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    一種玉米CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建

    2016-12-17 21:04:49何春梅劉鐵山關(guān)海英
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年11期
    關(guān)鍵詞:玉米

    何春梅+劉鐵山+關(guān)海英

    摘要:Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 系統(tǒng)由于其突變效率高、制作簡單、成本低,被越來越廣泛地應(yīng)用于植物基因組的精確修飾,是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具。本研究構(gòu)建了玉米淀粉合成酶調(diào)控因子基因ZmRSR1的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng),為在玉米中實(shí)現(xiàn)該基因的定向突變奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),同時(shí)也為玉米基因組的定點(diǎn)突變修飾提供了重要參考。

    關(guān)鍵詞:CRISPR/Cas9;玉米;基因組編輯;調(diào)控因子

    中圖分類號(hào):S513.01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2016)11-0009-04

    Abstract As its characteristics of high efficiency, easy manipulation and low cost, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system has been widely used in precise modification of plant genome, which is regarded as a molecular tool with a broad application prospect. A detailed protocol of targeted mutagenesis of starch synthase regulatory factor gene ZmRSR1 in maize using the CRISPR/Cas9 system was provided, which might give a reference for site-directed modification of maize genome.

    Keywords CRISPR/Cas9;Maize;Genome editing;Regulation factor

    隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展,利用基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)對玉米等作物的重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳修飾,創(chuàng)造遺傳變異優(yōu)異材料是促進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效策略[1]。在現(xiàn)代生物學(xué)研究中, 基因組編輯(genome editing)技術(shù)是揭示特定基因功能的有效手段。隨著越來越多物種全基因組測序的完成,科學(xué)家們面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)即如何從海量的數(shù)據(jù)中獲得相應(yīng)基因的功能和應(yīng)用價(jià)值信息,基因組的定點(diǎn)編輯技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要研究工具[2-4]。

    在過去十年間,幾種序列特異性核酸酶,包括鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、 TALE核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs),能夠?qū)位颉㈦p基因及多基因進(jìn)行敲除,使定向基因組編輯成為可能。近年來,這些核酸酶已經(jīng)被成功地應(yīng)用于植物中,逐漸掀起了植物分子育種與遺傳學(xué)修飾的一場革命[3,4]。ZFNs 和TALENs包括人造的模塊化的DNA結(jié)合域和FokⅠ核酸酶域兩部分,兩個(gè)系統(tǒng)中的DNA結(jié)合域均可識(shí)別一個(gè)特定的DNA序列,然而,其蛋白復(fù)合物的設(shè)計(jì)與制備費(fèi)力又昂貴。2013 年,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9系統(tǒng)[2],該系統(tǒng)是一個(gè)由核酸和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物,能夠由一段人工設(shè)計(jì)的20 bp的向?qū)NA(guide RNA, gRNA)通過Watson-Crick堿基配對原則特異地錨定到一段基因組序列上,從而實(shí)現(xiàn)對基因組的定點(diǎn)編輯。打靶一個(gè)位點(diǎn)只需要在原有載體的基礎(chǔ)上替換20~30 bp的核苷酸,相當(dāng)于合成一對引物,構(gòu)建過程相對于ZFNs和TALENs更加簡單,適合規(guī)模化、高通量的組裝。盡管該系統(tǒng)發(fā)展時(shí)間短,但目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在動(dòng)物、植物、微生物以及人類醫(yī)學(xué)等各方面[2,5]。

    利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯植物基因組,干擾某個(gè)或某些基因的表達(dá)已有許多成功的報(bào)道,該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于模式植物如煙草和擬南芥[6,7]中,作物如小麥[8]、玉米[9]、水稻[10-13]、高粱[14]、番茄[15]以及柑橘[16]中。在水稻和小麥中,詳細(xì)的構(gòu)建定點(diǎn)突變載體的方案也已報(bào)道[17]。

    Fu等[18]通過基因共表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與淀粉合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因RSR1(Rice Starch Regulator 1),該調(diào)控因子屬于APETALA2/乙烯-響應(yīng)元素結(jié)合蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子,負(fù)調(diào)控Ⅰ型淀粉合成酶基因的表達(dá),其功能缺失能夠增強(qiáng)種子中淀粉合成酶基因的表達(dá)。本試驗(yàn)擬通過克隆與水稻OsRSR1同源的玉米ZmRSR1,構(gòu)建其CRISPR/Cas9載體系統(tǒng),詳細(xì)介紹構(gòu)建該編輯系統(tǒng)的方法,為后續(xù)在玉米中定向突變ZmRSR1、增加種子中淀粉合成酶基因的表達(dá)、提高種子淀粉含量奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    CRISPR/Cas9載體pRGEB31由本實(shí)驗(yàn)室保存;T4 DNA連接酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶均為Biolab公司產(chǎn)品;pGEM-T Easy Vector為Promega公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、普通產(chǎn)物回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)均購于天根公司;卡那霉素購自Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    1.2 引物設(shè)計(jì)及片段擴(kuò)增

