棉鈴蟲磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白的克隆及表達分析

趙潔，任蘇偉，劉寧，艾新宇，馬紀，劉小寧

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棉鈴蟲磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白的克隆及表達分析

趙潔1，任蘇偉1，劉寧2，艾新宇1，馬紀1，劉小寧1

（1新疆大學生命科學與技術(shù)學院，烏魯木齊 830046；2新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所，烏魯木齊 830091）

【目的】克隆獲得棉鈴蟲（）磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)的cDNA序列，分析在棉鈴蟲體內(nèi)的表達規(guī)律，檢測2-十三烷酮處理條件下棉鈴蟲體內(nèi)的變化情況，為進一步明確棉鈴蟲PEBP的功能和選擇該基因作為調(diào)控棉鈴蟲種群數(shù)量的分子靶標提供依據(jù)。【方法】利用RACE技術(shù)從棉鈴蟲6齡幼蟲的中腸組織中擴增得到的cDNA序列，并對其氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)進行分析。將的ORF序列連接至pET32a載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導后檢測目的蛋白的表達形式，并通過鎳柱的親和層析純化融合蛋白。最后通過實時熒光定量PCR檢測棉鈴蟲幼蟲不同時期和6齡幼蟲不同組織中的表達規(guī)律，以及2-十三烷酮處理棉鈴蟲6齡幼蟲后中腸內(nèi)的變化規(guī)律?！窘Y(jié)果】獲得的cDNA序列長760 bp，其中ORF為588 bp，編碼195個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量和等電點分別為21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明PEBP無信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和二硫鍵，是一個由4個螺旋和9個折疊片組成的胞質(zhì)單體蛋白。將BL21(DE3)-pET32a-重組菌用1 mmol·L-1的IPTG在37℃條件下誘導4 h，約40 kD的融合蛋白His-PEBP能以可溶的形式存在于重組菌中。按照同樣的方法誘導1 L的重組菌，將超聲處理后的上清液與Ni-NTA柱結(jié)合，進行咪唑緩沖液梯度洗滌，200 mmol·L-1的咪唑洗滌兩次后得到約40 kD的單一蛋白，與融合蛋白的大小一致。將此流出液超濾濃縮，獲得183.3 ng·μl-1的融合蛋白，能被抗His-Tag的單克隆抗體識別發(fā)生免疫反應。在棉鈴蟲幼蟲的1—6齡期和預蛹期均表達，且6齡幼蟲的表達量最高。該基因在6齡幼蟲的脂肪體、中腸、頭部和體壁中也均有表達，且脂肪體內(nèi)的表達量最高。不同濃度的2-十三烷酮處理后，棉鈴蟲6齡幼蟲中腸內(nèi)的表達量均有所降低；低濃度(2.5和5 mg·g-1)在6 h就能降低的表達量，其mRNA含量隨著時間的延長逐漸增加；而高濃度(10和15 mg·g-1)在12 h才會降低的表達量，其mRNA含量隨著時間的延長先下降后上升?！窘Y(jié)論】克隆分析了，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達出可溶的融合蛋白His-PEBP，并通過鎳柱-咪唑純化法得到了高純度的融合蛋白，時空表達分析顯示在棉鈴蟲6齡幼蟲和脂肪體中表達量最高，2-十三烷酮處理6齡幼蟲后中腸內(nèi)的表達量顯著降低。

