玉米SLAF標(biāo)記的開發(fā)及其在玉米果皮纖維素含量 BSA分析中的應(yīng)用

杜龍崗，王美興

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玉米SLAF標(biāo)記的開發(fā)及其在玉米果皮纖維素含量 BSA分析中的應(yīng)用

杜龍崗，王美興

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021）

【目的】降低果皮纖維素是甜玉米品質(zhì)改良的重要目標(biāo)，然而玉米果皮纖維素含量調(diào)控的研究甚少，相關(guān)調(diào)控基因尚未定位。利用纖維素含量差異的重組自交系（RILs）群體，通過(guò)特異位點(diǎn)擴(kuò)增片段（specific-locus amplified fragment-sequencing，SLAF）測(cè)序和分離混池分析（bulked segregant analysis，BSA）定位控制玉米果皮纖維素含量的染色體區(qū)段，鑒定調(diào)控玉米果皮纖維素含量的候選基因?！痉椒ā恳怨だw維素含量顯著差異的E327和G5-1為親本，構(gòu)建重組自交系（RILs）。對(duì)RILs群體進(jìn)行果皮纖維素含量的測(cè)定，并根據(jù)纖維素含量的結(jié)果選擇纖維素含量高、低的樣本進(jìn)行混池，用于SLAF標(biāo)簽的鑒定和BSA分析。在BSA分析中，首先對(duì)兩混池和2個(gè)親本DNA用Ⅲ和166Ⅱ進(jìn)行酶切，回收414—464 bp的酶切片段進(jìn)行Illumina建庫(kù)，并進(jìn)行SLAF測(cè)序，然后根據(jù)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽開發(fā)SNP標(biāo)記，利用SNP標(biāo)記對(duì)玉米果皮纖維素含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定調(diào)控甜玉米果皮纖維素含量的染色體區(qū)段。分析這些區(qū)段所包含的玉米基因，并找到它們對(duì)應(yīng)的擬南芥同源基因，通過(guò)查閱擬南芥相關(guān)基因功能研究的文獻(xiàn)，進(jìn)一步鑒定控制玉米果皮纖維素含量的候選基因?！窘Y(jié)果】?jī)捎H本和2個(gè)混池SLAF建庫(kù)測(cè)序得到的SLAF符合預(yù)期，基于SLAF測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定了73 786個(gè)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，這些SLAF標(biāo)簽均勻分布在玉米的10條染色體上。在這些多態(tài)性標(biāo)簽中得到了523 395 SNP位點(diǎn)信息。通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，調(diào)控果皮纖維素變異的基因被定位到玉米基因組的6個(gè)染色區(qū)段，都位于玉米的第5染色體上。在這些區(qū)段上，一共有47個(gè)玉米基因。通過(guò)進(jìn)一步的研究分析，在這些關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)段最終確定了9個(gè)候選基因?！窘Y(jié)論】定位到調(diào)控玉米果皮纖維素的含量的基因，表明此方法可以用于基因定位。

