基于名優(yōu)谷子品種晉谷21全基因組重測序的分子標記開發(fā)

趙慶英 張瑞娟 王瑞良 高建華,3 韓淵懷 楊致榮1,,* 王興春,,*

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基于名優(yōu)谷子品種晉谷21全基因組重測序的分子標記開發(fā)

趙慶英1,**張瑞娟2,**王瑞良2高建華2,3韓淵懷3,4楊致榮1,3,4,*王興春2,3,4,*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院, 山西太谷 030801;2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801;3山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所, 山西太谷 030801;4雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室, 山西太谷 030801

小米因其營養(yǎng)豐富日益受到重視, 而小米的品質(zhì)是民眾選擇小米時最為關(guān)注的指標。晉谷21米質(zhì)優(yōu)異, 但由于缺少基因組信息, 嚴重阻礙了其優(yōu)異米質(zhì)形成機制的研究。本研究利用高通量測序技術(shù), 對晉谷21全基因組進行重測序, 獲得了14.95 Gb高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。進一步將其與豫谷1號參考基因組比較, 發(fā)掘了169 037個InDel位點和1 167 555個SNP位點, 其中長度在13~50 bp之間適于瓊脂糖凝膠電泳檢測的InDel位點為14 578個。選擇其中1個SNP位點和68個InDel位點驗證, 表明利用二代測序技術(shù)開發(fā)的InDel和SNP標記真實可靠?；诿麅?yōu)谷子晉谷21重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的InDel和SNP分子標記具有通用性, 可用于其他谷子、狗尾草和谷莠子等種質(zhì)資源的相關(guān)研究。同時, 開發(fā)了一個晉谷21特異的InDel標記2G5501976, 利用該標記即可快速鑒定待測材料是否為晉谷21及其衍生品種。本研究初步揭示了晉谷21的基因組特征, 不僅為深入解析其優(yōu)異米質(zhì)形成的分子機制奠定了基礎(chǔ), 而且為相關(guān)分子標記輔助育種、遺傳分析和基因克隆提供了分子標記資源。

谷子; 晉谷21; InDel; SNP; 分子標記; 基因組重測序

谷子(L.)起源于中國, 是我國過去幾千年來的主栽作物和中華民族的哺育作物。脫殼后的谷子稱為小米, 富含蛋白質(zhì)、脂肪、鐵、類胡蘿卜素、纖維素、維生素等[1-3]。近年來, 隨著人們生活水平的不斷提高及食品的多樣化和營養(yǎng)化, 優(yōu)質(zhì)小米倍受青睞。然而, 長期以來谷子品質(zhì)相關(guān)的研究進展緩慢, 且主要集中在外觀品質(zhì)和簡單的營養(yǎng)成分分析方面。中國作物信息網(wǎng)(http://www. cgris.net/)登記在冊的谷子種質(zhì)資源中呈現(xiàn)出16種不同的米色, 其中黃色米占77%。小米中的黃色物質(zhì)主要是類胡蘿卜素, 其含量與外觀品質(zhì)顯著相關(guān), 是小米品質(zhì)育種的重要指標。黃米中類胡蘿卜素的含量與綠米相當, 但顯著高于白色品種[4]。王潤奇等[5]利用三體分析法將白米和青米基因分別定位于第4和第6染色體, 為米色基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。最近, 我們發(fā)現(xiàn)谷子番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene beta cyclase, LCYB)可能通過影響β-胡蘿卜素和總類胡蘿卜素在籽粒中的積累, 進而影響小米的米色[6]。蒸煮品質(zhì)和食用品質(zhì)是小米品質(zhì)構(gòu)成的最重要方面, 主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量及比例決定。直鏈淀粉含量較低的小米米飯柔軟且口感好, 相反, 直鏈淀粉含量較高的小米蒸煮后米飯干燥、蓬松、色暗, 有回生現(xiàn)象[7]。遺憾的是, 目前有關(guān)淀粉合成和調(diào)控機制的認識主要來自擬南芥和水稻等模式植物, 谷子相關(guān)研究較少[8-9]。