棉鈴蟲；磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白；原核表達；時空表達；2-十三烷酮

0 引言

【研究意義】棉鈴蟲（）是一種世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，并且對多種殺蟲劑和轉(zhuǎn)基因作物的抗性逐漸增強[1]，為了避免其暴發(fā)成災，需要掌握它的抗藥性機制。磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP）是一種能在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮重要作用的蛋白，對棉鈴蟲PEBP的研究不僅可以明確其在有毒物質(zhì)的代謝過程中是否發(fā)揮傳遞信號的作用，還可為棉鈴蟲的防控提供新的分子靶標。【前人研究進展】1984年，Bernier等[2]首次從牛腦中分離提取到PEBP-1，其在體外能與磷脂酰乙醇胺特異性結(jié)合，為分子量21—23 kD的胞質(zhì)可溶性蛋白。PEBP廣泛分布于自然界，除了在人、牛、鼠等哺乳動物中存在，在開花植物、真菌、細菌和昆蟲等物種中亦存在[3]。PEBP在生物體的多種組織中都有表達且氨基酸序列高度保守，Western bolt結(jié)果顯示大鼠PEBP在腦、心、腎、肝、小腸等組織均有表達；人、猴、牛、大鼠、小鼠的PEBP序列有超過90%的同源性[4-5]。對PEBP的功能研究表明該蛋白參與多個胞內(nèi)信號通路，從而具有多種生物學功能[6-8]。例如參與MAPK/ERK信號通路調(diào)節(jié)細胞分化、遷移和黏附，參與NF-κB信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡，參與GPCR信號通路調(diào)控G蛋白的信號轉(zhuǎn)導等。PEBP還可在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)大鼠PEBP是海馬膽堿能神經(jīng)刺激肽（hippocampal cholinergic neurostimulating peptide，HCNP）的前體，PEBP的N端第2—14位可被切割成一個11肽，此肽能提高膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（choline acetyl transferase，ChAT）的表達從而調(diào)控乙酰膽堿的合成[9]。一些阿爾茲海默病患者的大腦中PEBP的mRNA水平顯著降低，造成ChAT含量減少從而引起記憶力減退[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠精子頂體和鞭毛的細胞外，PEBP可作為一種去能因子（decapacitation factor，DF）的受體與DF結(jié)合，使精子無法穿透卵子外圍保護層，從而調(diào)控精子與卵子的結(jié)合過程[11]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對于PEBP的功能研究主要集中在哺乳動物體內(nèi)，對于昆蟲的PEBP研究報道較少。前期試驗中，筆者實驗室通過酵母單雜交技術(shù)篩選針對棉鈴蟲的2-十三烷酮響應元件的轉(zhuǎn)錄因子，其中一個陽性克隆的部分片段與家蠶保守域有較高的相似性。2-十三烷酮是一種常見的植物次生物質(zhì)，天然存在于多種茄科植物中[12]。它能誘導細胞色素P450家族中的過量表達，從而提高昆蟲對殺蟲劑的忍耐力[13]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】運用RACE技術(shù)獲得棉鈴蟲（）的cDNA序列，并將該基因克隆至pET32a載體使其在大腸桿菌中誘導表達，然后通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)測定在棉鈴蟲幼蟲各齡期和6齡幼蟲不同組織中的表達情況，并檢測不同濃度2-十三烷酮處理后幼蟲中腸內(nèi)的表達規(guī)律，為進一步明確PEBP在棉鈴蟲體內(nèi)的功能和選擇該基因作為調(diào)控棉鈴蟲種群數(shù)量的分子靶標提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2016年9月至2017年4月在新疆大學新疆生物資源和基因工程重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

棉鈴蟲為筆者實驗室人工飼料長期飼養(yǎng)的品系，大腸桿菌DH5和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，表達載體pET32a為筆者實驗室保存。

DNA Marker、H ?、d Ш、T4 DNA ligase、pMD18-T vector kit、ExTaq DNA polymerase kit和Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-free）kit購自TaKaRa公司；SMARTer RACE 5′/3′ kit購自Clontech公司；DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒、引物合成和DNA序列測定均購自上海生工生物有限公司；TansZol Up Plus RNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；miScript SYBR Green PCR Kit購自QIAGEN公司；鼠抗His-Tag單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體購自中杉金橋公司；DAB顯色試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1cDNA克隆及序列分析 將棉鈴蟲6齡幼蟲的中腸在液氮中研磨，按照TansZol Up Plus RNA Kit提供的方法提取總RNA，并分別逆轉(zhuǎn)錄成普通cDNA、5′ RACE cDNA和3′ RACE cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)酵母單雜交捕獲的部分序列設計RACE擴增所需的特異引物（表1）。分別以5′ RACE cDNA和3′ RACE cDNA為模板進行Outer PCR。5′ RACE擴增反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25個循環(huán)。3′ RACE擴增反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。將Outer PCR產(chǎn)物稀釋20倍后作為模板進行Inner PCR。5′ RACE擴增反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，30個循環(huán)。3′ RACE擴增反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。Inner PCR的擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，將目的條帶連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)，挑取陽性克隆進行PCR檢測并送上海生工生物公司測序。利用DNAMAN軟件將測序得到的的5′和3′片段進行拼接，獲得的cDNA序列，并預測序列的開放閱讀框。針對的ORF設計引物（表1），以普通cDNA為模板進行PCR驗證。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物的回收和測序同上。