玉米；果皮；纖維素；SLAF測(cè)序；BSA分析

0 引言

【研究意義】分子標(biāo)記開發(fā)對(duì)基因定位和分子標(biāo)記輔助育種有著重要意義，在玉米中采用SLAF-Seq可以快速開發(fā)出大量的多態(tài)性標(biāo)記；果皮是玉米籽粒重要的組成部分之一，與玉米籽粒的抗性、脫水速度等性狀相關(guān)。對(duì)甜玉米而言，果皮柔嫩度是甜玉米食用品質(zhì)的決定因素之一，影響適口性這一重要的品質(zhì)性狀。果皮的柔嫩度作為衡量甜玉米口感品質(zhì)的重要性狀指標(biāo)，其與果皮厚度和果皮纖維素含量有著密切的關(guān)系。鑒于果皮纖維素含量是玉米果皮柔嫩度的主要化學(xué)形成因子，對(duì)玉米纖維素含量調(diào)控基因區(qū)段的定位和候選基因的確定對(duì)玉米品質(zhì)改良將具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】中國(guó)玉米種植面積和產(chǎn)量均居世界第二位，僅次于美國(guó)，是中國(guó)的主要糧食作物之一[1]。盡管中國(guó)玉米生產(chǎn)約占世界總產(chǎn)量的20%，但仍需進(jìn)口大量玉米來(lái)滿足國(guó)內(nèi)所需。其中，飼料用玉米占總需求的70%以上，其余用作食用，工業(yè)等。近年來(lái)，中國(guó)特用玉米正大力發(fā)展，包括甜玉米、糯玉米、爆裂玉米等。特用玉米具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和加工價(jià)值[2]。甜玉米糧經(jīng)果菜兼用，是重要的特用玉米之一[3]。其不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及硒、鎂、鐵等抗癌微量元素，還含有大量的膳食纖維，具有消渴、利尿、解毒，增加腸胃蠕動(dòng)，治療便秘和防止結(jié)腸癌功效[4-5]。近年來(lái)，玉米栽培面積逐年上升，市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)甜玉米的需求量不斷增加。同時(shí)，消費(fèi)者對(duì)甜玉米的品質(zhì)要求也不斷提高[6]。因此，甜度高、口感鮮脆、風(fēng)味獨(dú)特是甜玉米育種中除了豐產(chǎn)性好、抗病性強(qiáng)之外的重要目標(biāo)[7-10]。目前，一些甜玉米以及超甜玉米品種如金銀898[11]、滬甜１號(hào)[12]、閩甜6855[13]等品種的培育都朝著改善甜玉米的口感上發(fā)展。但是，中國(guó)的甜玉米品種與國(guó)外特別是美國(guó)相比尚有較大的差距，最大的不足是果皮柔嫩度差導(dǎo)致渣多、口感粗糙等問(wèn)題，這也是現(xiàn)階段中國(guó)甜玉米品質(zhì)改良所面臨的瓶頸。張士龍等[14]采用硬度計(jì)法測(cè)定了甜玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中的果皮柔嫩度值，發(fā)現(xiàn)甜玉米的果皮柔嫩度受到發(fā)育時(shí)期，種植環(huán)境的影響，但果皮柔嫩度的好壞本質(zhì)上仍決定于材料本身。另有研究表明，玉米果皮柔嫩度與籽粒的果皮厚度呈負(fù)相關(guān)[15]，口感與果皮粗纖維含量的負(fù)相關(guān)也達(dá)到顯著水平[16]。果皮厚度是玉米果皮柔嫩度的主要物理形成因子，而果皮纖維素含量則是玉米果皮柔嫩度的主要化學(xué)形成因子[14]。一般情況下，甜玉米的粗纖維含量均較高[17]，因此，降低果皮纖維素含量對(duì)于甜玉米品質(zhì)改良至關(guān)重要。浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱雜糧研究室的研究也表明甜玉米果皮細(xì)胞層數(shù)和果皮纖維素含量是影響果皮柔嫩性的關(guān)鍵因素，通過(guò)降低果皮細(xì)胞層數(shù)和果皮纖維素含量可以提高甜玉米的柔嫩性（王美興等，未發(fā)表數(shù)據(jù)）。因此，甜玉米柔嫩度的改良需要在減少果皮細(xì)胞層數(shù)的同時(shí)降低果皮纖維素的含量，在果皮細(xì)胞層數(shù)無(wú)法減少的情況下，降低果皮纖維素含量則是玉米柔嫩度改良的唯一途徑。【本研究切入點(diǎn)】盡管中國(guó)已育成了多個(gè)甜玉米品種[11-13]，但是，甜玉米柔嫩度品質(zhì)改良的研究還比較少，甜玉米果皮纖維素含量調(diào)控的研究也未見報(bào)道，控制此性狀的QTL位點(diǎn)和調(diào)控基因也尚未定位?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)玉米果皮纖維素含量差異的RILs群體中纖維素含量高、低材料和親本進(jìn)行SLAF測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析的方法開發(fā)出多態(tài)性的SLAF標(biāo)記，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)BSA的分析方法，定位調(diào)控玉米纖維素含量的染色體區(qū)段，將此區(qū)段的基因映射到擬南芥基因組，通過(guò)對(duì)比擬南芥基因功能，確定調(diào)控玉米果皮纖維素含量的候選基因。為玉米果皮纖維素含量品質(zhì)改良提供理論依據(jù)和基因資源信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料及RILs群體的構(gòu)建

