活血接骨湯聯(lián)合COX-2抑制劑對(duì)兔橈骨骨折早期愈合的影響▲

陳海濤 安玉光

(廣西南寧市邕寧區(qū)人民醫(yī)院外科，南寧市 530299)

社會(huì)多元化發(fā)展的趨勢，骨折發(fā)生率逐年增高，疼痛成為骨折患者主訴之一。如果沒有得到良好的鎮(zhèn)痛，早期的疼痛劇烈，導(dǎo)致患者恐懼，應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)術(shù)后恢復(fù)產(chǎn)生不良影響[1]。非甾體類藥物(NSAIDs)作為傳統(tǒng)的止痛藥，在緩解疼痛的同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)從而影響骨折愈合[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為理氣活血祛瘀、接骨續(xù)筋、強(qiáng)壯筋骨、固本培元是骨折愈合的主要機(jī)理，而活血接骨湯是中醫(yī)治療骨折的代表方劑，能夠增加骨折處血液的供應(yīng)，從而促進(jìn)骨折愈合。如何加速骨折愈合一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)，而中西醫(yī)藥結(jié)合加快骨折愈合也是骨科的重要研究方向?；钛庸菧虲OX-2抑制劑的聯(lián)合使用，在鎮(zhèn)痛的同時(shí)不影響骨折愈合，有利于患者康復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過檢測兔橈骨骨折經(jīng)不同藥物干預(yù)后的血液流變、TGF-β1表達(dá)情況，探討活血接骨湯結(jié)合COX-2抑制劑使用促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)理?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 選取清潔級(jí)新西蘭大白兔72只，3～5月齡，雌雄各半，體重(2.5±0.5)kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。戊巴比妥鈉(購于SIGMA，批號(hào)：57-33-0)；BMP-2(abcam，ab14933)；聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(SV0002，博士德)；酶標(biāo)儀：Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162A，武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司)；顯微鏡(MODEL CX41RF，olympus corporation)；血黏度測試儀(LG-R80，北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥物前處理 ①活血接骨湯：當(dāng)歸12 g，赤芍12 g，白芍11 g，生地黃15 g，桃仁10 g，紅花g，骨碎補(bǔ)12 g，土鱉蟲8 g，煅自然銅(先煎)10 g，續(xù)斷15 g，五加皮12 g，乳香5 g，威靈仙12 g，生薏苡仁20 g，生甘草6 g等。以上藥物經(jīng)藥物制劑室制成含生藥5 g/mL的濃縮口服液，滅菌后裝瓶冷藏備用，均由廣西邕寧區(qū)人民醫(yī)院中藥房提供。②COX-2抑制劑：依托考昔片(批號(hào)：JX20130036，默沙東制藥有限公司，60 mg/片)，以生理鹽水配制成0.5 g/L，藥液用藥前10 min配制。

1.3 動(dòng)物模型的建立 用2%的戊巴比妥鈉沿兔子耳緣靜脈按30 mg/kg劑量注射麻醉，將兔子前肢皮毛去掉，鋪巾，碘伏消毒2次，用手術(shù)刀在橈骨中段1/3處作縱向切口，鈍性分離肌肉和筋膜組織，暴露橈骨。用骨鋸在橈骨中段將3 mm橈骨切斷，造成骨質(zhì)缺損，逐層縫合筋膜和皮膚組織，消毒手術(shù)區(qū)域，術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素，8萬U/d，預(yù)防傷口感染。

1.4 動(dòng)物分組及給藥方法 將制成骨折模型的大白兔隨機(jī)分為COX-2抑制劑組、空白對(duì)照組、聯(lián)合組，每組24只，各組均于造模后第2天開始給藥。COX-2抑制劑組給予依托考昔片200 mg/kg灌胃，2次/d；空白對(duì)照組予等劑量蒸餾水灌胃，2次/d；聯(lián)合組先予依托考昔片200 mg/kg灌胃，1 h后予活血接骨湯濃縮口服液灌胃，給藥劑量為家兔對(duì)人等效劑量的2倍，2次/d灌胃。術(shù)后1、2、3、4、6周時(shí)隨機(jī)抽取各組4只家兔，采用放射免疫法測定血清骨鈣素含量，再取材進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察骨折愈合不同時(shí)間點(diǎn)外骨膜、內(nèi)骨膜和骨髓腔骨TGF-β1的表達(dá)情況。

1.5 標(biāo)本獲取及檢測方法 造模后2周時(shí)隨機(jī)選取各試驗(yàn)組兔子4只，用抗凝管收集靜脈血2 mL，用血黏度測試儀對(duì)各項(xiàng)血液流變學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測。后采用空氣栓塞法處死各組兔子，取橈骨標(biāo)本作為觀察對(duì)象，取出橈骨原骨折端，先經(jīng)4%多聚甲醛固定，再用15%EDTA進(jìn)行脫鈣處理，在以骨折為中心處取長16 mm的骨段，石蠟包埋制片，縱向切成4 um厚的切片，采用免疫組化進(jìn)行組織染色，觀察骨折部位TGF-β1的表達(dá)。