1.2.2PEBP氨基酸序列分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF Finder和Protein Blast進行ORF的預測和氨基酸序列比對；用MEGA軟件按照鄰近相接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定棉鈴蟲PEBP與其他物種PEBP的親緣關(guān)系；利用Expasy軟件的Protparam和Protscale工具進行理化參數(shù)分析和親疏水性分析；通過CBS Prediction Servers軟件的SignalP、TargetP和TMHMM等工具進行信號肽、跨膜域和亞細胞定位等預測；利用PredictProtein軟件進行蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測；利用SWISS-MODEL軟件和PDB數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預測。

1.2.3PEBP蛋白的原核表達 將的ORF通過酶切位點H ?和d Ⅲ連接至pET32a載體上，并轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)。PCR篩選陽性重組子后，提取重組質(zhì)粒pET32a-進行酶切鑒定。將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)細胞中，進行菌落PCR驗證和質(zhì)粒酶切鑒定。將陽性克隆BL21(DE3)-pET32a-接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6—0.8后，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37℃振蕩培養(yǎng)4 h。離心收集重組菌體后用少量1×PBS（pH 7.0）重懸，經(jīng)超聲破碎至相對透亮（間隔5 s，共30 min），分開處理上清和沉淀，15%的SDS-PAGE檢測融合蛋白的可溶性。

1.2.4 His-PEBP蛋白的純化 將1 L的BL21(DE3)-pET32a-菌株誘導超聲后，將上清液與Ni-NTA柱結(jié)合，用不同濃度的咪唑溶液（10、10、20、20、50、100、200、200 mmol·L-1）去除雜蛋白，用孔徑大小為10 kD的超濾管濃縮目的蛋白（6 000 r/min離心45 min），15% SDS-PAGE檢測蛋白純化時的流出液。Western blot驗證融合蛋白His-PEBP的大小和純度，用5%脫脂奶粉4℃過夜封閉，PBST沖洗3次；1﹕1 000稀釋的抗His標簽的抗體室溫孵育2 h，PBST沖洗3次；1﹕5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體室溫孵育1.5 h；最后用DAB顯色試劑盒顯色10 min，LAS-4000成像系統(tǒng)（美國）進行觀察。

1.2.5表達模式分析 收集孵化后第2天的1齡、蛻皮后第2天的2—6齡和建蛹室第3天的預蛹的幼蟲全蟲；蛻皮后第2天的6齡幼蟲解剖收集脂肪體、中腸、體壁和頭部。通過qRT-PCR方法檢測在棉鈴蟲不同發(fā)育時期和不同組織的表達量，提取各組棉鈴蟲的總RNA，進行DNaseⅠ的消化回收后逆轉(zhuǎn)錄獲得各組cDNA。分別取1 μL的cDNA根據(jù)miScript SYBR Green PCR Kit的說明書進行熒光定量，以作為內(nèi)參基因[14-15]，和的熒光定量引物見表1，每組3個生物學重復和2個技術(shù)重復。對于不同發(fā)育時期，以1齡為對照；對于不同組織，以脂肪體為對照。試驗數(shù)據(jù)處理根據(jù)公式2-??CT，并利用Prism5.0軟件進行One-way ANOVA分析。

1.2.6響應2-十三烷酮處理的表達規(guī)律 將所需2-十三烷酮溶于等體積的無水乙醇中，添加于等質(zhì)量的棉鈴蟲人工飼料中，配制成2.5、5、10和15 mg·g-1，對照組為只添加無水乙醇的人工飼料。取蛻皮第1天內(nèi)的6齡幼蟲，在2-十三烷酮處理前使其饑餓5 h。運用qRT-PCR方法檢測不同濃度2-十三烷酮處理下，幼蟲中腸組織中在不同時間（6、12、20、30、48 h）的表達情況。在各時間點上，以不添加2-十三烷酮作為對照，作為內(nèi)參基因，采用2-??CT法進行mRNA相對表達量的計算。運用Prism5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，同一濃度不同時間的數(shù)據(jù)進行One-way ANOVA分析，同一時間與對照組的數(shù)據(jù)進行pairedtest分析。

