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    一種煙草細(xì)菌性病害病原菌分離培養(yǎng)及致病性測定

    2016-12-17 21:39蔣承耿瞿鴻飛王忠宇
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年11期
    關(guān)鍵詞:致病性病原菌煙草

    蔣承耿+瞿鴻飛+王忠宇

    摘要:從貴州六盤水煙區(qū)采集感病煙株,采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離純化,并將培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,以南江3號煙草品種為試材,進(jìn)行病原菌致病性測定。結(jié)果表明,該菌培養(yǎng)最適NaCl濃度4%,葡萄糖濃度10%,pH值5~7,培養(yǎng)溫度25~30℃,最佳侵染溫度20~25℃,相對濕度70%以上,該病害應(yīng)屬于中溫高濕侵染病害。

    關(guān)鍵詞:煙草;病原菌;分離培養(yǎng);致病性

    中圖分類號:S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2016)11-0072-04

    Abstract The isolation and purification of pathogen of a tobacco bacterial disease was conducted from tobacco-growing areas in Liupanshui of Guizhou Province using the issue separation method. Its culture conditions were optimized, and the pathogenicity was measured with Jiangnan 3 as material. The results showed that the optimum growth conditions of this pathogen were 4% of salt concentration, 10% of sugar concentration, 5 to 7 of pH value, and 25~30℃ of cultivation temperature. And the best infesting conditions of this pathogen were 20~25℃ of infesting temperature, and more than 70% of relative humidity. Thus, the disease was easy to infection under middle temperature and high humidity conditions.

    Keywords Tobacco; Pathogen; Isolation and culture; Pathogenicity

    煙草作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,其產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展得到廣泛關(guān)注[1]。而煙草細(xì)菌性病害是威脅煙草生產(chǎn)的主要病害之一,其發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重,嚴(yán)重影響著煙草的質(zhì)量和產(chǎn)量,進(jìn)而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益極大受損。已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌性病害有青枯病、細(xì)菌性角斑病、野火病、空莖病、細(xì)菌性黑桿病等[2-8]。余磊等于2004年報(bào)道了云南文山州西疇縣和保山市昌寧縣發(fā)現(xiàn)1種由細(xì)菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)侵染引起的煙草新病害[1]。2007年,筆者在貴州省盤縣煙區(qū)忠義、保田發(fā)現(xiàn)一種煙草未知病害,該病害在忠義鄉(xiāng)開始零星發(fā)生,主要為害煙株中下部葉片葉柄,造成葉片呈水浸狀腐爛,發(fā)病嚴(yán)重時(shí),煙株中下部莖稈與葉柄連接處開始出現(xiàn)水浸狀斑點(diǎn),最后呈潰瘍狀腐爛,2009年發(fā)生面積達(dá)60多公頃,重病田塊病株率達(dá)100%,嚴(yán)重田塊造成絕收,2010年發(fā)生面積增大,有逐漸蔓延趨勢,嚴(yán)重制約著該地區(qū)烤煙生產(chǎn)。本試驗(yàn)對該病的病原菌進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化及致病性測定,以明確其生物學(xué)特性,為病害防治提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試煙草品種 從盤縣忠義發(fā)病煙田采回發(fā)病煙葉及莖稈(品種:南江3號),室內(nèi)接種鑒定品種南江3號。

    1.1.2 主要試劑 牛肉膏 (北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司); 蛋白胨 (北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠);瓊脂 (福建莆田市聯(lián)邦瓊脂有限公司); NaCl (重慶川江化學(xué)試劑廠)。

    1.1.3 培養(yǎng)基配方 NA培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g,NaCl 5.0 g,蛋白胨 10.0 g,瓊脂 20.0 g,pH 6.8~7.0,加水定容到1 000 mL,121℃濕熱滅菌20 min。

    JNFb培養(yǎng)基:DL-蘋果酸5 g·L-1、K2HPO4 0.6 g·L-1,KH2PO4 1.8 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1,NaCl 0.1 g·L-1,CaCl2·H2O 0.2 g·L-1,F(xiàn)eEDTA 0.066 g·L-1,溴香酚藍(lán)指示劑2 mL,微量元素2 mL,KOH 4.5 g·L-1,pH 5.8,固體培養(yǎng)基加入瓊脂17 g。微量元素成分如下:Na2MoO4·2H2O 0.2 g,MnSO4·H2O 0.235 g,H3BO3 0.28 g,CuSO4·5H2O 0.008 g,ZnSO4·7H2O 0.024 g,溶于200 mL蒸餾水中。

