17-AAG在氧糖剝奪后復(fù)糖復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中的作用

李建雄，李鳴明，卜玉潔，李斌，鄒華，張廷華

腦缺血性損傷已成為危害人類(lèi)生命健康的危重病之一，其導(dǎo)致的神經(jīng)元不可逆死亡可以造成神經(jīng)功能和行為學(xué)障礙甚至死亡[1-4]。目前唯一可用于治療急性缺血性卒中的藥物是組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)。但是，tPA治療必須在中風(fēng)發(fā)作后4.5h內(nèi)進(jìn)行[5]，一旦超過(guò)4.5h的治療窗口，溶栓導(dǎo)致的顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[6]。因此目前臨床上迫切需要開(kāi)發(fā)新的腦缺血性損傷保護(hù)藥物或探索新的治療思路[7]。

17-烯丙基氨基-17-甲基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)是熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)抑制劑。大量研究表明，17-AAG能夠抑制肺腺癌、膽管癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡[8-10]。此外，有研究表明，在創(chuàng)傷性腦損傷中17-AAG可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11-13]。同時(shí)，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，17-AAG可以抑制短暫性全腦缺血誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元死亡[14]。但是，17-AAG在腦缺血過(guò)程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。Kim等[13]研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷性腦損傷中，17-AAG可以通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中HSP70的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外，在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)17-AAG可以誘導(dǎo)短暫全腦缺血組織中HSP70的表達(dá)[13]。因此，我們推測(cè)17-AAG可能通過(guò)上調(diào)HSP70的表達(dá)來(lái)抑制氧糖剝奪復(fù)糖復(fù)氧模型(oxygenglucose deprivation and recovery，OGD/R)誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。為驗(yàn)證此設(shè)想，本研究擬以大鼠海馬神經(jīng)元OGD/R為基礎(chǔ)，探索17-AAG對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用以及HSP70在17-AAG發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用中的角色。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 出生1d的SD大鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)基、無(wú)糖DMEM、胎牛血清和B27添加劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，DAPI染色液和BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，兔抗大鼠HSP70和β-actin抗體以及山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，大鼠HSP70干擾慢病毒購(gòu)自世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 取出生1d內(nèi)的SD大鼠，消毒后斷頭，用鑷子分離海馬區(qū)并剪碎，加入1ml胰酶(0.125%)，在37℃條件下消化腦組織約20min，利用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化10min，然后離心(1500r/min，3min)，重懸沉淀后接種至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)72h，加入終濃度為1×10-5mol/L的阿糖胞苷作用48h，此后每3d更換半量培養(yǎng)基。