表1 本研究所用引物

下劃線為酶切位點 The enzyme cleavage sites are underlined

2 結(jié)果

2.1 HaPEBP全長克隆和序列分析

將5′和3′ RACE擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)過測序和序列拼接，圖1表明獲得的cDNA序列長760 bp，其中5′-UTR為77 bp，3′-UTR為95 bp，含有加尾信號AATAAA，ORF為588 bp，可編碼195個氨基酸。該蛋白預測分子量為21.76 kD，理論等電點為5.93。經(jīng)NCBI Blast分析，確定該蛋白屬于PEBP超家族，含有該蛋白家族特有的保守位點，其中包括79—83位的DPDXP基序、95位的組氨酸殘基和125—128位的GXHR基序，這些是與配體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。

方框內(nèi)為起始密碼子和終止密碼子the start and stop codons are boxed；下劃線表示配體結(jié)合的保守位點The conserved sites of HaPEBP combined with ligand are underlined；虛線表示核苷酸結(jié)合基序有同源性的位點Imaginary lines indicate the homology sites of nucleic acid binding motif

2.2 HaPEBP蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將多種動物的PEBP序列進行多序列比對及系統(tǒng)進化發(fā)育分析，圖2顯示節(jié)肢動物門昆蟲綱的PEBP聚在一起，PEBP蛋白與鱗翅目家蠶（）、菜青蟲（）和小菜蛾（）的PEBP同源性較高，分別為70.77%、77.95%和70.62%。PEBP與小菜蛾P(guān)EBP分別為一個支的兩個分支，兩者的Bootstrap檢驗值為43，表明它們的分化時間和進化速率可能較為一致。

氨基酸序列分析顯示PEBP蛋白無信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和二硫鍵，為胞內(nèi)穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。圖3的二級結(jié)構(gòu)顯示其含有5個螺旋、10個折疊片、23個轉(zhuǎn)角和2個轉(zhuǎn)角，其中螺旋1和2因螺旋-螺旋的相互作用可視為一個螺旋（14—26位的IIRSFEAQSVVPD序列），而折疊片7和8因位置相鄰可視為一個折疊片（110—113位的ETLS序列）。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測PEBP為緊湊的球形單體結(jié)構(gòu)，含有一個與配體結(jié)合的口袋。三級拓撲結(jié)構(gòu)表明6個折疊片（1、5、6、7—8、9和10）可形成一個較大的中心折疊區(qū)，含有一個結(jié)合口袋；而另外3個折疊片（2、3和4）形成一個較小的反向平行片層，位于中心折疊區(qū)的轉(zhuǎn)角處。

2.3 融合蛋白His-HaPEBP的誘導表達

的ORF經(jīng)擴增后連接pET32a載體，將H ?和d Ⅲ酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得菌株BL21(DE3)-pET32a-。圖4-A表明該菌株經(jīng)1 mmol·L-1IPTG 37℃誘導4 h后，可大量產(chǎn)生一種小于45 kD的蛋白，此蛋白與融合蛋白His-PEBP（39.1 kD）大小相近。將誘導后的菌體進行超聲破碎后，分別收集上清和沉淀，融合蛋白能以可溶的形式存在于大腸桿菌中。將1 L的菌液按同樣的條件誘導，超聲破碎細胞后收集上清液，對上清液進行Ni-NTA柱His標簽的親和層析，分別用10、10、20、20、50、100、200和200 mmol?L-1的咪唑緩沖液洗滌柱料，圖4-B顯示在第2次200 mmol?L-1的咪唑溶液洗滌后，流出液中含有較純的、符合預期大小的融合蛋白。將此流出液超濾濃縮后進行蛋白定量，結(jié)果顯示濃縮的融合蛋白含量為183.3 ng·μl-1。用抗His-Tag的單克隆抗體與濃縮后的蛋白進行免疫反應，圖4-C結(jié)果表明純化濃縮后的蛋白確實為His-PEBP融合蛋白。

2.4 棉鈴蟲不同齡期和組織中HaPEBP的表達規(guī)律

通過qRT-PCR方法檢測棉鈴蟲不同發(fā)育時期和組織中的表達量，在幼蟲的每個齡期均有表達，在6齡中的表達量最高，其次是預蛹期，在4齡中的表達量最低，且與6齡相比差異顯著（＜0.05），而其他齡期中的表達量變化不大（圖5-A）。在6齡幼蟲的脂肪體、中腸、體壁和頭部中均有表達，其表達量依次降低且差異顯著（＜0.05），頭部的表達量僅是脂肪體中的一半（圖5-B）。