隨著高通量測序的簡單化和低成本化, 利用二代測序技術(shù)大規(guī)模開發(fā)谷子分子標記并解析小米品質(zhì)等復(fù)雜農(nóng)藝性狀成為可能。2012年, 由美國國家能源部所屬的聯(lián)合基因組研究所和中國華大基因分別進行的豫谷1號和張谷的全基因組測序工作相繼完成[10-11], 從此谷子功能基因組學(xué)研究進入了一個新的時代。此后, 一大批基于全基因組測序的分子標記相繼被開發(fā)[12-16]。Bai等[16]對十里香谷子品種進行了基因組重測序, 通過比對發(fā)現(xiàn)十里香和豫谷1號基因組之間存在762 082個SNP, 26 802個1~5 bp InDels和10 109個結(jié)構(gòu)變異; 而十里香和張谷基因組之間存在915 434個SNP、28 546個InDels和12 968個結(jié)構(gòu)變異。最近, 王軍等[17]利用簡化基因組測序技術(shù)構(gòu)建了一張1648.8 cM的谷子高密度遺傳圖譜, 并定位了8個農(nóng)藝性狀的11個主效QTL。我國谷子種質(zhì)資源非常豐富, 在長期的自然進化和人工選擇中積累了大量自然變異。2013年, 我國科學(xué)家聯(lián)合完成了916份谷子種質(zhì)資源全基因組低倍重測序和單倍體型圖譜的構(gòu)建工作, 為谷子基因資源的發(fā)掘和遺傳改良提供了海量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息[18]。

晉谷21原名晉汾7號, 由晉汾52經(jīng)鈷60 γ射線輻射和連續(xù)單株選育而成[19]。其米色金黃發(fā)亮, 細柔光滑, 品質(zhì)和產(chǎn)量均超過歷史名米沁州黃[19]。晉谷21于1992年榮獲中國首屆農(nóng)業(yè)博覽會銀獎, 1994年獲山西省科技進步一等獎, 1995年被國家科委列入國家成果重點推廣項目。本實驗室曾對晉谷21進行了轉(zhuǎn)錄組測序, 鑒定出614個新基因, 并優(yōu)化了7175個已注釋基因的結(jié)構(gòu), 為晉谷21優(yōu)異米質(zhì)基因的發(fā)掘奠定了基礎(chǔ)[20]。盡管如此, 由于缺少晉谷21的基因組信息, 限制了晉谷21優(yōu)異米質(zhì)連鎖分子標記的開發(fā)和相關(guān)基因的克隆。為此, 本研究利用Illumina HiSeq 2000高通量測序技術(shù)對晉谷21進行了全基因組重測序, 并將其與豫谷1號參考基因組比較, 開發(fā)了大量InDel和SNP分子標記, 并將其應(yīng)用于晉谷21衍生種的分析。本研究不僅為晉谷21優(yōu)異米質(zhì)相關(guān)基因的發(fā)掘和分子育種奠定了基礎(chǔ), 同時也為其他谷子品種的相關(guān)研究提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)條件

全基因組重測序材料為大田種植的健康無病蟲害的晉谷21單株植株, 選取15份谷子種質(zhì)資源(表1)進行引物通用性分析。編號7~15的種質(zhì)資源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的刁現(xiàn)民研究員饋贈, 其余資源為本實驗室保存或創(chuàng)制。所有材料均種植于山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田內(nèi)。

1.2 基因組DNA的提取、文庫構(gòu)建和高通量測序

采用改良的CTAB法[21]提取用于PCR模板的谷子基因組DNA: 取0.1 g新鮮谷子葉片, 加入0.6 mL CTAB提取液, 利用高通量組織研磨機(寧波新芝SCIENTZ-48)充分破碎; 然后加入500 μL氯仿/異戊醇(24∶1, v/v)進行抽提; 最后取上清液加入等體積的異丙醇以沉淀DNA。重測序用晉谷21基因組的提取采用高效植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司, 貨號DP350], 提取操作嚴格按照試劑盒提供的方法進行。利用配備μCuvette G1.0超微量比色皿的BioSpectrometer分光光度計(PCR用)或者Qubit熒光定量儀(重測序用)測定基因組DNA的濃度和純度, 并用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

