豬CBR1基因不同拷貝形式克隆及其多態(tài)性分析

齊傳翔，徐奎，牟玉蓮，楊述林，李奎，吳添文

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豬CBR1基因不同拷貝形式克隆及其多態(tài)性分析

齊傳翔1,2，徐奎1,3，牟玉蓮1，楊述林1，李奎1，吳添文1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3山東藍(lán)思種業(yè)股份有限公司，山東日照 276800）

【目的】獲得豬CBR1基因不同拷貝形式編碼區(qū)序列，了解其序列特征，分析豬CBR1基因不同拷貝形式的多態(tài)性及其與繁殖性能間的相關(guān)性?！痉椒ā恳晕逯干截i睪丸組織的cDNA為模板，采用克隆測(cè)序技術(shù)獲得豬CBR1基因不同拷貝形式編碼區(qū)序列。利用DNASTAR對(duì)CBR1不同拷貝形式編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。利用DNAMAN軟件分析豬CBR1基因不同拷貝形式間的同源性，及其與多個(gè)哺乳動(dòng)物間的同源性。利用ExPaSy提供的Protparam 在線軟件分析豬CBR1基因不同拷貝的蛋白質(zhì)理化特性。采集136頭大白和47頭長(zhǎng)白繁殖母豬耳組織樣，提取基因組DNA，采用PCR-測(cè)序檢測(cè)豬CBR1基因不同拷貝形式的多態(tài)位點(diǎn)，分析其與繁殖性能的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】豬CBR1基因的3個(gè)不同拷貝形式均編碼3個(gè)外顯子，其編碼區(qū)序列全長(zhǎng)分別為870，870和846bp，其12—18位氨基酸殘基均為保守的GlyXXXGlyXGly序列，符合CBRs家族的結(jié)構(gòu)特性。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，CBR1基因不同拷貝形式的CDS序列同源性達(dá)87%以上，不同哺乳動(dòng)物間的CBR1基因的CDS序列同源性達(dá)82%以上，可見(jiàn)哺乳動(dòng)物CBR1基因在進(jìn)化過(guò)程中比較保守。CBR1的3種不同拷貝形式編碼蛋白質(zhì)的理化特性較為相近，均不穩(wěn)定，且為親水性蛋白，說(shuō)明其3個(gè)不同拷貝形式可能在體內(nèi)發(fā)揮著類似的功能。多態(tài)性分析結(jié)果顯示，拷貝V1中發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNP位點(diǎn)，拷貝V2中發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，拷貝V3中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)。大白豬中，拷貝V1的啟動(dòng)子上游153 bp處的A/T突變和外顯子3的379 bp處的C/T突變，拷貝V2上游10 bp處的AC插入突變、外顯子1—63 bp處C/T突變和內(nèi)含子1—76 bp處G/T突變與產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)。長(zhǎng)白豬中的SNP位點(diǎn)則與繁殖性能不相關(guān)?！窘Y(jié)論】獲得了豬CBR1基因不同拷貝形式的編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與大白豬經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，CBR1基因可能作為有價(jià)值的候選基因應(yīng)用于大白豬的繁殖性能選育。