圖2 以鄰接法構(gòu)建的HaPEBP系統(tǒng)進化樹

左圖為二級結(jié)構(gòu)The left figure is secondary structure；H1—H5：α螺旋α helixes；A、B：β折疊片β sheets；β：β轉(zhuǎn)角β turns；γ：γ轉(zhuǎn)角γ turns；形狀∩表示前后兩個β折疊片形成的β發(fā)卡結(jié)構(gòu)Shape ∩ indicates β hairpins between two β sheets。右圖為三級結(jié)構(gòu)The right figure is tertiary structure；深藍色為蛋白N端Dark blue indicates protein N terminal；紅色為蛋白C端Red indicates protein C terminal

A：SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達Induced expression product of the fusion protein by SDS-PAGE analysis；M：蛋白標記物 Protein Marker；1—4：重組菌體誘導前、誘導后、超聲處理后上清和沉淀的總蛋白The total proteins of BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP strain without IPTG induced, with IPTG induced, ultrasonic supernatant with IPTG induced and ultrasonic precipitation with IPTG induced。B：SDS-PAGE檢測融合蛋白的純化The purification of fusion protein by SDS-PAGE analysis；M：蛋白標記物 Protein Marker。C：Western blot驗證純化和超濾后的融合蛋白Western blot analysis of the fusion protein after purified and concentrated；M：預染蛋白標記物 Prestained protein Marker

2.5 HaPEBP響應2-十三烷酮的表達

用4種濃度的2-十三烷酮處理棉鈴蟲不同時間，檢測中腸內(nèi)的表達量。結(jié)果顯示與對照組相比，2-十三烷酮處理后的表達量降低。2.5 mg·g-1處理組中，6 h的表達量與對照相比顯著降低（＜0.001），且隨時間的延長表達量明顯上升至正常水平；5 mg·g-1處理組中，的表達量隨時間的延長增幅不大（=1.835，=0.154），但都顯著低于正常水平；10 mg·g-1處理組的變化趨勢與5 mg·g-1相反，隨著時間的延長逐漸降低，只在6 h處與對照相比無顯著差異（＞0.05）；而15 mg·g-1處理組中的表達量隨著時間的延長先降至最低（20 h，0.50）后回升至最高（48 h，1.44），且48 h的表達量明顯高于正常水平（圖6）。

柱上不同字母表示差異顯著Different letters above the bars indicate signi?cant difference (P＜0.05, one-way ANOVA test)

不同字母表示同一濃度下不同時間的差異顯著Different letters above the bars indicate signi?cant difference in the same concentration group (P＜0.05, one-way ANOVA test)；星號代表同一時間與對照組的差異顯著The asterisks indicate signi?cant difference at the same time compared with the control group (P＜0.05, paired t test)

3 討論

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白是一類分布廣泛且有獨特結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，該蛋白參與MAPK、NF-κB和G蛋白受體等多條信號通路調(diào)控，引起多種不同的生物學反應，從而在老年癡呆癥、糖尿病、腫瘤等多種疾病發(fā)生中起重要作用。隨著PEBP在哺乳動物中的研究增多，該蛋白也逐漸成為一個藥物靶點來抑制相關(guān)病癥的產(chǎn)生[16-18]。

本研究以鼠鞭蟲（）的Tm16蛋白（屬于PEBP-1家族，PDB code: 5tvd）為模板，利用SWISS-MODEL軟件對棉鈴蟲PEBP進行同源建模[19]。結(jié)果顯示這兩個蛋白氨基酸序列相似性為63.04%，PEBP的三級結(jié)構(gòu)中91.4%的氨基酸位于最佳區(qū)域且沒有氨基酸位于不允許區(qū)，表明該三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象穩(wěn)定。且PEBP的三級結(jié)構(gòu)與人PEBP相似，同樣是由4個螺旋和9個折疊片形成球狀的單體，由6個折疊片構(gòu)成一個較大的中心折疊區(qū)，其余3個折疊片組成一個較小的反平行折疊層，2個螺旋位于中心折疊區(qū)的兩邊，其余2個螺旋分別位于蛋白N端和C端，且位于C端的螺旋可調(diào)節(jié)蛋白與配體相互結(jié)合的過程，從而使整個蛋白為一緊湊的球形結(jié)構(gòu)[20-21]。PEBP序列中同樣含有該家族與配體結(jié)合的保守基序，同時在128—134位的RYVFLVY基序與核苷酸結(jié)合折疊基序有同源性，可能是該蛋白與核酸結(jié)合的主要位點，這也許能夠解釋前期酵母單雜交實驗中捕獲到該蛋白與棉鈴蟲啟動子元件的相互作用。