1.2.2 OGD/R模型的建立 為在體外模擬腦缺血時(shí)神經(jīng)元所處的病理?xiàng)l件，我們參考文獻(xiàn)[15-16]中報(bào)道的方法建立OGD/R模型。首先將無(wú)糖DMEM放入缺氧艙(5%CO2，95%N2)內(nèi)4h以上，然后將培養(yǎng)了12d的神經(jīng)元中的培養(yǎng)基更換為上述已準(zhǔn)備好的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，最后放入缺氧艙中，置于37℃條件下分別氧糖剝奪0.5、1、2h，隨后更換為正常培養(yǎng)基，在正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理 實(shí)驗(yàn)一：為研究OGD/R對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，將大鼠海馬神經(jīng)元分為對(duì)照組(Con組)，即正常培養(yǎng)，不給任何干預(yù)；OGD/R (0.5h)組：即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪0.5h，復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)24h；OGD/R(1h)組：即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪1h，復(fù)糖復(fù)氧24h)；OGD/R (2h)組：即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪2h，復(fù)糖復(fù)氧24h。實(shí)驗(yàn)二：為研究17-AAG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，將細(xì)胞分為DMSO組(對(duì)OGD/R模型細(xì)胞給予DMSO處理24h)，17-AAG 0.5μmol/L組(對(duì)OGD/R模型細(xì)胞給予17-AAG 0.5μmol/L處理24h)，17-AAG 1μmol/L組(對(duì)OGD/R模型細(xì)胞給予17-AAG 1μmol/L處理24h)，以及17-AAG 2μmol/L組(對(duì)OGD/R模型細(xì)胞給予17-AAG 2μmol/L處理24h)。實(shí)驗(yàn)三：為探討17-AAG對(duì)OGD/R處理后大鼠海馬神經(jīng)元中HSP70蛋白表達(dá)的影響，將細(xì)胞分成DMSO組，即正常培養(yǎng)，僅添加DMSO；OGD/R處理組，即對(duì)細(xì)胞氧糖剝奪1h、復(fù)糖復(fù)氧24h；OGD/R+17-AAG組，對(duì)細(xì)胞氧糖剝奪1h、復(fù)糖復(fù)氧24h，同時(shí)17-AAG 1μmol/L處理24h。實(shí)驗(yàn)四：為確認(rèn)本研究構(gòu)建的HSP70干擾對(duì)17-AAG+OGD/R聯(lián)合處理?xiàng)l件下的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，將細(xì)胞分成RNAi con組，即對(duì)細(xì)胞氧糖剝奪1h、復(fù)糖復(fù)氧24h，同時(shí)17-AAG 1μmol/L和RNAi對(duì)照聯(lián)合處理24h；HSP70 RNAi組，即對(duì)細(xì)胞氧糖剝奪1h、復(fù)糖復(fù)氧24h，同時(shí)17-AAG 1μmol/L和HSP70 RNAi聯(lián)合處理24h。

1.2.4 TUNEL實(shí)驗(yàn) 將按照分組處理的神經(jīng)元先用PBS洗2次，然后通過(guò)4%的多聚甲醛固定25min，固定完畢后用PBS浸洗2次，然后利用含0.2% Triton X-100的PBS處理細(xì)胞3min，PBS浸洗，最后加入TUNEL染色液，在37℃條件下孵育1h，孵育完成后利用PBS洗4次，每次7min，再利用DAPI染核，PBS洗后加入含有抗熒光淬滅的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)神經(jīng)元中HSP70蛋白的表達(dá) 將按照分組處理的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞用PBS洗滌2次，收集細(xì)胞并離心，加入蛋白抽提裂解液處理8min；處理完畢后，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量；在蛋白樣品中加入2×上樣緩沖液，于沸水中變性。變性完成后，每孔上樣100μg總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜；利用含5%脫脂奶粉的封閉液在室溫條件下封閉1h；隨后加入一抗，于4℃條件下過(guò)夜，TBST洗膜4次、每次10min；加入目的二抗，于37℃條件下孵育1h，TBST洗膜4次。最后利用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行蛋白相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2.6 HSP70干擾 shRNA慢病毒載體構(gòu)建從G e n B a n k中獲得大鼠H S P 7 0基因序列信息(NM_031971.2)，由世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計(jì)合成HSP70 shRNA序列：正向5'-CCGGG TCCTATGCCTTCAACATGAACTCGAGCATGTTG AAGGCATAGGACTCTTTTTTG-3'，反向5'-AATTC AAAAAAGAGTCCTATGCCTTCAACATGCTCGAG TTCATGTTGAAGGCATAGGAC-3'。通過(guò)退火形成雙鏈，再重組入已經(jīng)線性化的載體LV-hU6-shRNACMV-EGFP中，經(jīng)測(cè)序鑒定后利用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒，病毒經(jīng)純化、濃縮后進(jìn)行滴度測(cè)定，并于–80℃冰箱中保存。

1.2.7 慢病毒感染大鼠海馬神經(jīng)元 將構(gòu)建好的慢病毒顆粒按照不同感染復(fù)數(shù)(MOI)20、40、80感染神經(jīng)元，感染12h后更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率或進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間滿足方差齊性條件下采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；多組間在方差齊性基礎(chǔ)上采用單因素方差分析(ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)情況 神經(jīng)元分離后接種2h開(kāi)始貼壁；12s后胞體飽滿，呈錐體形、橢圓形、圓形、多邊形，胞體延伸出大量突起。