表1 15份谷子種質(zhì)資源信息

由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司嚴格按照Illumina提供的標準方法進行文庫的構(gòu)建和高通量測序: 將5 μg基因組DNA隨機打斷, 進行片段化; 電泳回收所需長度的DNA片段, 進行末端修復(fù)并加上接頭制備雙端測序文庫, 利用Illumina HiSeq 2000測序平臺進行高通量測序。

1.3 晉谷21重測序數(shù)據(jù)分析及InDel和SNP檢測

利用Illunima Casava軟件對晉谷21經(jīng)Illumina HiSeq 2000測序平臺測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)進行堿基識別, 將其轉(zhuǎn)化為原始測序讀段(raw reads)。為了保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量, 首先將原始測序數(shù)據(jù)進行過濾, 去除帶接頭、N所占比例大于5%或質(zhì)量值≤5的堿基超過50%的低質(zhì)量測序序列, 從而得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。

利用BWA軟件[22]將晉谷21重測序數(shù)據(jù)比對到豫谷1號參考基因組[10], 以定位干凈讀段(clean reads)在參考基因組上的位置, 統(tǒng)計晉谷21基因組測序深度和基因組覆蓋度等信息, 并進行InDel和SNP變異的檢測。InDel和SNP的檢測利用基因組分析工具包(Genome Analysis Toolkit, GATK) GATK[23]進行, 具體流程為: (1)使用Picard軟件包(https://sourceforge.net/projects/picard/)的Mark Duplicate工具去除重復(fù)序列, 以消除PCR復(fù)制的影響; (2)使用基因組分析工具包(Genome Analysis Toolkit, GATK)[23]對SNP和InDel附近位點進行局部重新比對, 校正由于堿基變異產(chǎn)生的比對結(jié)果錯誤; (3)校正堿基質(zhì)量值; (4)檢測InDel和SNP變異位點。

1.4 基于重測序數(shù)據(jù)的InDel和CAPS分子標記的開發(fā)和引物設(shè)計

選取晉谷21和豫谷1號差異堿基數(shù)在13~50 bp的InDel位點設(shè)計InDel引物, 引物設(shè)計原則為擴增片段長度為100~250 bp, 且晉谷21和豫谷1號之間的差異在8%以上?；跁x谷21重測序獲得的SNP位點信息, 利用在線軟件dCAPS Finder 2.0[24]分析最佳酶切位點和選擇限制性內(nèi)切核酸酶, 并設(shè)計酶切擴增多態(tài)性(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)標記引物, 引物設(shè)計原則為PCR擴增片段長度500~1000 bp。

1.5 PCR 擴增及標記驗證

PCR體系為20 μL, 包括基因組DNA約50 ng、10× PCR 緩沖液 2 μL, 2 mmol L–1dNTPs 2 μL, 10 μmol L–1上下游引物各2 μL和1 UDNA聚合酶。用2.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR或者酶切產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 晉谷21基因組重測序及測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Illumina paired-end雙端測序, 共獲得15.45 Gb的晉谷21基因組原始數(shù)據(jù)(raw data)。經(jīng)質(zhì)量評估和過濾, 最終獲得83.05 Mb clean reads, 共計14.95 Gb的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù), 測序深度達到36.9×(表2)。其中, 質(zhì)量值大于等于30的堿基達到92.96%, 表明測序質(zhì)量較好(表2和圖1-A)。為保證結(jié)果的可靠性, 所有后續(xù)分析都基于上述過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