棉鈴蟲是一種完全變態(tài)發(fā)育的昆蟲，同一基因在不同的發(fā)育時期或不同的組織中表達量會出現(xiàn)差異。研究表明，昆蟲在不同階段或不同組織中的含量不同。對6種果蠅在不同組織中的表達量進行檢測，結(jié)果表明這6種在不同組織中的表達量有極大的差異，其中CG10298只表達于精巢組織中，且只存在于精子分化過程中[22]。本研究表明，在幼蟲所有齡期均有表達，且在6齡和預蛹期中的表達量較高。預蛹期是棉鈴蟲從幼蟲至蛹的過渡階段，也是參與變態(tài)發(fā)育所需相關(guān)激素變化較大的時期[23]。例如大黃蜂的和均為在10齡幼蟲和蛹期的表達量明顯高于5齡幼蟲[24]。在6齡幼蟲的脂肪體、中腸、頭部和體壁中均表達且在脂肪體中的表達量最高。昆蟲的脂肪體是昆蟲生長、發(fā)育、變態(tài)和生殖等代謝活動的中心組織，其中含有多種類型的細胞，且可在激素作用下發(fā)生變態(tài)[25]。Reumer等[26]研究發(fā)現(xiàn)，果蠅在幼蟲的脂肪體中高表達，推斷PEBP1作為一種免疫保護蛋白來抵抗細菌感染，過量表達的提高了抗細菌的蛋白進入血淋巴的能力。

植物PEBP對光周期的變化較為敏感，不同的光周期下其表達量也會發(fā)生改變[27]。雖然沒有足夠的證據(jù)表明昆蟲PEBP也會響應光周期的變化，但對亞洲虎蚊（）的研究發(fā)現(xiàn)極端光周期會改變幼蟲體內(nèi)的表達量[28]，這表明昆蟲有可能響應外界環(huán)境的變化。本研究在棉鈴蟲6齡幼蟲的2-十三烷酮亞致死劑量以下選擇了4個濃度，并處理幼蟲不超過48 h，在此范圍內(nèi)大部分幼蟲能夠正常生長[29]?？偟膩碚f，2-十三烷酮處理后的表達量顯著降低，但每個濃度下的趨勢卻不相同。2.5和5 mg·g-1兩組趨勢相似，在6 h后表達量就顯著降低且隨著時間的延長逐漸上升，原因可能是這兩個濃度的芳香氣味較淡，接觸后饑餓的幼蟲會立即取食；2.5 mg·g-1的劑量太低，使幼蟲體內(nèi)的表達量逐漸回升至正常水平，5 mg·g-1的劑量對于的表達量回升來說較高，故48 h內(nèi)仍低于對照組。10和15 mg·g-1兩組在6 h的表達量與對照相比無顯著差異，原因可能是這兩個濃度的芳香氣味較重，大多數(shù)幼蟲接觸后會拒絕取食，且15 mg·g-1組拒食時間長于10 mg·g-1組。10 mg·g-1組在幼蟲開始取食后的表達量持續(xù)低于對照組。15 mg·g-1組在處理12—30 h的表達量顯著低于對照，同時發(fā)現(xiàn)該組幼蟲在30 h會大量提前進入預蛹期，而此后的48 h處表達量顯著高于對照，這一現(xiàn)象可能是由幼蟲的自我保護引起，但誘導過表達的具體生理過程仍需進一步研究。2-十三烷酮作為一種植物次生物質(zhì)，可以引起包括在內(nèi)的多種細胞色素P450氧化酶表達量提高[30]，但是棉鈴蟲和響應2-十三烷酮的表達規(guī)律卻截然相反。筆者課題組前期研究結(jié)果表明被沉默后，棉鈴蟲的蛻皮和變態(tài)過程受阻，表明可能參與棉鈴蟲蛻皮激素代謝通路[31]。WANG等研究表明，蛻皮激素響應的G蛋白偶聯(lián)受體可以轉(zhuǎn)移20-羥基蛻皮激素信號并控制其穿過細胞膜進入細胞質(zhì)中[32]，而PEBP參與了G蛋白偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導過程，因此也有可能在棉鈴蟲蛻皮激素代謝通路中發(fā)揮作用，但是如何參與這一代謝通路，并且是否調(diào)控的表達仍需進一步的研究。