豬；羰基還原酶1基因；重測(cè)序；de-novo組裝

0 引言

【研究意義】提高繁殖性能是豬育種的重要目標(biāo)。純系選育和配套雜交一直是豬傳統(tǒng)育種的重要手段，但其周期長(zhǎng)，需耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，如丹麥用50年的時(shí)間才將長(zhǎng)白豬的胎產(chǎn)仔數(shù)提高到1.0頭[1]，嚴(yán)重制約豬傳統(tǒng)育種的發(fā)展。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，利用相關(guān)技術(shù)研究影響豬繁殖性能的相關(guān)基因，尋找提高豬繁殖性能的新方法[2]，對(duì)更好地了解豬的分子育種、縮短育種時(shí)間，加快育種進(jìn)程具有重要的理論和實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)豬繁殖性狀的分子遺傳改良開(kāi)展了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor, ER）基因[3]、催乳素（prolactin receptor, PRLR）基因[4]、促卵泡素β亞基（follitropin subunit beta, FSHβ）基因[5-6]、骨橋蛋白（osteopontin, OPN）[7]、視黃醇結(jié)合蛋白4（retinol binding protein 4, RBP4）[8]等均不同程度地影響豬的繁殖效率。羰基還原酶（carbonyl reductases, CBRs）是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的氧化還原酶，其重要成員——羰基還原酶1（carbonyl reductases 1, CBR1），在藥物代謝[9]、細(xì)胞保護(hù)[10-11]和腫瘤發(fā)生[12-15]等眾多生理過(guò)程發(fā)揮著重要作用。CBR1也在生殖系統(tǒng)中表達(dá)[16-17]，主要參與前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）向前列腺素F2-alpha（PGF2α）的轉(zhuǎn)變[18-19]，在動(dòng)物的妊娠階段發(fā)揮著重要作用[20-22]。前期研究對(duì)五指山豬基因組進(jìn)行重測(cè)序[23]，通過(guò)De-novo組裝發(fā)現(xiàn)：豬CBR1基因具有4個(gè)拷貝，其中3個(gè)拷貝具有完整的開(kāi)放閱讀框，另一個(gè)為假基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于人、嚙齒類動(dòng)物CBR1基因功能研究的報(bào)道較多，但對(duì)于豬CBR1基因的報(bào)道較少，尤其是其多個(gè)不同拷貝形式的序列及其多態(tài)性與繁殖性能間的相關(guān)性仍未見(jiàn)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)選擇CBR1基因作為研究影響母豬繁殖性能的候選基因，獲取該基因的不同拷貝形式的編碼區(qū)序列，探討其在多態(tài)性與母豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)性，以期為豬的繁殖性能選育提供新的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年1月至2015年12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)樣本

五指山豬睪丸組織樣品于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所南口基地采集，置于液氮中凍藏，用于提取組織總RNA。對(duì)江蘇省常州市豬場(chǎng)的48頭大白母豬和47頭長(zhǎng)白母豬、江蘇省南通市豬場(chǎng)的42頭大白母豬、海南省?？谑胸i場(chǎng)的46個(gè)大白母豬的耳組織進(jìn)行采樣，置于裝有75%酒精的離心管中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用于提取基因組DNA。采集樣本的母豬均為隨機(jī)選取，體況良好，并有繁殖性能記錄。

1.2 RNA和DNA提取

采用 TRlzol Reagent（Invitrogen 公司）提取五指山豬睪丸組織總RNA，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體方法詳見(jiàn)說(shuō)明書。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱中保存。

采用常規(guī)的酚/氯仿法提取不同豬種耳組織基因組。

1.3 RT-PCR與克隆測(cè)序

根據(jù)前期五指山豬重測(cè)序de novo拼接結(jié)果，于NCBI網(wǎng)站的引物設(shè)計(jì)軟件(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）對(duì)豬CBR1基因具有完整開(kāi)放閱讀框的3個(gè)拷貝形式（V1、V2和V3）設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1，并以五指山豬睪丸組織的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min、退火1 min、72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Gel Purification Kit 凝膠回收試劑盒（Omega公司）進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。純化產(chǎn)物克隆入pMD19-T vector（TaKaRa公司），并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；采用質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen 公司）提取質(zhì)粒，送天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 豬CBR1基因不同拷貝形式mRNA序列擴(kuò)增引物

1.4 序列分析

利用DNASTAR對(duì)CBR1不同拷貝形式編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。利用DNAMAN軟件分析豬CBR1基因不同拷貝形式間的序列相似度，及其與其它物種的同源性。利用ExPaSy提供的Protparam在線軟件分析豬CBR1基因不同拷貝的蛋白質(zhì)理化特性。部分哺乳動(dòng)物CBR1基因序列均從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載，包括大鼠（, NM_019170.2）、小鼠（, NM_007620.2）、人（, NM_ 001757.3）、猴（, XM_015132918.1）、牛（, NM_001034513.1）、羊（, XM_004003397.3）和犬（, XM_847582.3）、豬（, NM_214073.1）。

1.5 不同豬種CBR1基因多態(tài)性分析

為了進(jìn)一步檢測(cè)CBR1基因不同拷貝形式的SNP位點(diǎn)，并分析這些SNP位點(diǎn)對(duì)于母豬產(chǎn)仔性能的影響，根據(jù)前期五指山豬重測(cè)序de novo拼接結(jié)果，于NCBI網(wǎng)站的引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)豬CBR1基因具有完整開(kāi)放閱讀框的3個(gè)拷貝形式設(shè)計(jì)了9對(duì)引物，涵蓋了該基因三個(gè)拷貝的所有外顯子區(qū)域（表2）。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性40-60 s、退火40—60 s、72℃延伸40-60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS19.0軟件的廣義線性模型（GLM）對(duì)各繁殖性能值與基因型間的關(guān)系進(jìn)行最小二乘法估計(jì)：繁殖性能觀察值=群體均值+基因型效應(yīng)+隨機(jī)殘差效應(yīng)，結(jié)果以“最小二乘均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 豬CBR1基因不同拷貝形式的擴(kuò)增

