一種玉米CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建

何春梅+劉鐵山+關(guān)海英

摘要：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated （Cas） 9 系統(tǒng)由于其突變效率高、制作簡單、成本低，被越來越廣泛地應(yīng)用于植物基因組的精確修飾，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具。本研究構(gòu)建了玉米淀粉合成酶調(diào)控因子基因ZmRSR1的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)，為在玉米中實(shí)現(xiàn)該基因的定向突變奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為玉米基因組的定點(diǎn)突變修飾提供了重要參考。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9；玉米；基因組編輯；調(diào)控因子

中圖分類號(hào)：S513.01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）11-0009-04

Abstract As its characteristics of high efficiency， easy manipulation and low cost， the clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated （Cas） 9 system has been widely used in precise modification of plant genome， which is regarded as a molecular tool with a broad application prospect. A detailed protocol of targeted mutagenesis of starch synthase regulatory factor gene ZmRSR1 in maize using the CRISPR/Cas9 system was provided， which might give a reference for site-directed modification of maize genome.

Keywords CRISPR/Cas9；Maize；Genome editing；Regulation factor

隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)對玉米等作物的重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳修飾，創(chuàng)造遺傳變異優(yōu)異材料是促進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效策略[1]。在現(xiàn)代生物學(xué)研究中， 基因組編輯（genome editing）技術(shù)是揭示特定基因功能的有效手段。隨著越來越多物種全基因組測序的完成，科學(xué)家們面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)即如何從海量的數(shù)據(jù)中獲得相應(yīng)基因的功能和應(yīng)用價(jià)值信息，基因組的定點(diǎn)編輯技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要研究工具[2-4]。

在過去十年間，幾種序列特異性核酸酶，包括鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases， ZFNs）、 TALE核酸酶（transcription activator-like effector nucleases， TALENs），能夠?qū)位颉㈦p基因及多基因進(jìn)行敲除，使定向基因組編輯成為可能。近年來，這些核酸酶已經(jīng)被成功地應(yīng)用于植物中，逐漸掀起了植物分子育種與遺傳學(xué)修飾的一場革命[3，4]。ZFNs 和TALENs包括人造的模塊化的DNA結(jié)合域和FokⅠ核酸酶域兩部分，兩個(gè)系統(tǒng)中的DNA結(jié)合域均可識(shí)別一個(gè)特定的DNA序列，然而，其蛋白復(fù)合物的設(shè)計(jì)與制備費(fèi)力又昂貴。2013 年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated （Cas） 9系統(tǒng)[2]，該系統(tǒng)是一個(gè)由核酸和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物，能夠由一段人工設(shè)計(jì)的20 bp的向?qū)NA（guide RNA， gRNA）通過Watson-Crick堿基配對原則特異地錨定到一段基因組序列上，從而實(shí)現(xiàn)對基因組的定點(diǎn)編輯。打靶一個(gè)位點(diǎn)只需要在原有載體的基礎(chǔ)上替換20～30 bp的核苷酸，相當(dāng)于合成一對引物，構(gòu)建過程相對于ZFNs和TALENs更加簡單，適合規(guī)模化、高通量的組裝。盡管該系統(tǒng)發(fā)展時(shí)間短，但目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在動(dòng)物、植物、微生物以及人類醫(yī)學(xué)等各方面[2，5]。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯植物基因組，干擾某個(gè)或某些基因的表達(dá)已有許多成功的報(bào)道，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于模式植物如煙草和擬南芥[6，7]中，作物如小麥[8]、玉米[9]、水稻[10-13]、高粱[14]、番茄[15]以及柑橘[16]中。在水稻和小麥中，詳細(xì)的構(gòu)建定點(diǎn)突變載體的方案也已報(bào)道[17]。

Fu等[18]通過基因共表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與淀粉合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因RSR1（Rice Starch Regulator 1），該調(diào)控因子屬于APETALA2/乙烯-響應(yīng)元素結(jié)合蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)調(diào)控Ⅰ型淀粉合成酶基因的表達(dá)，其功能缺失能夠增強(qiáng)種子中淀粉合成酶基因的表達(dá)。本試驗(yàn)擬通過克隆與水稻OsRSR1同源的玉米ZmRSR1，構(gòu)建其CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)，詳細(xì)介紹構(gòu)建該編輯系統(tǒng)的方法，為后續(xù)在玉米中定向突變ZmRSR1、增加種子中淀粉合成酶基因的表達(dá)、提高種子淀粉含量奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CRISPR/Cas9載體pRGEB31由本實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶均為Biolab公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy Vector為Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、普通產(chǎn)物回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)均購于天根公司；卡那霉素購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 引物設(shè)計(jì)及片段擴(kuò)增