    1.2 病原菌的分離純化

    病原菌分離參照伯杰氏細(xì)菌手冊[9]及饒小麗試驗(yàn)方法[10]。將病株莖稈表面用清水洗凈晾干,再用85%酒精擦拭,迅速過火燒盡酒精,用消過毒的解剖刀刮去表面皮層,刮其褐色組織,置于無菌培養(yǎng)皿中,滴入2滴無菌水,用無菌玻棒搗碎組織,靜置5 min,用玻棒取搗碎組織液在NA培養(yǎng)基上劃線,28℃培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)基上長出菌落后,挑取小圓形、稍隆起、白色稀湯狀、有光澤菌落于NA培養(yǎng)基上培養(yǎng),純化3~4次,然后再挑取單一菌落,置于裝有10 mL無菌水的試管中,保存菌種備用。

    1.3 病原菌菌懸液制備

    用滅菌接種環(huán)蘸取1.2中純化菌種,在NA培養(yǎng)基上劃線,于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。待病原菌在NA培養(yǎng)基上長滿培養(yǎng)皿后,取病原菌于3 mL無菌水中配制成菌原液,經(jīng)系列稀釋,配制濃度約1×108 cfu·mL-1的病原菌懸浮液。

    1.4 菌體培養(yǎng)條件優(yōu)化

    1.4.1 菌株耐鹽性試驗(yàn) 在JNFb培養(yǎng)基中加入NaCl調(diào)節(jié)鹽濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%,以不加NaCl為對照。每處理重復(fù)3皿,每皿接種1×106 cfu·mL-1濃度病原菌懸浮液2 mL,在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀測細(xì)菌數(shù)量,以測定細(xì)菌耐鹽性。

    1.4.2 菌體最適糖濃度試驗(yàn) 在鹽濃度為4%的JNFb培養(yǎng)基中分別加入5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%葡萄糖,以不加葡萄糖為對照。每處理重復(fù)3皿,每皿接種1×106cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL,在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀測細(xì)菌數(shù)量,以測定最適生長糖濃度。

    1.4.3 菌體最適生長酸堿度試驗(yàn) 在鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%的JNFb培養(yǎng)基中采用鹽酸和氫氧化鈉將pH值分別調(diào)為3、4、5、6、7、8、9、10。每處理重復(fù)3皿,每皿接種1×106cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL,在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀測細(xì)菌數(shù)量,以測定菌體最適生長酸堿度。

    1.4.4 菌體最適培養(yǎng)溫度試驗(yàn) 在鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值調(diào)為5~7的JNFb培養(yǎng)基中每皿接種1×106 cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL,置于在5、10、15、20、25、30、35、40、45℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)中。每處理重復(fù)3皿,24 h后觀測細(xì)菌數(shù)量,以測定最適培養(yǎng)溫度。

    1.5 病原菌致病條件

    1.5.1 接種濃度試驗(yàn) 調(diào)節(jié)JNFb液體培養(yǎng)基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5~7,接種致病菌菌懸液,接種濃度設(shè)為1×10、1×102、1×103 、1×104、 1×105、1×106、1×107、1×108 cfu·mL-1,另設(shè)清水對照(CK),共9個(gè)處理。每處理重復(fù)3盆,苗齡40~50 d,接種后常溫培養(yǎng),每天觀察致病情況。

    1.5.2 致病溫度試驗(yàn) 調(diào)節(jié)JNFb液體培養(yǎng)基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5~7,致病菌菌懸液接種濃度1×108 cfu·mL-1,接種后置于15、20、25、30、35℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),相對濕度為75%,共5個(gè)處理,每處理重復(fù)3盆,苗齡40~50 d,每天觀察致病情況。

    1.5.3 致病濕度試驗(yàn) 調(diào)節(jié)JNFb液體培養(yǎng)基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5~7,致病菌菌懸液接種濃度1×108 cfu·mL-1,苗齡40~50 d,接種,置于人工氣候室培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25℃,濕度設(shè)50%、60%、70%、80%、90%共5個(gè)處理,每處理重復(fù)3盆。每天觀察致病情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病原菌培養(yǎng)條件

    2.1.1 病原菌耐鹽性 在一定鹽濃度范圍內(nèi),該菌生長量隨鹽濃度增加而增大,在含4%NaCl的培養(yǎng)基中生長量達(dá)到最大,而后降低,在鹽濃度10%時(shí)已不能再生長。表明,所分離到的細(xì)菌耐鹽性最大不能超過10%,最適生長鹽濃度為4% (圖1) 。