鑒于CBR1基因在生殖器官中表達(dá)，本研究采集了五指山豬的睪丸組織，并進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。以五指山豬睪丸組織cDNA為模板，利用CBR1-V1、CBR1-V2和CBR1-V3引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到特異性良好且與目的片段大小一致的擴(kuò)增片段（圖1）。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為940、1 116和952 bp，與引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期長(zhǎng)度一致。

2.2 豬CBR1基因不同拷貝形式編碼區(qū)序列分析

將mRNA序列與前期獲得的五指山豬重測(cè)序結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，V1的CDS全長(zhǎng)為870 bp，編碼289個(gè)氨基酸，含3個(gè)外顯子，長(zhǎng)度分別為289，108和473 bp。V2的mRNA序列與NCBI中的CBR1基因序列（NM_214073.1）相符，其CDS全長(zhǎng)為870 bp，編碼289個(gè)氨基酸，含3個(gè)外顯子，長(zhǎng)度分別為289，108和473 bp。V3的CDS全長(zhǎng)為846 bp，編碼281個(gè)氨基酸，含3個(gè)外顯子，長(zhǎng)度分別為289，108和449 bp。3個(gè)拷貝形式所有內(nèi)含子邊界均符合GT-AG規(guī)則。利用DNASTAR對(duì)CBR1不同拷貝形式編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，3個(gè)拷貝氨基端的12—18位氨基酸殘基為保守的GlyXXXGlyXGly序列（圖2），符合CBRs家族的結(jié)構(gòu)特性[21]。

1-2：V1擴(kuò)增產(chǎn)物，3-5：V2擴(kuò)增產(chǎn)物，6-7：V3擴(kuò)增產(chǎn)物，M：100 bp marker

利用DNAMAN軟件對(duì)CBR1基因的CDS序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)V1與V2序列的同源性高達(dá)90%，與V3的同源性高達(dá)87%。此外，CBR1基因在不同哺乳動(dòng)物物種間的同源性較高，人與猴間的同源性最高，為96%，與豬之間的同源性為84%，與大鼠、小鼠間的同源性略低，但也達(dá)到了82%。

2.3 豬CBR1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

使用ExPaSy提供的Protparam在線軟件（http://web.Expasy.org/protparam）分析豬CBR1基因不同拷貝形式蛋白質(zhì)序列的各項(xiàng)理化參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：豬CBR1基因拷貝V1的分子式為C1397H2255N393O425S13，分子量為31 773.43，理論等電點(diǎn)為6.12，消光系數(shù)為28 460，體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)41.21，脂肪系數(shù)為91.00，疏水性均值（GRAVY）為-0.208。豬CBR1基因拷貝V2的分子式為C1401H2243N395O419S11，分子量為31 677.28，理論等電點(diǎn)為7.60，消光系數(shù)為29825，體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)42.15，脂肪系數(shù)為87.34，疏水性均值為-0.237。豬CBR1基因拷貝V3的分子式為C1352H2183N379O408S10，分子量為30 596.10，理論等電點(diǎn)為7.63，消光系數(shù)為22 710，體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)42.31，脂肪系數(shù)為90.50，疏水性均值為-0.205。上述結(jié)果表明，CBR1基因的3個(gè)不同拷貝形式的蛋白質(zhì)均較不穩(wěn)定（一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)小于40時(shí)，表示預(yù)測(cè)的蛋白穩(wěn)定；大于40時(shí)，預(yù)測(cè)蛋白不穩(wěn)定），且為親水性蛋白。

表2 CBR1基因不同拷貝形式多態(tài)性擴(kuò)增引物信息

圖2 豬CBR1基因不同拷貝形式的氨基酸序列分析

左圖：豬CBR1基因不同拷貝形式間的同源性分析；右圖：豬CBR1基因拷貝V2與不同物種間的同源性分析

2.4 豬CBR1基因不同拷貝形式的多態(tài)性分析及其與繁殖性能的相關(guān)性

針對(duì)常州、南通和?？谑械?36頭大白和47頭長(zhǎng)白繁殖母豬的進(jìn)行SNP分型。所涉及的引物涵蓋了3個(gè)拷貝的所有外顯子區(qū)域。序列拼接結(jié)果顯示，所有的大白、長(zhǎng)白豬個(gè)體，均含有3個(gè)完整的CBR1不同的拷貝類型，序列與五指山豬一致。