根據(jù)Fu等[18]報(bào)道的水稻OsRSR1基因的擴(kuò)增引物 T1： 5′-GGGAATAGGGGATGAGGTTG-3′與T2：5′-CCGATGGATGATTTGTTTGC-3′登錄NCBI數(shù)據(jù)庫，利用Blast分析獲得GenBank序列號(hào)對應(yīng)的cDNA全長，利用此序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast，獲得玉米中相似性最高的序列，將該序列輸入玉米基因組數(shù)據(jù)庫maizegdb（http：//www.maizegdb.org/）中進(jìn)行Blast分析，獲得OsRSR1在玉米中的同源基因ZmRSR1的DNA序列及染色體座位。將該序列輸入用于搜索CRISPR序列的在線設(shè)計(jì)軟件（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html），從中選擇PAM序列合適的序列作為CRISPR序列。

由于本研究所要構(gòu)建的載體與pRGEB31相比，只是在目標(biāo)CRISPR序列（20 bp）上不同，因此將目標(biāo)CRISPR序列設(shè)計(jì)在引物中，以質(zhì)粒pRGEB31為模板，通過Overlapping PCR方法獲得帶有目標(biāo)序列的全長片段，連入載體pRGEB31中，完成對原來序列的置換。因此，試驗(yàn)前兩輪PCR擴(kuò)增分別以質(zhì)粒pRGEB31為模板，第一輪擴(kuò)增分別用載體pRGEB31中的U3啟動(dòng)子序列（U3-Forward）作為上游引物，用CRISPR序列與pRGEB31中一段上游gRNA序列（P1 Re，P2 Re，P3 Re，P4 Re，P5 Re）做下游引物；第二輪擴(kuò)增用CRISPR序列與pRGEB31中一段上游gRNA序列（P1 Fw，P2 Fw，P3 Fw，P4 Fw，P5 Fw）做上游引物，用載體pRGEB31中g(shù)RNA序列（gRNA-Reverse）做下游引物。分別回收兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物，合并后作為下一步PCR擴(kuò)增的模板，以載體pRGEB31中U3啟動(dòng)子序列作為上游引物，以gRNA序列做下游引物，做第三輪Overlapping PCR擴(kuò)增?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy Vector，16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒測序。所用引物序列如表1所示。

1.3 載體構(gòu)建與鑒定

取測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒和載體pRGEB31分別用HindⅢ和SbfⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物并建立連接體系，16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用卡那霉素篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，取酶切正確的克隆進(jìn)行測序，得到含有目標(biāo)序列的重組載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmRSR1基因CRISPR序列的獲得

根據(jù)水稻OsRSR1基因信息登錄NCBI數(shù)據(jù)庫，利用Blast分析獲得玉米中相似性最高的基因序列ZmRSR1。將此基因信息輸入用于搜索CRISPR序列及其Cas9基因的在線設(shè)計(jì)軟件（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html），從中選擇PAM序列合適的序列作為CRISPR種子序列。共挑選5個(gè)CRISPR序列，如表2所示。

2.2 CRISPR序列的擴(kuò)增及載體構(gòu)建

試驗(yàn)前兩輪PCR擴(kuò)增以質(zhì)粒pRGEB31為模板，分別以U3啟動(dòng)子序列、CRISPR序列及gRNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1a、1b所示，擴(kuò)增片段均與預(yù)期大小一致。兩輪PCR產(chǎn)物合并后進(jìn)行Overlapping PCR，結(jié)果如圖1c所示，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小一致。將產(chǎn)物回收后連入T載體測序。

取鑒定正確的重組子及載體pRGEB31分別用HindⅢ和SbfⅠ雙酶切，回收載體片段與623 bp的外源片段用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用卡那霉素篩選陽性克隆提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果如圖2所示，所有克隆酶切后均獲得與預(yù)期大小一致的單一片段，初步判斷所篩選克隆全部正確。