    2.1.2 病原菌培養(yǎng)最適葡萄糖濃度 在不含葡萄糖培養(yǎng)基中,菌體能生長;隨著培養(yǎng)基含糖量增加,菌體生長量增大,在含糖量10%時(shí),生長最為旺盛,而后,隨含糖量增加,菌體生長量減少,在含糖量達(dá)到35%時(shí),菌體依然能夠生長,但生長量較?。▓D2) 。

    2.1.3 病原菌培養(yǎng)最適pH值 目標(biāo)菌在pH 3~10較大范圍內(nèi)都能生長,在pH 5~7之間有較高生長量,當(dāng)pH值為6時(shí)最適合菌體生長(圖3)。

    2.1.4 病原菌培養(yǎng)最適溫度 低于10℃的環(huán)境下菌株不能生長;至15℃時(shí),菌株有少量生長,隨著溫度升高,生長量增大,在30℃生長量最大;然后隨溫度升高生長量降低,到40℃時(shí)依然有少量生長;到45℃時(shí),菌株都不能再生長(圖4)。

    2.2 病原菌致病條件

    2.2.1 最佳接種濃度 1×10、1×102 cfu·mL-1和1×103 cfu·mL-1三個(gè)濃度處理未出現(xiàn)過敏性反應(yīng);1×104 cfu·mL-1和1×105 cfu·mL-1兩個(gè)濃度處理在接種后5~6 d出現(xiàn)輕微反應(yīng),在接種周圍表現(xiàn)葉肉黃化;1×106、1×107 cfu·mL-1和1×108 cfu·mL-1三個(gè)濃度處理3~4 d在接種周圍表現(xiàn)葉肉黃化,7 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死;對照未出現(xiàn)異常反應(yīng)。表明,最佳接種濃度在1×106 cfu·mL-1以上,隨濃度增加,致病性反應(yīng)加強(qiáng)。

    2.2.2 最適致病溫度 在15℃時(shí)接種后7 d出現(xiàn)接種周圍葉肉黃化,10 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死;20℃接種后3 d出現(xiàn)致病性反應(yīng),接種周圍葉肉黃化,10 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死;25℃接種后第3 d出現(xiàn)致病性反應(yīng),接種周圍葉肉黃化,7 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死;30℃接種后第4 d出現(xiàn)致病性反應(yīng),接種周圍葉肉黃化,7 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死;35℃接種后5 d出現(xiàn)接種周圍葉肉黃化,10 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死。表明,在75%相對濕度下,最適侵染溫度在20~25℃。

    2.2.3 最適侵染濕度 在25℃條件下, 50% RH處理接種后未出現(xiàn)侵染現(xiàn)象;60%RH處理接種后5 d出現(xiàn)接種周圍葉肉黃化,6 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死; 70% RH處理接種后3 d出現(xiàn)接種周圍葉肉黃化,5 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死; 80%、90% RH處理接種后2 d出現(xiàn)接種周圍葉肉黃化,4 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死。表明,最適侵染濕度應(yīng)在70%以上,屬于高濕侵染病害。

    3 小結(jié)

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌培養(yǎng)最適NaCl濃度為4%,葡萄糖濃度為10%,pH為 5~7,最適培養(yǎng)溫度在25~30℃之間。菌株最適侵染濃度在1×106 cfu·mL-1以上,最適侵染溫度在20~25℃之間,相對濕度在70%以上侵染速度快,因此該病害應(yīng)屬于中溫高濕侵染病害。

    參 考 文 獻(xiàn):

    [1] 唐世凱,劉麗芳,李永梅.烤煙套種甘薯對持續(xù)控制煙草病害的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2008 (9):26-28.

    [2] 袁美麗,高潔,張佳環(huán),等.煙草上四種細(xì)菌病害的鑒別[J].中國煙草,1994(3):39-39.

    [3] 李紅麗,郭夏麗,李清飛,等.抑制煙草青枯病生物有機(jī)肥的研制及其生防效果研究[J].土壤學(xué)報(bào),2010,47(4):798-801.

    [4] 楊合同,唐文華,遲建國,等.植病生防菌株B1301的種類鑒定及其對生姜青枯病的作用機(jī)理和防治效果[J].中國生物防治,2002,18(1):21-23.

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    [9] Buchanan R E, Gibbons N E.伯杰氏細(xì)菌手冊[M].第8版.北京:科學(xué)出版社,1984:280-281.

    [10]饒小麗,沈德龍,李俊,等.甘草內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌株鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào),2007,34(4):700-704.

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