以果皮纖維素含量顯著差異的E327和G5-1為親本，構(gòu)建重組自交系（RILs）。E327為母本，其纖維素含量為17.62%；G5-1為父本，纖維素含量為11.34%。在138份F6代重組自交系中選擇28個(gè)纖維素含量高的植株、22個(gè)纖維素含量低的植株進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.2 纖維素含量測(cè)定

籽粒浸泡24 h，剝?nèi)」?，將果皮?0℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，然后完全粉碎。取樣品測(cè)定水分含量（w）；G4玻璃砂芯漏斗于500℃灼燒至質(zhì)量恒定；精確稱取干燥樣品1.00—1.05 g（m0），放入250 mL潔凈干燥的錐形瓶中，加入25 mL硝酸-乙醇混合液[18]，裝上回流冷凝管，沸水浴加熱1 h，用G4玻璃砂芯漏斗抽濾去除溶劑，重復(fù)上述操作3—5次，直至纖維變白。用10 mL硝酸-乙醇混合液洗滌殘?jiān)?，再用熱水洗滌至洗滌液用甲基橙試?yàn)不呈酸性反應(yīng)為止，最后用無(wú)水乙醇洗滌2次，抽干濾液，將盛有殘?jiān)牟Ａ靶韭┒芬迫牒嫦?，?05℃烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量（m1），然后置于坩堝中500℃灼燒至質(zhì)量恒定，稱取質(zhì)量（m2）。

1.3 SALF文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序

對(duì)參與混池的各單株取等量的葉片，混合得到高纖維素混池樣品（28單株）和低纖維素混池樣品（22單株），采用CTAB法提取親本E327、G5-1和兩混池的DNA。對(duì)玉米參考基因組進(jìn)行電子酶切，選擇Ⅲ和166Ⅱ酶對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶切并回收414—464 bp的酶切片段，對(duì)回收得到的酶切片段（SLAF標(biāo)簽）進(jìn)行3′端加A處理、連接Dual-index測(cè)序接頭[19]、PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫(kù)質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeqTM2500進(jìn)行測(cè)序。

1.4 多態(tài)性SLAF標(biāo)簽的鑒定及分布

通過(guò)水稻對(duì)照數(shù)據(jù)評(píng)估Ⅲ+166Ⅱ的酶切效率，以此判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程的準(zhǔn)確性和有效性。根據(jù)序列相似性將每個(gè)樣本測(cè)序產(chǎn)生的reads進(jìn)行聚類，聚類到一起的reads來(lái)源于同一個(gè)SLAF片段（SLAF標(biāo)簽）。一個(gè)SLAF標(biāo)簽在不同樣品間序列有差異（包括SNP和InDel），即定義為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽[20]。統(tǒng)計(jì)玉米各染色體上SLAF標(biāo)簽和多態(tài)性SLAF標(biāo)簽的分布并作圖。

1.5 BAS關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)多態(tài)性SLAF標(biāo)記的信息，使用GTAK對(duì)親本與子代混池進(jìn)行SNP開發(fā)。在進(jìn)行BSA分析前，過(guò)濾任一混池中read支持度小于3的位點(diǎn)和與相應(yīng)親本的SNP類型差異的位點(diǎn)，得到高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上識(shí)別兩混池間差異的位點(diǎn)。采用ED（算法[21]計(jì)算與目的基因連鎖的區(qū)域。該算法利用混池間差異SNP的頻率的差異，計(jì)算兩混池間的SNP的ED值，ED值越大表明該SNP在兩混池間的差異越大。根據(jù)連鎖的原理，真實(shí)的關(guān)聯(lián)區(qū)域附近的SNP位點(diǎn)會(huì)傾向于在兩混池間表現(xiàn)出顯著性差異，因此，目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的ED值較大，通過(guò)作圖，可以在目標(biāo)關(guān)聯(lián)區(qū)域附近觀察到較明顯的峰。為消除背景噪音，對(duì)原始ED值利用LOESS算法[21]進(jìn)行擬合回歸曲線操作，確定顯著性閾值，并通過(guò)擬合曲線確定最終關(guān)聯(lián)區(qū)域。公式如下：