晉谷21基因組重測序數(shù)據(jù)與豫谷1號參考基因組平均比對效率為96.16%, 其中雙端測序序列均定位到參考基因組上, 且距離符合測序片段長度分布的占93.25%, 基因組覆蓋度為95.34% (至少覆蓋1×) (表2和圖1-B)。為了分析插入片段的實際大小, 檢測了雙端序列在參考基因組上的起止位置。結(jié)果表明插入片段長度分布呈正態(tài)分布, 且只有一個單峰, 峰值長度約為480 bp, 這表明測序數(shù)據(jù)文庫構(gòu)建符合要求(圖1-C)。

表2 晉谷21全基因組測序數(shù)據(jù)信息匯總

圖1 晉谷21基因組測序質(zhì)量評估

A: 堿基質(zhì)量分布圖; B: 測序深度分布曲線; C: 測序文庫插入片段大小分布圖。

A: base quality distribution; B: sequencing-depth distribution curve; C: insert size distribution of the sequencing library.

2.2 基于晉谷21重測序數(shù)據(jù)的InDel分子標記開發(fā)

根據(jù)樣品晉谷21的測序讀段在豫谷1號參考基因組上的定位結(jié)果, 利用GATK軟件包檢測晉谷21與豫谷1號之間是否存在InDel。共發(fā)現(xiàn)169 037個InDel位點, 平均密度為417.37個 Mb–1, 這些InDel共導(dǎo)致了1752個基因發(fā)生變異。其中, 14 578個InDel位點差異片段長度在13~50 bp之間; 34 733個InDel位點差異片段長度在4~12 bp之間; 117 406個InDel位點差異片段長度在1~3 bp之間(圖2)。

圖2 晉谷21和豫谷1號基因組間的InDel統(tǒng)計

正負數(shù)分別表示晉谷21基因組中插入(正數(shù))或者缺失(負數(shù))的堿基數(shù)。

The positive and negative numbers indicate the number of insertion (positive) or deletion (negtive) of base in the Jingu 21 genome.

為了進一步驗證候選InDel標記的準確性, 根據(jù)其在染色體上的分布情況, 篩選并設(shè)計了68對代表性InDel標記引物(附表1)。其中, 8對位于第1染色體, 8對位于第2染色體, 11對位于第3染色體, 8對位于第4染色體, 7對位于第5染色體, 6對位于第6染色體, 6對位于第7染色體, 6對位于第8染色體, 8對位于第9染色體(圖3和附表1)。為了檢測開發(fā)的InDel標記的準確性和上述引物的有效性, 以豫谷1號和晉谷21基因組為模板, 進行了PCR擴增和電泳檢測。結(jié)果表明, 上述68對引物均能擴增出特異條帶。進一步分析表明, 61對引物在豫谷1號和晉谷21之間具有多態(tài)性, 且擴增片段大小符合預(yù)期結(jié)果; 7對引物無多態(tài)性或者大小與預(yù)期不符(圖3和附表1)。

2.3 基于晉谷21重測序數(shù)據(jù)的SNP/CAPS分子標記開發(fā)與檢測

使用GATK軟件工具包對晉谷21基因組DNA進行SNP檢測, 共獲得1 167 555個SNP, 平均密度為2912.33個 Mb–1。其中, 同類型堿基之間突變的轉(zhuǎn)換型SNP位點851 065個, 不同類型堿基之間的顛換型SNP位點 316 490個; 純合的SNP位點為1 146 969個, 雜合的SNP位點為20 586個, 純合率為98.24%。利用SnpEff軟件[25]對上述SNP進行了注釋, 發(fā)生在非編碼區(qū)的突變?yōu)? 117 744個, 發(fā)生在編碼區(qū)的突變?yōu)?9 811個, 這些SNP共導(dǎo)致7098個基因發(fā)生非同義突變(表3)。

圖3 InDel標記在晉谷21和豫谷1號的多態(tài)性分析

InDel標記詳細信息見附表1, 每個分子標記的第1個樣品為晉谷21, 第2個樣品為豫谷1號。M: D2000 DNA Marker [天根生化科技(北京)有限公司, #MD114]。1~11代表該標記在附表1中的順序。

The detailed information of the InDel markers are listed in the supplemental table 1. The first and the second lanes of each marker are Jingu 21 and Yugu 1 respectively. M: D2000 DNA Marker [Tiangen Biotech (Beijing) Co. Ltd., #MD114]. 1~11 represent the order of the markers in supplemental Table 1.

