巨噬細(xì)胞外泌體抑制HBV DNA復(fù)制

楊 帆，楊 濤，周文靖，徐若男，王福生

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由HBV感染引起的一種潛在危及生命的肝臟疾病。據(jù)WHO報(bào)道，全球約有2.4億HBV感染者[1-2]。病毒持續(xù)復(fù)制、機(jī)體HBV特異性免疫功能低下，誘發(fā)肝組織發(fā)生特異性和非特異性免疫損傷是CHB發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)[3]。

外泌體于1983年首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[4]，是一種特異性的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，表達(dá)CD63、CD81、MFGE8、GAPDH等膜蛋白以及熱休克蛋白等分子[5]。不同細(xì)胞來源的外泌體，其組成成分、表面標(biāo)志物和生物學(xué)功能不盡相同[6-8]。例如在小鼠肝纖維化模型中，外泌體相關(guān)微小RNA（microRNA,miRNA）-214 作為效應(yīng)分子直接參與肝星狀細(xì)胞的激活[9]。另外，血漿外泌體中miRNA-192升高可能是酒精性肝損傷加重的危險(xiǎn)因素[10]。

前期研究顯示IFN-α可以通過誘導(dǎo)肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌高水平外泌體相關(guān)的miRNA-638間接抑制HBV DNA復(fù)制，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[11]。然而免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞（macrophage,M?）是否可以借助外泌體發(fā)揮直接抗病毒效應(yīng)，并且這種抗病毒效應(yīng)與miRNA-638的關(guān)系目前尚不清楚。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 PCR的方法，體外驗(yàn)證外泌體是否具有抑制HBV DNA復(fù)制的功能，同時(shí)檢測(cè)M?及M?外泌體中miRNA-638的表達(dá)，探討M?外泌體中miRNA-638抑制HBV DNA復(fù)制及與CHB患者肝損傷及病毒復(fù)制的相關(guān)性。其次，通過實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)CHB患者外周血血清外泌體中miRNA-638的表達(dá)，并分析其與肝損傷的相關(guān)性。

1 對(duì)象與材料

1.1 對(duì)象 2016年12月—2017年9月解放軍第三〇二醫(yī)院門診收治的CHB免疫活化（immune activation,IA）期、低（非）復(fù)制（inactive carrier,IC）期患者41例。其中，IA期患者25例（男19例，女6例），平均年齡為（31.5±9.2）歲；IC期16例（男12例，女4例），平均年齡為（36.4±15.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①IA期：HBsAg和HBeAg陽性，HBV DNA＞100 000 IU/ml，轉(zhuǎn)氨酶＞60 U/L ；②IC期：HBeAg陰性且HBeAb陽性，HBV DNA＜10 000 IU/ml，轉(zhuǎn)氨酶正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并HCV或HIV感染；合并酒精性肝損傷；肝臟原發(fā)或繼發(fā)性惡性腫瘤；肝外梗阻性病變；孕婦等。2組患者均為未接受抗病毒治療的初治患者，健康對(duì)照（healthy control,HC）為同時(shí)期本研究室工作人員，共12例（表1）。

表1 基本臨床資料Table 1 Basic clinical data

1.2 材料 HepG2.2.15及THP-1細(xì)胞株由解放軍第三〇二醫(yī)院感染病診療與研究中心提供；DMEM、1640培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco公司）；佛 波 酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）、GW4869（Sigma公司）；anti-CD14-percp-cy5.5、anti-CD11b-FITC、anti-CD9-FITC及 anti-CD63-percpvio700（美國(guó)BD公司）；ExoQuick、ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒（美國(guó)SBI）；超過濾管（美國(guó)Millipore）；HBV DNA檢測(cè)試劑盒（湖南圣湘生物科技有限公司）；Trizol試劑、總外泌體RNA分離試劑盒（北京天漠生物科技有限公司）；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（廣州銳博科技生物有限公司）；miRNA-638、內(nèi)參（U6）及外參（cel-mir-39-3p）的特異性探針（廣州銳博科技生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人-單核細(xì)胞系THP-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)1200 rpm離心5 min后換液或傳代，同時(shí)要注意維持THP-1細(xì)胞均一、圓形、透亮的懸浮狀態(tài)。HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)1200 rpm離心5 min后換液或傳代。

2.2 M?外泌體的體外誘導(dǎo) 將懸浮的THP-1細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的密度接種于75 cm2培養(yǎng)基中，并加PMA（50 ng/ml）進(jìn)行誘導(dǎo)。24 h后懸浮的THP-1細(xì)胞被誘導(dǎo)為貼壁的M?，用PBS清洗并更換為無FBS的1640培養(yǎng)基，加入10%無外泌體的FBS作為對(duì)照組，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)上清備用。