式中，高/高/高/高：在SNP位點(diǎn)上A/T/C/G堿基高纖維素混池測(cè)序reads中出現(xiàn)頻率；低/低/低/低：在SNP位點(diǎn)上A/T/C/G堿基低纖維素混池測(cè)序reads中出現(xiàn)頻率。

2 結(jié)果

2.1 RILs分離群體的建立

纖維素含量受多基因共同調(diào)控。以果皮纖維素含量較高的甜玉米自交系E327和果皮纖維素含量較低的甜玉米自交系G05-1為親本，構(gòu)建了纖維素含量變化的RILs群體。在第六代RILs群體中，纖維素含量呈現(xiàn)連續(xù)變化，最高的纖維含量為21.3%，而最低為9.3%（電子附表1）。為了開發(fā)玉米果皮纖維素含量的分子標(biāo)記和定位相關(guān)調(diào)控基因，在RILs群體中挑選28個(gè)高纖維含量（17.3%—21.3%）和22個(gè)低纖維素含量（9.3%—14.0%）的兩組植株，進(jìn)行BSA（bulked segregate analysis）分析。

2.2 SLAF文庫(kù)的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

從JGI網(wǎng)站（https://jgi.doe.gov/）下載玉米參考基因組序列，其大小為2.05 GB，GC含量為46.89%。對(duì)玉米的參考基因組進(jìn)行電子酶切，最終確定選用Ⅲ和166Ⅱ限制性內(nèi)切酶對(duì)進(jìn)行SLAF文庫(kù)構(gòu)建，酶切片段長(zhǎng)度在414—464 bp的序列定義為SLAF標(biāo)簽，預(yù)測(cè)可得到246 254個(gè)SLAF標(biāo)簽（電子附表2），這些標(biāo)簽在玉米基因組上分布均勻（電子附表3），能滿足基因定位和進(jìn)一步開發(fā)分子標(biāo)記的要求。

對(duì)親本E327，G05-1和高、低纖維素混池4個(gè)樣品用Ⅲ和166Ⅱ進(jìn)行雙酶切，Illumina建庫(kù)，并篩選insert為400—500 bp的片段進(jìn)行Illumnia HiSeq 2500測(cè)序。共獲得39.77 M reads數(shù)據(jù)，測(cè)序平均Q30為87.57%，平均GC含量為43.59%。親本和2個(gè)混池的read數(shù)和數(shù)據(jù)質(zhì)量如表1所示。測(cè)序質(zhì)量評(píng)估和堿基分布檢查表明NGS（next-generation sequencing）測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)合格。雙端比對(duì)效率為 95.76%，符合實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)Control測(cè)序pair-end mapped reads在基因組中的位置計(jì)算SLAF標(biāo)簽的實(shí)際長(zhǎng)度，繪制Control reads插入片段的長(zhǎng)度分布圖，并估測(cè)實(shí)際片段選擇范圍（電子附表3），與預(yù)期待相符。通過(guò)對(duì)玉米NGS數(shù)據(jù)和Control數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，所獲得的玉米NGS數(shù)據(jù)符合要求，可以進(jìn)一步進(jìn)行SLAF標(biāo)記開發(fā)和基于SLAF標(biāo)記的BSA分析。

2.3 SLAF標(biāo)簽的確定及其在玉米染色體上的分布

通過(guò)SOAP軟件[22]將SLAF定位到玉米（B73）的基因組（下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ assembly/GCF_000005005.1/）上，共獲得268 524個(gè)SLAF標(biāo)簽，其中父本的測(cè)序深度為22.57×，母本的測(cè)序深度為22.64×，低纖維素混池（L）平均測(cè)序深度為26.86×，高纖維素混池（H）平均測(cè)序深度為31.05×（電子附表4）。不同染色體上的SLAF標(biāo)簽在染色體上均勻分布（圖1-A）。通過(guò)兩親本SLAF標(biāo)簽的對(duì)比，找到有序列差異的SLAF標(biāo)簽73 786個(gè)，即為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽?？傮w上，多態(tài)性SLAF標(biāo)簽占總SLAF標(biāo)簽數(shù)目的27.48%。SLAF標(biāo)簽及多態(tài)性SLAF標(biāo)簽的在玉米染色體上的統(tǒng)計(jì)見電子附表5。這些多態(tài)性標(biāo)簽在染色體上均勻分布（圖1-B），滿足作為開發(fā)分子標(biāo)記的條件。