為了驗證上述SNP位點的準確性, 我們選取了第3染色體位點14 938 250的SNP進行了驗證。在該SNP位點參考基因組序列為C, 而晉谷21為堿基T, 從而導(dǎo)致晉谷21產(chǎn)生了一個新的I酶切位點。據(jù)此, 設(shè)計CAPS標記引物(5′-TTGAGATTTTGC TGGCGATTGG-3′和5′-CGGCATACTTTTGTCACC CTAC-3′), 并利用晉谷21和豫谷1號基因組DNA進行了PCR驗證。如圖4所示, 晉谷21和豫谷1號都可以擴增出清晰條帶, 且二者條帶大小相同。利用I酶切后, 晉谷21片段可以切割成424 bp和538 bp兩個片段, 而豫谷1號片段不能被切割(圖4)。上述結(jié)果與預(yù)期相符, 表明基于晉谷21重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的該SNP位點是正確的。

2.4 基于晉谷21重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的分子標記的通用性

選取了1份狗尾草、2份谷莠子和12份谷子, 共計15份種質(zhì)資源驗證基于晉谷21重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的InDel和SNP/CAPS分子標記的通用性。結(jié)果表明, 9對InDel引物都可以在15個谷子種質(zhì)資源中進行有效的擴增(表1)。其中標記2G5501976僅在晉谷21背景的種質(zhì)資源和其他13個種質(zhì)資源之間有多態(tài)性, 而在其他13個種質(zhì)資源之間無多態(tài)性; 其余8個InDel標記在所有種質(zhì)資源中多態(tài)性都較好(圖5-A)。類似地, 基于SNP重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的CAPS標記3G14938250也可以在其他谷子種質(zhì)資源中有效擴增, 且利用I酶切后表現(xiàn)出較好的多態(tài)性(圖5-B)。這表明基于晉谷21全基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的InDel和SNP/CAPS分子標記在包括狗尾草和谷莠子在內(nèi)的其他谷子種質(zhì)資源中具有通用性, 可用于其他谷子種質(zhì)資源的相關(guān)研究。

表3 SNP注釋結(jié)果

圖4 CAPS標記3G14938250對晉谷21和豫谷1號的多態(tài)性分析

1: 晉谷21 PCR 擴增產(chǎn)物; 2: 豫谷1號 PCR 擴增產(chǎn)物; 3: 晉谷21 PCR產(chǎn)物的I酶切結(jié)果; 4: 豫谷1號PCR 產(chǎn)物I的酶切結(jié)果; M: D2000 DNA marker [天根生化科技(北京)有限公司, #MD114]。

1: PCR amplicon of Jingu 21; 2: PCR amplicon of Yugu 1; 3: PCR amplicon of Jingu 21 digested withI; 4: PCR amplicon of Yugu 1 digested withI; M: D2000 DNA marker [Tiangen Biotech (Beijing) Co. Ltd., #MD114].

圖5 InDel和CAPS標記在15個谷子種質(zhì)資源的多態(tài)性分析

A: InDel標記在15個谷子種質(zhì)資源的多態(tài)性分析; B: CAPS標記在15個谷子種質(zhì)資源的多態(tài)性分析。1~15為谷子種質(zhì)資源, 詳細信息見表1。

A: Polymorphic analysis of InDel markers among 15 foxtail millet germplasm resources; B: Polymorphic analysis of CAPS marker among 15 foxtail millet germplasm resources. The foxtail millet germplasm (1–15) is listed in Table 1.

