IL-1β引起食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗研究

周 劍， 劉 濤， 鄭樹濤， 劉 清， 陳玉梅， 馬 蓉， 譚豆豆， 盧曉梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院， 2臨床醫(yī)學(xué)研究院， 烏魯木齊 830011)

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，致死率在我國惡性腫瘤中居第4位，我國食管癌約90%為食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)[1]。ESCC常發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不佳，5 a生存率不足20%[2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指腫瘤細(xì)胞由原來的上皮樣形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣形態(tài)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT可增強腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，EMT在腫瘤進展過程中起著重要作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β參與腫瘤細(xì)胞EMT過程，促進腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。本研究用IL-1β處理ESCC細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化及EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達情況。

1 材料與方法

1.1材料食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞購自武漢大學(xué)細(xì)胞庫，KYSE-150細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈送。IL-1β (北京神州義翹科技有限公司)。TRIzol試劑(Thermo Fisher)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR II熒光試劑盒(Takara)，E-鈣黏蛋白(E-cadherin, 1∶1 000)、波形蛋白(Vimentin, 1∶1 000)、Slug(1∶1 000)均購自CST公司。胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)，DMSO(Invitrogen)。

1.2IL-1β處理細(xì)胞食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞和KYSE-150細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入IL-1β(100 ng/mL)培養(yǎng)48 h，作為IL-1β處理組。加PBS作為陰性對照組(每組設(shè)3個重復(fù)，每組實驗重復(fù)3次)。

1.3實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(qRT-PCR) 收集Eca109細(xì)胞和KYSE-150細(xì)胞，PBS清洗后加入TRIzol試劑提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBRⅡ熒光試劑盒對反轉(zhuǎn)錄的cDNA做RT-PCR，按說明設(shè)置反應(yīng)條件，GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果用Log10(2-△△Ct)法進行相對定量比較(每組設(shè)3個重復(fù)，每組實驗重復(fù)3次)，每組實驗重復(fù)3次，反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR所用引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 所用引物列表

1.4Westernblot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物表達收集食管癌細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白上樣量為50 μg/孔，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，熒光二抗孵育2 h，LI-COR系統(tǒng)(Odyssey)掃膜并分析(每組實驗重復(fù)3次)。

2 結(jié)果

2.1IL-1β處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Eca109和KYSE-150經(jīng)IL-1β(100 ng/mL)刺激48 h后，細(xì)胞形態(tài)由卵圓形變?yōu)樗笮?，?xì)胞極性喪失，細(xì)胞間連接變松散(圖1)。

2.2IL-1β處理后EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA的表達用qRT-PCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β處理后Eca109和KYSE150 E-cadherin表達降低，而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和Slug表達增強，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01, 圖2)。

2.3Westernblot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示，IL-1β處理后Eca109和KYSE-150 E-cadherin表達下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和Slug表達上調(diào)(圖3)。

3 討論

IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子，在多種腫瘤中IL-1β表達明顯增加[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可通過招募中性粒細(xì)胞從而提高腫瘤患者的無復(fù)發(fā)生存率[7]。但多數(shù)研究表明，IL-1β與腫瘤的進展有關(guān)[8-9]。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1β可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[10]。胰腺癌的研究中則發(fā)現(xiàn)，IL-1β與NF-κB信號通路的激活及化療的抗性有關(guān)[11]。本研究在ESCC培養(yǎng)基中加入IL-1β刺激48 h后，觀察到ESCC細(xì)胞由典型的上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣形態(tài)，細(xì)胞由圓形、卵圓形，變成梭形，細(xì)胞間連接變疏松，表明IL-1β刺激后食管癌細(xì)胞有可能發(fā)生EMT。隨后，通過qRT-PCR及Western blot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA和蛋白的表達水平，結(jié)果顯示E-cadherin表達減少，而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和Slug表達增加，這與EMT過程中細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞骨架重排有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)Slug信號表達上調(diào)與軟骨肉瘤和卵巢癌的EMT過程有關(guān)[12-13]，本研究結(jié)果與文獻報道一致，表明IL-1β可引起食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

研究表明，腫瘤微環(huán)境中IL-1β可促進癌基因的表達，并釋放抗凋亡信號，影響腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖，進而促進腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移[14-16]。本研究結(jié)果表明，食管癌微環(huán)境中的炎性細(xì)胞因子IL-1β可引起食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT，但IL-1β引起食管癌發(fā)生EMT的機制及IL-1β與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系還有待于進一步研究。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多因素參與的復(fù)雜的過程，EMT在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色。本研究僅從mRNA和蛋白水平驗證食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT，但EMT與腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系還有待于組織水平和動物模型實驗的進一步驗證。

參考文獻：

[1] CHEN W, ZHENG R, ZUO T ,et al. National cancer incidence and mortality in China, 2012[J]. Chin J Cancer Res, 2016, 28(1):1-11.

[2] ZHANG L, MA J, HAN Y ,et al. Targeted therapy in esophageal cancer[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2016, 10(5):595-604.

[3] GONZALEZ D M, MEDICI D. Signaling mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition[J]. Sci Signal, 2014,7(344):8.

[4] LAMOUILLE S, XU J, DERYNCK R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(3):178-196.

[5] LI L, LI W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer:comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation[J]. Pharmacol Ther, 2015(150):33-46.

[6] YANG W, YU X H, WANG C, et al. Interleukin-1beta in intervertebral disk degeneration[J]. Clin Chim Acta, 2015(450):262-272.

[7] CHEN L C, WANG L J, TSANG N M, et al. Tumour inflammasome-derived IL-1beta recruits neutrophils and improves local recurrence-free survival in EBV-induced nasopharyngeal carcinoma[J]. EMBO Mol Med, 2012, 4(12):1276-1293.

[8] ZIENOLDDINY S, RYBERG D, MAGGINI V, et al. Polymorphisms of the interleukin-1 beta gene are associated with increased risk of non-small cell lung cancer[J]. Int J Cancer, 2014, 109(3):353-356.

[9] LI Y, WANG L, PAPPAN L, et al. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation[J]. Mol Cancer, 2012(11):87.

[10] JEON M, HAN J, NAM S J, et al. Elevated IL-1beta expression induces invasiveness of triple negative breast cancer cells and is suppressed by zerumbone[J]. Chem Biol Interact, 2016(258):126-133.

[11] 王棟, 劉清, 鄭樹濤, 等. TGF-β1促進食管癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生發(fā)展[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2015,38(12):1470-1475.

[12] LI G, YANG Y, XU S, et al. Slug signaling is up-regulated by CCL21/CCR7 to induce EMT in human chondrosarcoma[J]. Med Oncol, 2015, 32(2):478.

[13] YUAN H, KAJIYAMA H, ITO S, et al. HOXB13 and ALX4 induce SLUG expression for the promotion of EMT and cell invasion in ovarian cancer cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(15):13359-13370.

[14] GARLANDA C, DINARELLO C A, MANTOVANI A. The interleukin-1 family:back to the future[J]. Immunity, 2013, 39(6):1003-1018.

[15] BALLAK D B, STIENSTRA R, TACK C J, et al. IL-1 family members in the pathogenesis and treatment of metabolic disease:Focus on adipose tissue inflammation and insulin resistance[J]. Cytokine, 2015, 75(2):280-290.

[16] AFONINA I S, MULLER C, MARTIN S J, et al. Proteolytic processing of interleukin-1 family cytokines:variations on a common theme[J]. Immunity, 2015, 42(6):991-1004.