2.4 SNP標(biāo)記的開發(fā)

利用多態(tài)性SLAF標(biāo)簽信息，采用GTAK對(duì)親本與子代混池進(jìn)行SNP標(biāo)記開發(fā)，一共得到SNP標(biāo)記523 395個(gè)。過(guò)濾掉低可信度的標(biāo)記后，在父本E327、母本G05-1、低纖維素混池、高纖維素混池樣本中分別得到414 466、411 851、459 632和464 746個(gè)SNP標(biāo)記。這些SNP在4個(gè)樣本中的雜合度分別位17.37%、16.62%、44.46%和40.05%（表2），雜合度的分布符合親本及BSA混池的特征。表明基于SLAF標(biāo)簽開發(fā)的SNP標(biāo)記可以用來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析。同時(shí)，所得到的SNP位點(diǎn)的變異信息（電子附表6），可以用于進(jìn)一步開發(fā)SNP分子標(biāo)記引物，用于玉米的基因定位或分子標(biāo)記輔助育種。

圖1 SLAF標(biāo)簽（A）和多態(tài)性SLAF（B）在染色體上的分布

表1 各樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

P：父本，M：母本，L和H分別代表2個(gè)混池。下同

P: paternal parent line; M: maternal parent line; L and H represent two bulks, similarly hereinafter. The same as below

表2 本研究所檢測(cè)到的SNP情況

2.5 BSA關(guān)聯(lián)分析

進(jìn)一步對(duì)2個(gè)親本和2個(gè)混池的SNP進(jìn)行分析，為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，首先過(guò)濾任一混池中read支持度小于3的位點(diǎn)265 983個(gè)，然后過(guò)濾與相應(yīng)親本的SNP類型差異的位點(diǎn)132 740個(gè)，最終得到高質(zhì)量的可信SNP 位點(diǎn)344 441個(gè)。其中，280 414位點(diǎn)在2個(gè)混池間是一致的，64 027個(gè)SNP位點(diǎn)在混間具有差異。

針對(duì)這些混池間有差異的SNP位點(diǎn)，使用ED算法[21]計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)的ED值，ED值越大表明該SNP在兩混池間的差異越大，差異SNP位點(diǎn)ED值在染色體上的分布如圖2所示。為消除背景噪音，對(duì)原始ED值利用LOESS算法進(jìn)行擬合回歸曲線操作[21]，取所有位點(diǎn)ED的第998百分位數(shù)（0.69）為閾值，關(guān)聯(lián)到6個(gè)區(qū)段，均位于第5染色體上，標(biāo)記為Region1-Region6。表3顯示Region1-Region6在玉米基因組上的位置及區(qū)段長(zhǎng)度，這6個(gè)區(qū)段一共有47個(gè)基因，Region1-Region6所對(duì)應(yīng)的基因數(shù)分別為1、1、12、5、3和25。

表3 關(guān)聯(lián)區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)表

A：玉米不同染色體上BSA分析得到的ED值；B：玉米第5染色體的ED值。紅線顯示的是ED分析的閾值

使用BLAST軟件將關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的47個(gè)基因分別與NR、SwissProt、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)（電子附表7和電子附表8）。