2.3 外泌體的分離 ①M(fèi)?上清外泌體分離：取M?上清液，用超過濾管3000×g離心30 min，取上層上清，按5∶1比例加入外泌體抽提試劑，快速混合均勻后置于4 ℃過夜，次日取出，1500×g離心30 min后棄去上清，沉淀即為抽提的外泌體，用PBS重懸后通過BCA法進(jìn)行蛋白定量。置于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。②血清外泌體分離：取所有入組者的外周血血清與外泌體抽提試劑按4∶1比例混合均勻后，置于4 ℃冰箱30 min，1500×g離心30 min后棄去上清，沉淀即為抽提的血清外泌體。置于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。

2.4 外泌體的鑒定 外泌體電鏡標(biāo)本制備及觀察：取外泌體樣品，向樣品中滴入染色劑醋酸鈾水溶液（1%），混勻，用移液槍滴加至去靜電的復(fù)膜銅網(wǎng)上，室溫靜置自然干透后于透射電鏡下觀察，并進(jìn)行拍攝。外泌體流式細(xì)胞儀檢測(cè)：將latex beads溶于300 μl MES buffer中，混勻后4000 rpm離心 15 min。每管加入 20 μg/μl的外泌體，加入MES buffer混勻。室溫下孵育60 min后，甘氨酸室溫封閉30 min。用含3% FBS MES buffer洗滌后分別加入CD9抗體和CD81抗體，同型IgG抗體作為空白對(duì)照。

2.5 M?外泌體與HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng) 將10 μmol/L M?外泌體阻斷劑GW4869加入M?培養(yǎng)上清，無血清條件下刺激48 h，將細(xì)胞上清與HepG2.2.15細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h。收集上清用于HBV DNA定量檢測(cè)。

2.6 HBV DNA的實(shí)時(shí)定量 PCR定量分析 取HBV DNA檢測(cè)試劑盒中的各組分，平衡至室溫后混勻備用。取5 μl M?與HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)上清加至96孔板后繼續(xù)加入5 μl樣品釋放劑（陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、定量參考品與待測(cè)樣本相同處理），每管加入40 μl PCR混合液，2000 rpm離心30 s。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃2 min；94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)；25 ℃ 10 s。

2.7 外泌體miRNA-638的檢測(cè) 分別提取M?、非M?、M?外泌體以及血清外泌體總RNA。用特異的反轉(zhuǎn)錄探針將miRNA-638反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄體系，配置反應(yīng)體系的所有操作均在冰上進(jìn)行。根據(jù)microRNA Assay操作手冊(cè)配制相關(guān)試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用U6作為內(nèi)參照，cel-mir-39-3p作為外參照，以2-ΔΔCt值評(píng)估m(xù)iRNA-638的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布以±s表示，非正態(tài)分布的資料以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)采用成組t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 M?的體外誘導(dǎo)及鑒定 THP-1細(xì)胞經(jīng)50 ng/ml PMA刺激24 h后，細(xì)胞由懸浮、圓形變成貼壁、有偽足的M?（圖1A）。M?經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PMA刺激后的M?高表達(dá)CD11b-FITC及CD14-percp-cy5.5 ，陽性率分別為：97.2%、96.4%（圖1B）。

圖1 M?形態(tài)和流式鑒定A.PMA誘導(dǎo)前后M?的形態(tài)學(xué)觀察；B.M?的流式鑒定Figure 1 Morphology and flow identification of macrophage

3.2 外泌體的形態(tài)學(xué)鑒定及流式細(xì)胞學(xué)分析 在透射電鏡下顯示M?外泌體呈圓形或橢圓形，大小不一，外形直徑在100 nm左右，可見明顯的膜性結(jié)構(gòu)（圖2A）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示提取的外泌體表達(dá)特異性表面標(biāo)志物分子CD9和CD81，陽性率分別為59.3%、55.8%（圖2B）。

3.3 M?外泌體抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制 通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBV DNA的表達(dá)水平。結(jié)果如表2所示，無血清條件下，M?外泌體可以明顯抑制HBV DNA的復(fù)制。經(jīng)GW4869阻斷后，發(fā)現(xiàn)M?上清抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的能力明顯降低（P＜0.05）（圖3）。以上結(jié)果顯示，體外條件下，M?來源的外泌體可以有效抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA的復(fù)制。

圖2 M?來源外泌體的特征鑒定A.外泌體的電鏡鑒定；B.外泌體的流式鑒定Figure 2 Characteristics identification of macrophage-derived exosomes

表2 HBV DNA定量情況（±s，log10IU/ml）Table 2 Quantification of HBV DNA(±s,log10IU/ml)

表2 HBV DNA定量情況（±s，log10IU/ml）Table 2 Quantification of HBV DNA(±s,log10IU/ml)

注：FBS均指無外泌體的FBS；-.表示無FBS或GW4869刺激；+.表示有FBS或GW4869刺激；ND.沒有檢測(cè)