2.2 OGD/R對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，神經(jīng)元凋亡率在Con組為11.38%±4.59%，在OGD/R(0.5h)組為25.08%±2.96%，在OGD/R(1h)組為41.93%±3.90%，在OGD/R(2h)組為50.54%±4.39%。與Con組相比，氧糖剝奪1h和2h的神經(jīng)元凋亡率均明顯提高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中OGD/R選擇氧糖剝奪1h、復(fù)糖復(fù)氧24h作為實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 17-AAG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 本研究通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度(0.5、1、2μmol/L)的17-AAG對(duì)氧糖剝奪1h、復(fù)氧復(fù)糖24h處理后神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果顯示，神經(jīng)元凋亡率在DMSO組為46.31%±2.86%，在17-AAG 0.5μmol/L處理組為38.31%±3.02%、在17-AAG 1μmol/L處理組為22.22%±3.63%，在17-AAG 2μmol/L處理組為17.82%±1.58%。與DMSO組比較，3種濃度的17-AAG均能明顯降低OGD/R誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡(圖2)，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇1μmol/L作為17-AAG濃度處理神經(jīng)元。

2.4 17-AAG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元中HSP70表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示，DMSO組、OGD/R處理組和OGD/R+17-AAG組神經(jīng)元中HSP70蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.33±0.09、0.22±0.03和0.46±0.05；與對(duì)照組相比，OGD/R處理組中HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；與OGD/R組相比，OGD/R+17-AAG組神經(jīng)元中HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01；圖3)。

2.5 HSP70干擾慢病毒質(zhì)粒測(cè)序鑒定 結(jié)果表明，測(cè)序獲得的載體中干擾序列信息與設(shè)計(jì)合成的HSP70干擾慢病毒質(zhì)粒靶點(diǎn)信息完全一致(圖4)。

2.6 HSP70干擾慢病毒最佳感染復(fù)數(shù)篩選 本研究利用不同MOI值的病毒感染大鼠神經(jīng)元以篩選最佳的病毒與細(xì)胞比例。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明當(dāng)MOI=80時(shí)，慢病毒對(duì)神經(jīng)元的感染效率最高(圖5)。

2.7 HSP70干擾逆轉(zhuǎn)17-AAG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用 Western blotting結(jié)果表明，RNAi con組和HSP70 RNAi組大鼠海馬神經(jīng)元中HSP70的相對(duì)表達(dá)分別為0.45±0.04和0.17±0.02。與RNAi con組相比，HSP70 RNAi組HSP70的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01，圖6)。同時(shí)，本研究通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)HSP70干擾對(duì)17-AAG+OGD/R處理?xiàng)l件下的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果顯示，HSP70 RNAi組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率(42.64%±3.84%)明顯高于RNAi con組(11.31%±1.92%，P<0.01，圖7)。

圖1 OGD/R誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡(TUNEL ×200，n=3)Fig.1 OGD/R induced rat hippocampal neurons apoptosis (TUNEL ×200, n=3)

圖2 17-AAG抑制OGD/R誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡 (TUNEL ×200，n=3)Fig.2 17-AAG suppressed rat hippocampal neurons apoptosis induced by OGD/R (TUNEL ×200, n=3)

圖3 17-AAG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元中HSP70表達(dá)的影響(Western blotting，n=3)Fig.3 The effect of 17-AAG on the expression of HSP70 protein in rat hippocampal neurons treated with OGD/R (Western blotting, n=3)

圖4 測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing results

圖5 慢病毒感染的大鼠海馬神經(jīng)元(熒光顯微鏡×200)Fig.5 Rat hippocampal neurons infected by lentivirus (Fluorescence microscope ×200)