2.6 候選基因的分析

在這6個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)域中，Region1和Region2分別只對(duì)應(yīng)一個(gè)基因，分別為和，這兩個(gè)基因可以作為2個(gè)候選基因。其他區(qū)域分別對(duì)應(yīng)多個(gè)基因，但是在每個(gè)區(qū)域中，可能只有少數(shù)基因真正調(diào)控纖維素含量變化。因此，需要搜索相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)這些基因已經(jīng)報(bào)道的功能進(jìn)行查閱，進(jìn)一步縮小候選基因的范圍。然而，在玉米中這些基因功能的研究尚未見報(bào)道，而模式植物擬南芥的基因功能研究較其他植物更為深入，因?yàn)椴煌参镂锓N中，同源基因一般具有相同或類似的功能，通過(guò)同源比對(duì)的方法把這47個(gè)基因映射到擬南芥基因組，找到它們對(duì)應(yīng)的擬南芥基因及其注釋信息（電子附表8），并查閱擬南芥相關(guān)基因的研究工作，推測(cè)這些玉米基因的功能。如果某一玉米基因?qū)?yīng)的擬南芥同源基因直接或間接影響纖維素的代謝，那么這個(gè)玉米基因就確定為可能的候選基因。通過(guò)這種方法，最終在Region3、Region4、Region5、Region6分別各確定了2個(gè)基因作為候選基因（表4）。

3 討論

SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）技術(shù)是利用二代高通量測(cè)序發(fā)展而來(lái)的一套簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。通過(guò)特定內(nèi)切酶酶切基因組并篩選特定大小的片段建庫(kù)測(cè)序，從而選擇性地得到目標(biāo)基因組的片段序列。對(duì)不同樣本SLAF片段進(jìn)行多樣性分析可以得到多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，用于BSA關(guān)聯(lián)分析。SLAF-seq技術(shù)結(jié)合BSA關(guān)聯(lián)分析具有通量高、準(zhǔn)確性高、成本低、周期短等優(yōu)勢(shì)。另外，基于多態(tài)性SLAF標(biāo)簽上變異位點(diǎn)，可以開發(fā)出大量的SNP標(biāo)記，用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助育種[20]。目前，基于SLAF-seq的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在水稻、小麥、大豆、油菜、棉花等作物中得到應(yīng)用。在玉米中，SLAF標(biāo)記已成功用于鑒定fea*-9LB030突變體的突變基因[23]。但是，利用SLAF-seq技術(shù)開發(fā)玉米分子標(biāo)記尚未見報(bào)道。本研究利用果皮纖維素含量差異的兩親本E327、G05-1構(gòu)建RILs分離群體，并對(duì)親本和纖維素含量高、低的2個(gè)混池進(jìn)行SLAF測(cè)序，得到了73 786個(gè)在親本中存在多態(tài)性的標(biāo)簽。另外，與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，在4個(gè)樣本中分別得到了414 466、411 851、459 632和464 746個(gè)SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的信息（電子附表6）可以用于進(jìn)一步開發(fā)SNP分子標(biāo)記，用于玉米基因定位和分子輔助育種。