用于不同拷貝基因型分析的9對(duì)引物中，5對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn)。

拷貝V1中，CBR1-V1-EX1擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)到拷貝V1啟動(dòng)子上游153 bp處存在A/T突變；CBR1-V1-EX2擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)到拷貝V1內(nèi)含子1的836 bp處存在A/G突變；CBR1-V1-EX3擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)到拷貝V1外顯子3的73 bp處存在A/G突變，賴氨酸突變?yōu)榫彼幔?52 bp處均存在A/G突變，為同義突變，均編碼纈氨酸，379 bp處存在C/T突變，絲氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

拷貝V2中，CBR1-V2-EX1擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測(cè)到拷貝V2啟動(dòng)子上游10 bp處存在CA插入突變，外顯子1的63 bp檢測(cè)到C/T突變，為同義突變，均編碼異亮氨酸，67 bp處均檢測(cè)到C/T突變，精氨酸突變?yōu)樯彼幔瑑?nèi)含子1的76 bp處檢測(cè)出G/T突變。

拷貝V3中，CBR1-V3-EX3擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)到拷貝V3的外顯子3的358 bp存在C/T突變，纈氨酸突變?yōu)楸彼?，外顯子3的374 bp存在A/G突變，為同義突變，均編碼亮氨酸（圖4）。

其中，CBR1不同拷貝形式的多態(tài)性與繁殖性能間的分析結(jié)果顯示，各SNP位點(diǎn)上不同基因型的長(zhǎng)白豬的經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)、經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)差異均不顯著（≥0.05）。大白豬中，拷貝V1的啟動(dòng)子上游153bp TT基因型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AT基因型（=0.047），外顯子3—379 bp處TT基因型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于CT基因型（=0.042）；拷貝V2上游10 bp處無(wú)AC插入的純合子基因型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AC插入純合子基因型（=0.028），外顯子1—63 bp處CC基因型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于TT基因型（=0.027），內(nèi)含子1—76 bp處GG基因型個(gè)體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于TT基因型（=0.026，表3）。

3 討論

提高繁殖性能是豬育種的重要目標(biāo)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已就豬繁殖性狀做了大量的研究，但幾乎都是從單個(gè)或者多個(gè)基因的結(jié)構(gòu)、功能及其與上下游基因之間的關(guān)系進(jìn)行研究[24-26]。關(guān)于基因不同拷貝數(shù)及其拷貝類型對(duì)于繁殖性狀的影響及其作用機(jī)制卻尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于前期對(duì)五指山豬的基因組重測(cè)序的結(jié)果，針對(duì)參與繁殖性能調(diào)控的多拷貝基因——CBR1開(kāi)展研究，為進(jìn)一步增加對(duì)豬繁殖性狀調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供了新的分子基礎(chǔ)。

本研究獲得了CBR1基因3種不同拷貝形式的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)不同拷貝形式氨基端的12—18位氨基酸殘基為保守的GlyXXXGlyXGly序列，符合CBRs家族的結(jié)構(gòu)特性，可借此形成Rossman折疊，與不同輔因子結(jié)合[27]。

表3 CBR1基因多態(tài)性與繁殖性能相關(guān)性分析

相同指標(biāo)同列數(shù)據(jù)標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）；標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著（＞0.05）

In the same column, values with different small letter mean significant difference (＜0.05); While with the same or no letter mean no significant difference (＞0.05)

CBR1基因不同拷貝類型形式的CDS序列同源性達(dá)87%以上，不同哺乳動(dòng)物間的CBR1基因的CDS序列同源性達(dá)82%以上，一方面說(shuō)明不同哺乳動(dòng)物CBR1基因在進(jìn)化過(guò)程中比較保守，另一方面也說(shuō)明CBR1可能在不同物種內(nèi)均發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

CBR1基因的3種不同拷貝形式編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，生理、生化特性接近，說(shuō)明3個(gè)不同拷貝形式可能在體內(nèi)發(fā)揮著類似的功能。同時(shí)，這3種蛋白質(zhì)均不穩(wěn)定，且為親水性蛋白，可能與其發(fā)揮氧化還原作用有關(guān)。