    根據(jù)Fu等[18]報(bào)道的水稻OsRSR1基因的擴(kuò)增引物 T1: 5′-GGGAATAGGGGATGAGGTTG-3′與T2:5′-CCGATGGATGATTTGTTTGC-3′登錄NCBI數(shù)據(jù)庫,利用Blast分析獲得GenBank序列號(hào)對應(yīng)的cDNA全長,利用此序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast,獲得玉米中相似性最高的序列,將該序列輸入玉米基因組數(shù)據(jù)庫maizegdb(http://www.maizegdb.org/)中進(jìn)行Blast分析,獲得OsRSR1在玉米中的同源基因ZmRSR1的DNA序列及染色體座位。將該序列輸入用于搜索CRISPR序列的在線設(shè)計(jì)軟件(http://www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html),從中選擇PAM序列合適的序列作為CRISPR序列。

    由于本研究所要構(gòu)建的載體與pRGEB31相比,只是在目標(biāo)CRISPR序列(20 bp)上不同,因此將目標(biāo)CRISPR序列設(shè)計(jì)在引物中,以質(zhì)粒pRGEB31為模板,通過Overlapping PCR方法獲得帶有目標(biāo)序列的全長片段,連入載體pRGEB31中,完成對原來序列的置換。因此,試驗(yàn)前兩輪PCR擴(kuò)增分別以質(zhì)粒pRGEB31為模板,第一輪擴(kuò)增分別用載體pRGEB31中的U3啟動(dòng)子序列(U3-Forward)作為上游引物,用CRISPR序列與pRGEB31中一段上游gRNA序列(P1 Re,P2 Re,P3 Re,P4 Re,P5 Re)做下游引物;第二輪擴(kuò)增用CRISPR序列與pRGEB31中一段上游gRNA序列(P1 Fw,P2 Fw,P3 Fw,P4 Fw,P5 Fw)做上游引物,用載體pRGEB31中g(shù)RNA序列(gRNA-Reverse)做下游引物。分別回收兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物,合并后作為下一步PCR擴(kuò)增的模板,以載體pRGEB31中U3啟動(dòng)子序列作為上游引物,以gRNA序列做下游引物,做第三輪Overlapping PCR擴(kuò)增?;厥諗U(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy Vector,16℃連接過夜,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒測序。所用引物序列如表1所示。

    1.3 載體構(gòu)建與鑒定

    取測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒和載體pRGEB31分別用HindⅢ和SbfⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物并建立連接體系,16℃連接過夜,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用卡那霉素篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,取酶切正確的克隆進(jìn)行測序,得到含有目標(biāo)序列的重組載體。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ZmRSR1基因CRISPR序列的獲得

    根據(jù)水稻OsRSR1基因信息登錄NCBI數(shù)據(jù)庫,利用Blast分析獲得玉米中相似性最高的基因序列ZmRSR1。將此基因信息輸入用于搜索CRISPR序列及其Cas9基因的在線設(shè)計(jì)軟件(http://www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html),從中選擇PAM序列合適的序列作為CRISPR種子序列。共挑選5個(gè)CRISPR序列,如表2所示。

    2.2 CRISPR序列的擴(kuò)增及載體構(gòu)建

    試驗(yàn)前兩輪PCR擴(kuò)增以質(zhì)粒pRGEB31為模板,分別以U3啟動(dòng)子序列、CRISPR序列及gRNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖1a、1b所示,擴(kuò)增片段均與預(yù)期大小一致。兩輪PCR產(chǎn)物合并后進(jìn)行Overlapping PCR,結(jié)果如圖1c所示,擴(kuò)增片段與預(yù)期大小一致。將產(chǎn)物回收后連入T載體測序。

    取鑒定正確的重組子及載體pRGEB31分別用HindⅢ和SbfⅠ雙酶切,回收載體片段與623 bp的外源片段用T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用卡那霉素篩選陽性克隆提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果如圖2所示,所有克隆酶切后均獲得與預(yù)期大小一致的單一片段,初步判斷所篩選克隆全部正確。

    將酶切正確的陽性克隆送測序鑒定,將測序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行比對,所有堿基全部正確無突變(測序結(jié)果未顯示),即已經(jīng)在載體pRGEB31中連入正確的CRISPR序列,獲得玉米ZmRSR1基因的CRISPR/Cas9重組載體pRGEB31-ZmRSR1-1、pRGEB31-ZmRSR1-2、 pRGEB31-ZmRSR1-3、pRGEB31-ZmRSR1-4及pRGEB31-ZmRSR1-5。

    3 小結(jié)

    http://www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html[19]能夠?yàn)?種有代表性的植物提供合適的CRISPR目標(biāo)序列預(yù)測和篩選,我們利用該數(shù)據(jù)庫篩選出玉米ZmRSR1基因5個(gè)可能的CRISPR目標(biāo)序列并將其構(gòu)建到載體pRGEB31中,該載體為組裝好的CRISPR/Cas9載體,能夠?qū)RNA與Cas9蛋白轉(zhuǎn)移到植物中,識(shí)別設(shè)計(jì)的CRISPR序列,對目的基因進(jìn)行編輯和敲除[20]。結(jié)果顯示,我們所設(shè)計(jì)的5個(gè)CRISPR目標(biāo)序列全部替換正確,為后續(xù)轉(zhuǎn)化玉米并研究對ZmRSR1基因的編輯效率奠定了基礎(chǔ)。

    參 考 文 獻(xiàn):

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