表4 各關(guān)聯(lián)區(qū)段的候選基因分析

結(jié)合BSA分析的方法，本研究一共得到6個(gè)與果皮纖維素含量差異性狀關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)段，在這6個(gè)區(qū)段中一共注釋到47個(gè)基因。作為模式植物擬南芥，其基因功能的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于其他植物。鑒于此，以擬南芥基因組作為參考，根據(jù)這47個(gè)基因在擬南芥中的同源基因是否直接或間接影響纖維素的代謝來(lái)確定候選基因。在關(guān)聯(lián)到的染色體區(qū)段1和區(qū)段2，雖然沒(méi)有報(bào)道表明其對(duì)應(yīng)的擬南芥基因與纖維素的代謝相關(guān)，但由于這兩個(gè)區(qū)段各只有一個(gè)基因，因此，這兩個(gè)基因（和）將作為候選基因進(jìn)行后續(xù)的功能驗(yàn)證分析；第3區(qū)段有12個(gè)基因，其中在擬南芥中的同源基因是（）。是擬南芥根毛特異表達(dá)基因[24]，其與功能冗余，在擬南芥根毛形成中能夠促進(jìn)細(xì)胞壁的合成[25]，表明可能間接的影響纖維素的合成。因此，被確定為區(qū)段3的候選基因；區(qū)段4有5個(gè)基因，分別為、、、和。其中和在擬南芥中有共同的同源基因、和，它們同屬于GDSL-like Lipase/ Acylhydrolase superfamily protein基因家族。這個(gè)基因家族在擬南芥中還沒(méi)有參與或影響纖維素含量的報(bào)道，但最近在棉花中的一項(xiàng)研究表明：棉花中的同源基因位于GhMYB1轉(zhuǎn)錄因子的下游，參與棉花中纖維的合成[26]。因此，和被確定此區(qū)段的候選基因；染色體區(qū)段5有3個(gè)基因，其中和均與擬南芥的（）同源。PRX52屬于過(guò)氧化物酶超級(jí)家族蛋白（peroxidase superfamily protein），是一個(gè)Ⅲ類過(guò)氧化物酶，在細(xì)胞壁中表達(dá)，調(diào)節(jié)次生壁的合成[27]。過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）可以在細(xì)胞中催化超氧化物（O2?-）和過(guò)氧化氫（H2O2）的產(chǎn)生，使細(xì)胞壁松弛，促進(jìn)細(xì)胞壁的合成[28]。有報(bào)道表明，的表達(dá)下調(diào)，可以抑制細(xì)胞的伸長(zhǎng)和根的生長(zhǎng)[29-30]；在擬南芥突變體中，當(dāng)植物受到鋁脅迫時(shí)，纖維素合成基因和的表達(dá)顯著下調(diào)[31]。此外，在玉米中也有研究發(fā)現(xiàn)POD的上調(diào)表達(dá)與細(xì)胞壁的合成和節(jié)間伸長(zhǎng)相關(guān)[32]?；谶@些研究，第5區(qū)段中的2個(gè)編碼玉米過(guò)氧化物酶基因和被確定為候選基因；CesA是關(guān)鍵的纖維素合成酶，桉樹中的一項(xiàng)研究表明，、和的啟動(dòng)子上含有W-box，MYC識(shí)別為點(diǎn)（MYC recognition site），EEC元件（EEC element）、CCA1-結(jié)合位點(diǎn)（CCA1-binding site）以及ARR1-結(jié)合位點(diǎn)（ARR1-binding element）。其中，W-box是WRKY轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別位點(diǎn)[33-37]，ARR1-結(jié)合原件是生長(zhǎng)素信號(hào)途徑轉(zhuǎn)錄因子ARR結(jié)合的位點(diǎn)。被子植物的樹干和樹枝在重力的刺激下會(huì)形成應(yīng)拉木（tension wood，TW)。楊樹的TW中富含纖維素，其TW和常規(guī)木（normal wood，NW）的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)兩者存在大量的差異基因。其中，屬于基因家族的（對(duì)應(yīng)擬南芥的WRKY20，基因位點(diǎn)為）在富含纖維素的TW中的表達(dá)量是NW的3.47倍，暗示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子與纖維素合成存在著相關(guān)性；在同樣一組數(shù)據(jù)中，研究者發(fā)現(xiàn)12個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的差異表達(dá)[38]，這表明，生長(zhǎng)素信號(hào)途徑也可能間接影響纖維素的合成。也有報(bào)道表明擬南芥參與調(diào)控細(xì)胞壁的形成[39-40]這些研究暗示，纖維素的合成受到WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，同時(shí)也受到生長(zhǎng)素信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)。本研究利用BSA分析關(guān)聯(lián)到的染色體區(qū)段6中一共有25個(gè)基因，其中，編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥的是同源基因；在擬南芥中的同源基因是，編碼一個(gè)類SUAR生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白（SAUR-like auxin-responsive protein）?；谶@些研究，將這兩個(gè)基因確定為候選基因（表4）。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)玉米果皮纖維素含量差異的親本和RILs群體混池進(jìn)行SLAF測(cè)序，共獲得73 786個(gè)SLAF多態(tài)性標(biāo)簽，并檢測(cè)到523 395個(gè)SNP位點(diǎn)。獲得6個(gè)控制玉米果皮纖維素含量的染色體區(qū)段，共確定9個(gè)候選基因。表明SLAF測(cè)序結(jié)合BSA分析的方法可以用于快速基因定位的分析。

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附表1 RILs群體纖維素含量及混池信息

Supplemental table 1 The cellulose content of RILs and the bulk information

附表2 電子酶切信息統(tǒng)計(jì)