3 討論

3.1 基于二代重測序技術(shù)開發(fā)晉谷21全基因組分子標記

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及豫谷1號和張谷等谷子基因組測序的完成, 利用二代重測序技術(shù)在全基因組水平開發(fā)分子標記已經(jīng)成為可能。Jia等[18]對包括晉谷21在內(nèi)的916份谷子種質(zhì)資源進行了重測序, 但測序深度較低, 平均僅為0.7×, 導(dǎo)致晉谷21的SNP數(shù)據(jù)不全, 且無法開發(fā)InDel標記。本研究利用Illumina HiSeq 2000高通量測序平臺對名優(yōu)谷子品種晉谷21進行了36.9×深度測序, 并開發(fā)了169 037個InDel標記和1 167 555個SNP標記, 對晉谷21優(yōu)異米質(zhì)形成分子機制的解析具有重要價值。

與SSR標記一樣, InDel標記反映的也是DNA 片段長度的多態(tài)性。由于受到測序深度和算法等的限制, 過去往往僅能檢測到較小的InDel, 一般小于10 bp[26]。如Bai等[16]利用高通量測序技術(shù)開發(fā)的谷子InDel標記長度為1~5 bp, 檢測這些小的InDel非常困難。為了解決這一問題, 本研究采用了36.9×深度測序, 檢測的InDel的長度在1~269 bp之間。其中, 差異片段長度在13~50 bp之間的InDel位點為14 578個, 約占InDel標記總數(shù)的8.62% (圖2)。這些InDel標記只需要普通瓊脂糖凝膠電泳即可檢測, 與需要聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的SSR標記相比, 可以大大節(jié)省人力和物力。

3.2 基于晉谷21重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的分子標記的準確性和通用性

設(shè)計的68對InDel引物中有61對其擴增片段與預(yù)期大小相同, 且呈現(xiàn)出較好的多態(tài)性; 而另外7對擴增結(jié)果與預(yù)期不符, 占所有引物的10.29% (圖3)。分別對1G19650142和3G34758465兩個標記的豫谷1號和晉谷21擴增片段的測序表明, InDel標記1G19650142 PCR擴增產(chǎn)物為第9染色體23 837 024~ 23 837 239之間216 bp的片段; 而3G34758465 PCR擴增產(chǎn)物為第6染色體10 398 380~10 398 547之間168 bp的片段(王興春等, 未發(fā)表數(shù)據(jù))。這表明擴增片段大小與預(yù)期不符是非特異擴增而不是高通量測序或者生物信息學(xué)分析錯誤導(dǎo)致的。因此, 建議在設(shè)計InDel標記引物時將候選引物序列與豫谷1號參考基因組比對, 選擇單一結(jié)合位點的引物。

分子標記的通用性可以大大節(jié)約開發(fā)成本, 提高分子標記利用效率。但以往研究多集中在SSR標記的通用性方面, 而有關(guān)InDel和SNP等標記通用性的研究較少[27-28]。本研究表明, 基于晉谷21開發(fā)的InDel和SNP/CAPS標記也具有較好的通用性, 可用于其他谷子及其近緣野生種狗尾草和谷莠子的相關(guān)研究(圖5), 但這些標記是否可用于其他禾谷類作物還有待進一步研究。此外, InDel分子標記2G5501976多態(tài)性較差, 在除晉谷21背景之外的13個種質(zhì)資源之間無多態(tài)性。因此, 該InDel標記可以作為晉谷21特異標記, 僅用該標記即可高效區(qū)分是否為晉谷21及其衍生品種。

3.3 基于晉谷21重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的分子標記在小米品質(zhì)研究和育種中的應(yīng)用

小米的品質(zhì)是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀, 受眾多基因調(diào)控。傳統(tǒng)方法開發(fā)的分子標記數(shù)量有限, 難以對品質(zhì)等復(fù)雜農(nóng)藝性狀相關(guān)基因進行精細定位。本研究開發(fā)了169 037個InDel位點和1 167 555個SNP位點, 平均密度分別為28.58個 Mb–1和2289.32個 Mb–1, 完全可以滿足小米品質(zhì)等復(fù)雜農(nóng)藝性狀基因精細定位的需求。InDel標記2G5501976是晉谷21及其衍生品種的特異分子標記, 是這些品種中基因啟動子缺失14 bp導(dǎo)致的?；蚓幋a一個真核生物翻譯起始因子, 該基因與晉谷21優(yōu)異米質(zhì)的關(guān)系還有待進一步研究。此外, 目前水稻中已經(jīng)克隆了一大批外觀品質(zhì)、營養(yǎng)成分和香味等品質(zhì)相關(guān)的基因[8]。通過序列比對, 篩選谷子中的同源基因, 結(jié)合本研究鑒定的InDel和SNP位點, 進一步研究上述品質(zhì)相關(guān)基因在晉谷21中的變異情況, 從而有望揭示晉谷21優(yōu)異米質(zhì)形成的分子機制。