圖6 HSP70干擾抑制17-AAG+OGD/R處理組大鼠海馬神經(jīng)元中HSP70的表達(dá)(Western blotting，n=3)Fig.6 HSP70 protein was down-regulated by HSP70 RNAi in rat hippocampal neurons treated with 17-AAG and OGD/R(Western blotting, n=3)

3 討 論

目前，腦缺血已成為嚴(yán)重危害我國(guó)居民生命和健康的疾病之一。缺血再灌注后引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起神經(jīng)元的損傷和死亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能和行為障礙[17]。因此，抑制神經(jīng)元的不可逆死亡有望改善腦缺血患者的神經(jīng)功能。

圖7 HSP70干擾提高17-AAG+OGD/R處理組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡率(TUNEL ×200，n=3)Fig.7 HSP70 RNAi induced the apoptosis of rat hippocampal neurons treated with 17-AAG and OGD/R (TUNEL ×200, n=3)

在既往短暫全腦缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)17-AAG可以明顯抑制大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，減少腦梗死體積，改善大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，有望成為腦缺血后抑制神經(jīng)損傷的有效藥物[14]。為了進(jìn)一步證明17-AAG在神經(jīng)保護(hù)中的作用，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元構(gòu)建OGD/R模型模擬在體腦缺血再灌注損傷。首先，在實(shí)驗(yàn)中我們選擇了3個(gè)氧糖剝奪的時(shí)間點(diǎn)，即0.5、1、2h，然后再灌注24h，利用TUNEL免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組神經(jīng)元的凋亡情況。結(jié)果表明，氧糖剝奪時(shí)間為1h和2h時(shí)，神經(jīng)元的凋亡率均明顯升高。Wang等[15,18]的研究表明，體外培養(yǎng)的神經(jīng)元在氧糖剝奪2h后復(fù)糖復(fù)氧24h細(xì)胞凋亡明顯增加，這說(shuō)明本研究構(gòu)建的OGD/R模型是成功的。最后，我們將后續(xù)研究采用的OGD/R參數(shù)確定為氧糖剝奪1h、復(fù)糖復(fù)氧24h。同時(shí)，我們通過(guò)TUNEL檢測(cè)了不同濃度的17-AAG對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果表明，0.5、1、2μmol/L 3種濃度的17-AAG均能抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，且濃度越高抑制效果越明顯。這與本課題組前期在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。因此，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果進(jìn)一步證明了17-AAG在神經(jīng)保護(hù)中的作用。但是，17-AAG發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制仍不清楚，還須進(jìn)一步深入研究。

既往報(bào)道HSP70可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號(hào)影響細(xì)胞的存活[19-20]。在創(chuàng)傷性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ秃图?xì)胞模型中，HSP70已被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用[21-23]。在既往短暫全腦缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)17-AAG可以誘導(dǎo)缺血區(qū)HSP70蛋白的表達(dá)[14]。同時(shí)，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OGD/R明顯抑制神經(jīng)元細(xì)胞中HSP70蛋白的表達(dá)，而17-AAG可以誘導(dǎo)OGD/R處理的神經(jīng)元細(xì)胞中HSP70蛋白的表達(dá)。因此，我們推測(cè)HSP70在17-AAG抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中扮演重要角色。為了驗(yàn)證我們的推斷，本研究構(gòu)建了HSP70 RNA干擾慢病毒，抑制17-AAG+OGD/R處理?xiàng)l件下神經(jīng)元中HSP70的表達(dá)。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSP70干擾逆轉(zhuǎn)了17-AAG對(duì)OGD/R處理的神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用，這說(shuō)明HSP70確實(shí)在17-AAG誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)中具有重要作用。

綜上所述，本研究表明17-AAG可以通過(guò)上調(diào)HSP70的表達(dá)來(lái)抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，為腦缺血性損傷的治療提供了新的潛在藥物和靶點(diǎn)。

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