1.6 圖像分析 采用光學(xué)顯微鏡對(duì)骨折部位的外骨膜、內(nèi)骨膜、骨髓腔各取高倍鏡視野3個(gè)拍照獲取圖片，TGF-β1的表達(dá)陽性光密度測定采用Image Pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 血液流變學(xué)指標(biāo)比較 聯(lián)合組血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)均低于COX-2抑制劑組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組血液流變學(xué)指標(biāo)比較 (x±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與COX-2抑制劑組比較，#P<0.05。

2.2 骨外膜TGF-β1表達(dá)的MOD值 各時(shí)點(diǎn)上，聯(lián)合組骨外膜TGF-β1表達(dá)的MOD值均高于COX-2抑制組、空白對(duì)照組(P<0.05) 。見表2、圖1。

表2 三組不同時(shí)點(diǎn)骨外膜TGF-β1表達(dá)的MOD值比較 (x±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與COX-2抑制組比較，#P<0.05。

圖1 免疫組化檢測各組兔橈骨骨髓腔骨外膜TGF-β1表達(dá)情況(×200；A：COX-2抑制劑組；B：空白對(duì)照組；C：聯(lián)合組)

2.3 內(nèi)骨膜TGF-β1表達(dá)的MOD值 1w時(shí)，各組間內(nèi)骨膜TGF-β1表達(dá)的MOD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2w、3w、4w、6w時(shí)，聯(lián)合組內(nèi)骨膜TGF-β1表達(dá)的MOD值均高于COX-2抑制組、空白對(duì)照組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 三組不同時(shí)點(diǎn)骨內(nèi)膜TGF-β1表達(dá)的MOD值比較 (x±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與COX-2抑制組比較，#P<0.05。

圖2 免疫組化檢測各組兔橈骨骨髓腔內(nèi)骨膜TGF-β1表達(dá)(×200；A：COX-2抑制劑組；B：空白對(duì)照組；C：聯(lián)合組)

2.4 骨髓腔TGF-β1表達(dá)的MOD值 各時(shí)點(diǎn)上，聯(lián)合組骨髓腔TGF-β1表達(dá)的MOD值均高于COX-2抑制組、空白對(duì)照組(P<0.05) ；且1w時(shí)COX-2抑制組高于空白對(duì)照組，其余時(shí)點(diǎn)低于空白對(duì)照組(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 三組不同時(shí)期骨髓腔TGF-β表達(dá)的MOD值比較 (x±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與COX-2抑制組比較，#P<0.05。

圖3 免疫組化檢測各組兔橈骨骨髓腔中TGF-β1表達(dá)(×200；A：COX-2抑制劑組；B：空白對(duì)照組；C：聯(lián)合組)

3 討 論

骨折愈合受年齡、生活環(huán)境、組織損傷程度及藥物等多種因素的影響，是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜且又緩慢的過程。骨折后的疼痛成為患者最不能忍的痛苦之一，早期的疼痛劇烈，造成患者恐懼、應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)等，對(duì)術(shù)后恢復(fù)產(chǎn)生不良影響。鎮(zhèn)痛已成為臨床急性骨折患者必須解決的問題[3]?？诜﨨SAIDs最為常見，它通過抑制環(huán)氧化酶(COX)，阻斷花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用，但它在緩解疼痛、提高生活質(zhì)量的同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)副作用，影響骨折愈合[4]。隨著分子研究的深入，我們了解到骨折愈合是由多種細(xì)胞因子同時(shí)參與的過程，它們的調(diào)控決定了骨折愈合的速度及質(zhì)量[5]。有研究顯示NSAIDs能抑制TGF-β1的形成和釋放，因而干擾骨折愈合[6]。

TGF-β1是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)合成與調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)功能的一種蛋白多肽。而且TGF-β1因子還在骨折修復(fù)和重建中起著重要的作用，是骨折愈合中重要的調(diào)節(jié)因子。湯耿民等[7]發(fā)現(xiàn)骨愈片藥液能刺激體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞中TGF-β1-mRNA的合成。王華松等[8]觀察到骨碎補(bǔ)能促進(jìn)骨折局部TGF-β1的合成與分泌，加速骨折愈合。TGF-β1可以促進(jìn)成骨母細(xì)胞的增殖與分化[9]，抑制破骨細(xì)胞的生長，對(duì)軟骨細(xì)胞的生長也起著重要的作用[10]；還可以減少骨間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11]，并且能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌合成有利于骨基質(zhì)合成的蛋白如Ⅰ型膠原、骨連結(jié)素和骨橋蛋白等。除了鎮(zhèn)痛外，如何加快骨折的愈合也是目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。