Supplemental table 2 The statistical information of electrical enzyme digestion

附表3 SLAF 標(biāo)簽在各染色體上的數(shù)量統(tǒng)計(jì)

Supplemental table 3 SLAF number on different chromosome

附表4 SLAF 標(biāo)簽統(tǒng)計(jì)

Supplemental table 4 The statistical information of SLAF tags

附表5 SLAF標(biāo)簽和多態(tài)性SLAF標(biāo)簽染色體分布統(tǒng)計(jì)

Supplemental table 5 The statistic of SLAF tags and polymorphic SLAF tags on different chromosomes

附表6 親本和高、低纖維素混中的多態(tài)性SNP

Supplemental Table 6 The SNPs in parent lines and high/low cellulose content bulks

附表7 關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)基因注釋統(tǒng)計(jì)表

Supplemental table 7 The statistic of annotated genes in associated regions

附表8 關(guān)聯(lián)區(qū)域基因的注釋

Supplemental table 8 Annotation of associated gene in associated regions

附表9 關(guān)聯(lián)區(qū)域玉米基因?qū)?yīng)的擬南芥基因的注釋

Supplemental table 9 Annotation of Arabidopsis homological genes of Maize genes in associated regions

請(qǐng)根據(jù)該文DOI：10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.001 或掃描右側(cè)二維碼，從相應(yīng)網(wǎng)頁(yè)“附件”處下載查閱以上信息（手機(jī)或不兼容）。

SLAF-marker Development and Its Application in BSA Analysis of Cellulose Content in Pericarp of Maize Kernel

Du Longgang, Wang Meixing

(Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021)

【Objective】Reducing cellulose content in pericarp is one of the important goals for quality improvement of sweet maize. However, the research focusing on cellulose content in pericarp of maize is limited and the related gene has not been identified. In order to map the chromosome regions and candidate genes controlling cellulose content in pericarp of sweet maize, specific-locus amplified fragment-sequencing (SLAF-seq) and bulked segregant analysis (BSA) were conducted in this study. 【Method】A recombinant inbred line (RIL) population was constructed using E327 and G5-1 as parents. In F6generation of RILs, the cellulose contents in pericarp of each line were detected. According to cellulose content results, the lines with relatively high and low cellulose contents in pericarp were selected for SLAF tags identification and BSA. For BSA, DNA was extracted from two bulked populations as well as two parent lines and digested withⅢand166Ⅱrestriction enzymes. After digestion, the 414-464 bp DNA fragments were recovered and used for Illumina library construction which were subsequently sequenced by 2nd generation sequencing technology. Based on the polymorphic SLAF tags developed in this analysis, the SNPs-cellulose content association analysis was performed to map the chromosome regions associated with cellulose content in pericarp of sweet maize. Then, the genes located on the associated regions were found. To further reduce the number of candidate genes, the genes inhomological to these genes were identified and annotated. Based on the published works related on the functional analysis of thesegenes, we further identified the candidate genes regulating cellulose content in pericarp of sweet maize. 【Result】The sequencing results of Illumina libraries were consistent with expected. As a result, 73 786 polymorphic SLAF tags were identified, which were uniformly distributed on 10 chromosomes. A total of 523 395 SNPs in those polymorphic tags were identified from the SLAF-sequencing data. Genes responsible for cellulose content in pericarp were mapped onto 6 chromosome regions of maize genome via association analysis and all these 6 chromosome regions were located on the 5th chromosome. In total, 47 gene loci in those regions and 9 genes in these associated regions were identified as candidate genes in further analysis. 【Conclusion】Through SLAF-sequencing based bulking segregated analysis, the cellulose content related genes in pericarp of sweet maize were mapped, suggesting that this method can be applied in gene mapping for other traits.

maize; pericarp; cellulose; specific-locus amplified fragment-sequencing; bulked segregant analysis

（責(zé)任編輯 李莉）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.001

2017-12-06；

2018-01-04

浙江省農(nóng)業(yè)（糧食）新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02050-9-2）

杜龍崗，E-mail：51968582@qq.com。

王美興，E-mail：wangmeixing1975@126.com