布在平板周邊，自然光培養(yǎng)20d左右，白色菌落背面顏色漸深呈灰褐色的不規(guī)則同心環(huán)，有黑色分生孢子器出現(xiàn)，多個分生孢子器成簇狀生長，周圍比較干燥。

2.5 rDNA-ITS 序列分析

從菌株HJ-1提取DNA基因，通過真菌通用引物ITS1、ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到HJ-1菌株的rDNA-ITS序列，長度為552 bp。將所測得的rDNA-ITS序列在NCBI的BLAST進(jìn)行比對，菌株HJ-1與擬莖點霉（Phomopsis sp.）相比較覆蓋度均為100%、相似度為99%，菌株HJ-1應(yīng)屬于擬莖點霉屬真菌。由于本種與Uecker（1988）、馬莉（2004），描述的漆樹擬莖點霉（Phomopsis rhois）特征基本一致[22-23]，因此在NCBI 基因庫中對Phomopsis rhois 的rDNA-ITS序列進(jìn)行搜索，未搜索到本種序列，證明Uecker（1988）、馬莉（2004）并未在NCBI基因庫中上傳本種的rDNA-ITS序列，因此本文將火炬樹枯枝病病原菌HJ-1的序列在GenBank上進(jìn)行注冊，獲得登記號為 MH050404.1。

3 結(jié)果與討論

本研究通過對火炬樹枯枝病枝條進(jìn)行病原菌的分離、純化、接種及再分離，確定了致病菌株：根據(jù)分生孢子器的基本形態(tài)、分生孢子的大小和菌落生長速度、菌落形態(tài)、色素產(chǎn)生情況與相關(guān)資料[23-24]比對，證明本病原菌屬于漆樹擬莖點霉（Phomopsis rhois）。分子生物學(xué)鑒定該菌種序列與Phomopsis sp.相似度為99%，如圖2所示。進(jìn)一步證明支持了形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果。據(jù)國外文獻(xiàn)[22]報道其寄生于漆樹科的Rhus toxicodendron、Rhus cotinus、Rhus typhina。據(jù)國內(nèi)文獻(xiàn)[23]報道其寄生于野漆樹（Rhus succedanea L）的枝條上。根據(jù)資料[22] 記載其分生孢子梗為25μm×1μm，甲型分生孢子為10 μm×（2.0 ～ 2.5） μm，并未記錄乙型分生孢子，與標(biāo)本HJ-1稍有差異。根據(jù)資料[24]記載其分生孢子梗為（10.0 ～ 20.1）μm×（1.8 ～ 2.4） μm，甲型分生孢子為（6.0～9.9）μm×（1.8 ～ 2.0） μm，同時，馬莉（2004）在野漆（Rhus spp .）上記載的漆樹擬莖點霉（P. rhois）在標(biāo)本上未觀察到乙型分生孢子[23]，僅在苜蓿煎汁+ Czapek培養(yǎng)基（25 ℃）上發(fā)現(xiàn)了乙型分生孢子[24]，大小為（13 ～ 20）μm×（0.9 ～ 1.2 ）μm，與標(biāo)本HJ-1幾近一致。本病原菌不僅在自然發(fā)病枝條上，而且在人工接種的發(fā)病枝條上以及人工培養(yǎng)基上均發(fā)現(xiàn)了這兩種分生孢子的存在。推測這些差異與其分布地區(qū)及培養(yǎng)條件相關(guān)，根據(jù)其主要形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定為漆樹擬莖點霉（Phomopsis rhois），在我國未見火炬樹Rhus typhina的本種病原菌相關(guān)報道，而火炬樹為P. rhois國內(nèi)新寄主。雖然火炬樹用途廣泛但是由于其繁殖較快，根系堅定可以穿透水泥，易對市區(qū)內(nèi)地下管網(wǎng)及建筑產(chǎn)生危害，亦屬于外來物種，因此一般栽種于荒山等地，并不適宜市區(qū)內(nèi)的綠化，而本病原菌作為火炬樹的主要病害之一，可以有效控制火炬樹在市區(qū)內(nèi)大規(guī)模的繁殖和生長。另外關(guān)于該病原菌的流行規(guī)律需要深入調(diào)查，對防治該病原菌的藥劑仍需要進(jìn)一步研究。

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