4 結(jié)論

檢測到169 037個InDel位點和1 167 555個SNP位點, 初步揭示了晉谷21的基因組信息。開發(fā)了InDel和CAPS分子標記, 為深入解析晉谷21優(yōu)異米質(zhì)形成的分子機制和分子標記輔助育種奠定了基礎(chǔ)?；跁x谷21重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的InDel和SNP標記在狗尾草、谷莠子和谷子等谷子種質(zhì)資源具有通用性, 可用于谷子種質(zhì)資源鑒定、遺傳分析、基因圖位克隆和雜交種鑒定。

致謝:感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的刁現(xiàn)民研究員提供了谷子種質(zhì)資源(表1編號7~15)。

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Genome-wide Identification of Molecular Markers Based on Genomic Re-sequencing of Foxtail Millet Elite Cultivar Jingu 21

ZHAO Qing-Ying1,**, ZHANG Rui-Juan2,**, WANG Rui-Liang2, GAO Jian-Hua2,3, HAN Yuan-Huai3,4, YANG Zhi-Rong1,3,4,*, and WANG Xing-Chun2,3,4,*

1College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;3Institute of Agricultural Bioengineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;4Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taigu 030801, Shanxi, China

Foxtail millet becomes more and more popular for its rich nutrients, and the grain quality is the key concern that consumers would consider when selecting millet brand. Jingu 21 is an elite cultivar with high edible quality. However, the lack of genomic information impedes studies on the molecular mechanisms of millet quality formation. Here, we re-sequenced the whole genome of Jingu 21 using high-throughput sequencing technology, and obtained 14.95 Gb high quality data. By comparing sequence of Jingu 21 with the reference genome of Yugu 1, we identified 169 037 InDels and 1 167 555 SNPs. Of these InDels, 14 578 could be detected easily by agarose gel electrophoresis. One SNP and 68 InDel markers were selected to verify the polymorphism between Jingu 21 and Yugu 1, showing that the InDel and SNP markers developed by using next generation sequencing technology were reliable. Although the InDel and SNP markers were generated based on genome re-sequencing data of the elite cultivar Jingu 21, they could also be used for research on other foxtail millet, green foxtail, and giant foxtail. Moreover, a specific InDel marker 2G5501976 for Jingu 21 was developed, which could be used to identify Jingu 21 and its derivative varieties. Taken all together, the genomic characterization of Jingu 21 not only lays a foundation for elucidating the molecular mechanisms of high quality formation, but also provides a large number of molecular markers for marker-assisted selection of high qua-lity millet, genetic analysis and map-based cloning.

foxtail millet; Jingu 21; InDel; SNP; molecular marker; genome re-sequencing

2017-09-11;

2018-01-08;

2018-01-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.00686

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31471502, 31600289, 31371693, 31771810), 山西省自然科學(xué)基金項目(201601D011071), 山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2015-067)和山西省留學(xué)回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目(2014-11)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31471502, 31600289, 31371693, 31771810), the Natural Science Foundation of Shanxi Province (201601D011071), the Research Project from Shanxi Scholarship Council of China (2015-067) and the Fund Program for the Scientific Activities of Selected Returned Overseas Professionals in Shanxi Province (2014-11).

楊致榮, E-mail: zryangsx@163.com; 王興春, E-mail: wxingchun@163.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

E-mail: 192015271@qq.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180128.2016.008.html