將酶切正確的陽性克隆送測序鑒定，將測序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行比對，所有堿基全部正確無突變（測序結(jié)果未顯示），即已經(jīng)在載體pRGEB31中連入正確的CRISPR序列，獲得玉米ZmRSR1基因的CRISPR/Cas9重組載體pRGEB31-ZmRSR1-1、pRGEB31-ZmRSR1-2、 pRGEB31-ZmRSR1-3、pRGEB31-ZmRSR1-4及pRGEB31-ZmRSR1-5。

3 小結(jié)

http：//www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html[19]能夠?yàn)?種有代表性的植物提供合適的CRISPR目標(biāo)序列預(yù)測和篩選，我們利用該數(shù)據(jù)庫篩選出玉米ZmRSR1基因5個(gè)可能的CRISPR目標(biāo)序列并將其構(gòu)建到載體pRGEB31中，該載體為組裝好的CRISPR/Cas9載體，能夠?qū)RNA與Cas9蛋白轉(zhuǎn)移到植物中，識(shí)別設(shè)計(jì)的CRISPR序列，對目的基因進(jìn)行編輯和敲除[20]。結(jié)果顯示，我們所設(shè)計(jì)的5個(gè)CRISPR目標(biāo)序列全部替換正確，為后續(xù)轉(zhuǎn)化玉米并研究對ZmRSR1基因的編輯效率奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Griggs D， Stafford-Smith M， Gaffney O， et al. Policy： sustainable development goals for people and planet[J]. Nature， 2013， 495：305-307.

[2] Mussolino C， Cathomen T. RNA guides genome engineering[J]. Nat. Biotechnol.， 2013， 31（3）： 208-209.

[3] Podevin N， Davies H V， Hartung F， et al. Site-directed nucleases： a paradigm shift in predictable， knowledge-based plant breeding[J]. Trends Biotechnol.， 2013， 31：375-383.

[4] Voytas D F， Gao C. Precision genome engineering and agriculture： opportunities and regulatory challenges[J]. PLoS Biol.， 2014， 12（6）：e1001877.

[5] Jinek M， Chylinski K， Fonfara I， et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science， 2012， 337：816-821.

[6] Li J F， Norville J E， Aach J， et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9[J]. Nat. Biotechnol.， 2013， 31：688-691.

[7] Gao J， Wang G， Ma S，et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum[J]. Plant Mol. Biol.， 2015， 87（1-2）：99-110.

[8] Upadhyay S K， Kumar J， Alok A， et al. RNA-guided genome editing for target gene mutations in wheat[J]. G3 （Bethesda）， 2013， 3（12）：2233-2238.

[9] Liang Z， Zhang K， Chen K， et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system[J]. J. Genet. Genomics， 2014， 41：63-68.

[10]Feng Z， Zhang B， Ding W， et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J]. Cell Res.， 2013， 23：1229-1232.

[11]Mao Y， Zhang H， Xu N， et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants[J]. Mol. Plant， 2013， 6：2008-2011.

[12]Miao J， Guo D， Zhang J， et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J]. Cell Res.， 2013， 23：1233-1236.

[13]Jiang W， Bikard D， Cox D， et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J]. Nat. Biotechnol.， 2013， 31（3）：233-239.

[14]Jiang W， Zhou H， Bi H， et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis， tobacco， sorghum and rice[J]. Nucleic. Acids Res.， 2013， 41：e188.

[15]Brooks C， Nekrasov V， Lippman Z， et al. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR/Cas9 system[J]. Plant Physiol.， 2014， 166：1292-1297.

[16]Jia H， Wang N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA[J]. PLoS ONE， 2014， 9：e93806.

[17]Shan Q， Wang Y， Li J， et al. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system[J]. Nat. Protoc.， 2014， 9：2395-2410.

[18]Fu F F， Xue H W. Coexpression analysis identifies rice starch regulator1， a rice AP2/EREBP family transcription factor， as a novel rice starch biosynthesis regulator[J]. Plant Physiol.，2010，154：927-938.

[19]Xie K， Zhang J， Yang Y. Genome-wide prediction of highly specific guide RNA spacers for CRISPR-Cas9-mediated genome editing in model plants and major crops[J]. Mol. Plant， 2014， 7：923-926.

[20]Montague T G， Cruz J M， Gagnon J A. Chopchop： a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing[J]. Nucleic. Acids Res.， 2014， 42： 401-407.