活血接骨湯是常見的治療骨折的中藥方劑，已被制成不同藥劑應(yīng)用于臨床骨缺損的治療。研究表明，活血接骨湯能夠明顯加快骨折處血液微循環(huán)[12-13]，有效提高骨折周圍相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)骨折愈合，但中藥復(fù)方對(duì)骨折早期鎮(zhèn)痛療效較西藥差。因此，探索一種快速、安全、有效的緩解骨折疼痛，同時(shí)又不影響骨折愈合的治療方案勢在必行，開發(fā)成分穩(wěn)定且不良反應(yīng)少的新藥是治療骨折的新趨勢和新方向。

本研究結(jié)果顯示，在2W時(shí)聯(lián)合組血液流變學(xué)指標(biāo)均顯著優(yōu)于空白對(duì)照組和COX-2抑制組，提示活血接骨湯可改善血液流變學(xué)指標(biāo)，增加骨折愈合的速度。TGF-β1細(xì)胞因子在局部骨折處骨外膜、骨內(nèi)膜、骨髓腔的表達(dá)，在聯(lián)合組較空白對(duì)照組和COX-2抑制組的表達(dá)增高。由此可以推斷：骨折創(chuàng)傷后會(huì)刺激身體局部的應(yīng)激反應(yīng)，分泌相關(guān)因子如TGF-β1，并持續(xù)一段時(shí)間，通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)加速機(jī)體修復(fù)骨缺損。COX-2抑制劑通過阻礙TGF-β1的表達(dá)而影響骨折愈合，而活血接骨湯聯(lián)合COX-2抑制劑可以彌補(bǔ)這一缺陷，在鎮(zhèn)痛的同時(shí)加快骨折愈合。

綜上所述，活血接骨湯與COX-2抑制劑存在協(xié)同作用，具有增加TGF-β1等細(xì)胞因子表達(dá)的作用及改善骨折局部血液循環(huán)。活血接骨湯和COX-2抑制劑聯(lián)合使用促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能與提高TGF-β1的表達(dá)及改善骨折處局部供血有關(guān)，為活血接骨湯拮抗COX-2抑制劑促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制提供了佐證，為臨床應(yīng)用活血接骨湯聯(lián)合COX-2抑制劑促進(jìn)骨折愈合提供科了學(xué)理論依據(jù)。

[1] Rapp AE,Kroner J,Baur S,et al. Analgesia via blockade of NGF/TrkA signaling does not influence fracture healing in mice[J]. J Orthop Res,2015,33(8):1235-1241.

[2] Geusens P,Emans PJ,de Jong JJ,et al. NSAIDs and fracture healing[J]. Curr Opin Rheumatol,2013,25(4):524-531.

[3] Oberkircher L,Schubert N,Eschbach DA,et al. Prehospital Pain and Analgesic Therapy in Elderly Patients with Hip Fractures[J]. Pain Pract,2016,16(5):545-551.

[4] Busti AJ,Hooper JS,Amaya CJ,et al.Effects of perioperative antiinflammatory and immunomodulating therapy on surgical wound healing[J].Pharmacotherapy,2005,25(11):1566-1591.

[5] Ferrara N,Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells.1989[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,425(3):540-547.

[6] Kaygusuz MA,Turan CC,Aydin NE,et al. The effects of G-CSF and naproxen sodium on the serum TGF-beta1 level and fracture healing in rat tibias[J]. Life Sci,2006,80(1):67-73.

[7] 湯耿民,沈 霖,涂意輝,等.補(bǔ)腎活血方對(duì)成骨細(xì)胞生長因子TGF-β1mRNA表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,1999,7(5):5-7.

[8] 王華松,許申明.骨碎補(bǔ)對(duì)骨折愈合中TGF-β1表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2001,9(4):10-13.

[9] Markatseli A,Lazaros L,Markoula S,et al. Association of the (TTTA)n repeat polymorphism of CYP19 gene with bone mineral density in Greek peri-and postmenopausal women[J]. Clin Endocrinol(Oxf),2014,81(1):38-44.

[10] Shi M,Zhu J,Wang R,et al。Latent TGF-β structure and activation[J].Nature,2011,474(7351):343-349.

[11] Frenkel SR,Saadeh PB,Mehrara BJ,et al.Transforming growth factor beta superfamily members: role in cartilage modeling[J].Plast Reconstr Surg,2000,105(3):980-990.

[12] 劉 超.續(xù)骨活血湯和接骨紫金丹在三踝骨折治療中的應(yīng)用[J]. 中醫(yī)正骨,2015,27(6):57-58.

[13] 張偉宏.補(bǔ)腎活血接骨湯對(duì)骨質(zhì)疏松骨折愈合過程中凝血相關(guān)因子及VEGF水平的影響[J]. 四川中醫(yī),2017,35(6):139-141.