目前，關(guān)于豬CBR1基因的SNP分型尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，3個(gè)拷貝形式中共計(jì)檢測(cè)出11個(gè)SNP位點(diǎn)，拷貝V1中發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNP位點(diǎn)，拷貝V2中發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，拷貝V3中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)。大白豬中，拷貝V1的啟動(dòng)子上游153 bp處的A/T突變和外顯子3—379 bp的C/T突變，拷貝V2上游10 bp處的AC插入突變、外顯子1—63 bp處C/T突變和內(nèi)含子1—76 bp處G/T突變與產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)。研究表明，在母豬發(fā)情周期、胚胎植入以及妊娠等炎性事件中，黃體變化起著重要作用[28-29]，而由于PGE2和PGF2α對(duì)黃體分別具有保護(hù)和溶解功能[30]，因此作為催化PGE2向PGF2α轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[31]，CBR1的表達(dá)可能受到上述SNP位點(diǎn)的影響而發(fā)生改變，但有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。此外，在長(zhǎng)白豬中，這些SNP位點(diǎn)上不同基因型母豬的繁殖性能間未檢測(cè)到顯著差異，一方面可能與品種差異性有關(guān)，另一方面也可能是本研究中長(zhǎng)白母豬的樣本數(shù)較少，導(dǎo)致一些基因型的檢出率低所致。今后將進(jìn)一步補(bǔ)充樣本，包括采集以高產(chǎn)仔數(shù)而聞名的太湖豬種進(jìn)行研究，進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究獲得了豬CBR1基因3個(gè)不同拷貝形式的編碼區(qū)序列，了解了其基因特征和蛋白性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與大白豬經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為大白豬的繁殖性能選育提供了理論基礎(chǔ)和新的分子標(biāo)記。

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Cloning of Porcine CBR1 Gene’s Different Copy Forms and Analysis of Its Polymorphism

QI ChuanXiang1,2, XU KUI1,3, MU YuLian1,YANG ShuLin1, LI Kui1, WU TianWen1

(1Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Veterinary Medicine, Yangzhou University/Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, Jiangsu;3Shandong Lansi Seeds Industry Co.,Ltd, Rizhao 276800, Shandong)

【Objective】 In order to obtain and analysis the different copy forms of CBR1 gene coding region, and analysis the correlation between polymorphism and reproductive performance of different copy forms of CBR1 gene in pigs.【Method】 Based on the cDNA of the Wuzhishan pig’s testis , the different copy sequences of CBR1 gene were obtained by cloning sequencing technology. The amino acid sequences encoded by different copy forms of CBR1 gene were analyzed by DNASTAR software. Homology between different copy forms of porcine CBR1 gene, and that compared with other mammals were analyzed using DNAMAN software. The physical and chemical properties of different proteins of porcine CBR1 gene were analyzed by Protparam online software on ExPaSy. 136 Yorkshire and 47 Landrace pig ears samples were selected for DNA extraction and PCR-sequencing to explore the relationship between polymorphism of CBR1 gene and porcine reproductive performance. 【Result】 All the three different copies of CBR1 gene encoded 3 exons, and the sequence length of the coding region were 870bp, 870bp and 846bp respectively. Their 12-18th amino acid residues were GlyXXXGlyXGly, which were in accordance with the CBRs family structural characteristics. The results of homology comparison showed that the CDS sequence homology among different copies of CBR1 gene was more than 87%, and more than 82% among different mammals, indicated that the CBR1 gene of mammal was conserved in evolution process. The physical and chemical properties of 3 different copies of CBR1 were similar, all of them were unstable and belong to hydrophilic proteins, which indicated that they may play a similar role in vivo. Polymorphism analysis showed that 5 SNPs were found in copy V1, 4 SNPs were found in copy V2, and 2 SNPs were found in copy V3. In the Yorkshire pigs, the A/T mutation at the promoter upstream region 153 bp and the C/T mutation at exon3 379 bp in V1; AC insertion at the promoter upstream region 10 bp, C/T mutation at exon 1 63 bp and G/T mutation at intron1 76 bp in V2, were significantly correlated with the multiparous alive litter size, while the SNPs in Landrace pigs were not associated with reproductive performance. 【Conclusion】 Coding region sequence of 3 different copies of CBR1 gene were obtained; 5 SNPs were found significantly associated with multiparous alive litter size , suggested that CBR1 gene may be used as a valuable candidate gene for improving breeding performance of Yorkshire pigs.

swine; CBR1 gene; re-sequencing; de-novo assembly

（責(zé)任編輯 林鑒非）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.018

2017-08-16；

2018-01-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（31201780）、國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃（2015CB943101）

齊傳翔，E-mail：245484498@qq.com。

吳添文，E-mail：wutianwen@caas.cn