4 結(jié)論

克隆分析了棉鈴蟲（），利用大腸桿菌系統(tǒng)表達出可溶的融合蛋白His-PEBP，并通過鎳柱-咪唑純化法得到了高純度的融合蛋白，時空表達分析顯示在6齡幼蟲和脂肪體中表達量最高，2-十三烷酮處理影響6齡幼蟲中腸的表達量。研究結(jié)果為明確棉鈴蟲PEBP的功能并進一步選擇該基因作為調(diào)控棉鈴蟲種群數(shù)量的分子靶標提供了依據(jù)。

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Cloning and expression of phosphatidylethanolamine binding protein in

ZHAO Jie1, REN SuWei1, LIU Ning2, AI XinYu1, MA Ji1, LIU XiaoNing1

(1College of life science and technology, Xinjiang University, Urumqi 830046;2Institute of Crop Variety Resources, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091)

【Objective】The objective of this study is to clone and analyze phosphatidylethanolamine binding protein (PEBP) gene from, investigate the temporal and spatial expression profile in, and test the expression ofafter 2-tridecanone treatment in the 6th instar larval midgut of. The results will provide a theoretical basis for further studying the function ofPEBP and select the gene as a molecular target to regulate the population of. 【Method】 The cDNA sequence ofwas obtained from midgut of 6th instar larvae by using RACE technique, and its amino acid sequence and protein structure were analyzed. The recombinant vector pET32a-was constructed and transformed it intoBL21 (DE3) strain. The fusion protein was induced by IPTG and identified by SDS-PAGE to confirm its distribution. the His-PEBP was purified using Ni-NTA affinity chromatography. Theexpression profile at different developmental stages, tissues and under 2-tridecanone treatments was determined by qRT-PCR. 【Result】 ThecDNA sequence is 760 bp, and its ORF is 588 bp, encoding 195 amino acids. The predicted molecular weight and isoelectric point of the protein are 21.76 kD and 5.93, respectively. ThePEBP is a cytoplasmic monomer protein without signal peptide, transmembrane region and disulfide bond, which consists of 4-helixes and 9sheets. The soluble fusion protein, which was about 40 kD consistent with predicted 39.1 kD, was synthesized in BL21-pET32a-strain by 1 mmol·L-1IPTG induced 4 h at 37℃. And then the pure His-PEBP (183.3 ng·μl-1) was obtained through Ni-NTA column and imidazole gradient buffers.was expressed at all larval stages (1st-6th instar larvae and prepupa), and the highest expression level was observed in the 6th instar larvae. It was also expressed in the fat body, midgut, head and integument of the 6th instar larvae and the highest expression was found in the fat body. The expression ofin the midgut of 6th instar larvae decreased after treatment with different concentrations of 2-tridecanone. In the low concentration groups (2.5 and 5 mg·g-1), the expression ofsignificantly decreased at 6 h and gradually increased over time. However, the expression ofdecreased at 12 h in the high concentrations (10 and 15 mg·g-1), the mRNA content decreased firstly and then increased over time. 【Conclusion】ThecDNA was cloned and analyzed. The fusion protein His-PEBP was synthesized and purified using the prokaryotic expression system. The results of temporal and spatial expression showed that thewas highly expressed in 6th instar larvae and fat body. The expression ofsignificantly decreased after treatment with 2-tridecanone in the midgut of 6th instar larvae.

; phosphatidylethanolamine binding protein; prokaryotic expression; temporal and spatial expression; 2-tridecanone

（責任編輯 岳梅）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.007

2017-09-15；

2017-11-03

國家自然科學基金（31471781）、新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程（qn2015yx001）

趙潔，E-mail：zhaojie198967@163.com。

劉小寧，E-mail：liuxn0103@sina.com