培養(yǎng)條件 FBS- FBS+GW4869 - 2.926±0.454 4.600±0.598 GW4869 + 4.533±0.751 ND

圖3 M?來源外泌體抑制HBV DNA復(fù)制（n=18）注：-.表示無FBS或GW4869刺激；+.表示有FBS或GW4869刺激（FBS均指無外泌體的FBS）；***.P＜0.001Figure 3 Macrophage-derived exosomes inhibits HBV DNA replication (n=18)

3.4 M?外泌體中miRNA-638表達(dá)水平分析 結(jié)合前期的研究結(jié)果，為了進(jìn)一步分析M?中miRNA的表達(dá)情況，經(jīng)磁珠分選人單核細(xì)胞后，分別檢測(cè)人單核M?以及除去單核M?以外的外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，人外周血來源M?組中的miRNA-638的表達(dá)水平高于非M?組（P＜0.05）（圖4A）。THP-1來源的M?經(jīng)體外無FBS（無外泌體）刺激后，M?外泌體中miRNA-638的表達(dá)也明顯升高（P＜0.05）（圖4B）。

3.5 CHB患者血清外泌體中miRNA-638的表達(dá) 通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)受試對(duì)象血清外泌體中miRNA-638的表達(dá)，結(jié)果顯示，IA期、IC期及HC組3組miRNA-638的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.168±0.208、0.824±0.605、1.307±0.282，IA 期 患者血清外泌體中miRNA-638表達(dá)水平低于IC期，并且2組患者的miRNA-638表達(dá)水平均低于HC組（P均＜0.05）（圖5）。

3.6 CHB患者IA期血清外泌體中miRNA-638與肝損傷和HBV DNA復(fù)制的相關(guān)性分析 CHB患者IA期血清外泌體中miRNA-638表達(dá)水平與ALT（r=0.539，P=0.006）、AST（r=-0.589，P=0.002）、 和 HBV DNA（r=-0.656，P=0.000）水平均呈負(fù)相關(guān)（圖6）。

4 討 論

外泌體來自于細(xì)胞的內(nèi)吞系統(tǒng)，電鏡下外泌體呈球狀、杯狀，直徑在30～100 nm之間，富含效應(yīng)分子如mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)等[12]。外泌體中的miRNA因其本身所具有的調(diào)控基因表達(dá)的強(qiáng)大功能，吸引了更多的研究者的關(guān)注。miRNA是一類長(zhǎng)約19～25個(gè)核糖核苷酸的非編碼調(diào)控單鏈小分子的RNA。目前miRbase數(shù)據(jù)庫已有多達(dá)9500多個(gè)該類分子，研究證實(shí)許多miRNA與人類病毒感染、腫瘤等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13]。前期研究顯示，IFN-α的抗病毒效應(yīng)是通過M?相關(guān)外泌體介導(dǎo)的，與外泌體中高表達(dá)的miRNA-4284、miRNA-638分子密切相關(guān)[11]。外泌體富含效應(yīng)分子如mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)等在HBV DNA復(fù)制、肝細(xì)胞炎性損傷、肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞來源的外泌體可以調(diào)節(jié)肝臟的炎性反應(yīng)[16]。然而，M?作為天然免疫的重要組成部分，自身的抗病毒功能不容忽視。M?來源的外泌體是否具備直接的抗病毒功能，在肝臟炎性損傷中的作用目前還不清楚。就目前而言，肝臟疾病相關(guān)外泌體的研究還處于起步階段，特別是免疫細(xì)胞來源的外泌體與病毒性肝炎、肝硬化以及肝癌之間的研究還較少。

圖4 人外周血M?及THP-1細(xì)胞上清外泌體中miRNA-638的表達(dá)鑒定（n=4）A.M?及去除M?以外的外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-638的表達(dá)；B.有無血清刺激條件下，M?上清外泌體中miRNA-638的表達(dá)Figure 4 Expression of miRNA-638 in the exosomes derived from human peripheral blood macrophages and the supernatant of THP-1 cell line (n=4)

分泌外泌體的細(xì)胞受不同物質(zhì)的調(diào)控，M?外泌體具有自己特殊的性質(zhì)，其表面常見分子標(biāo)志有CD9、CD81、CD63等。本研究從M?培養(yǎng)上清中分離鑒定出外泌體，電鏡下觀察近似圓形，直徑在30～100 nm之間，表達(dá)特征性標(biāo)志分子CD9和CD81。并且M?來源的外泌體可以有效抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA復(fù)制。GW4869是已知的外泌體阻斷劑[17]，當(dāng)外泌體被特異性阻斷劑（GW4869）阻斷后，細(xì)胞上清中總蛋白和總RNA水平降低（前期研究已證實(shí)），外泌體對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制效果也明顯減弱。單獨(dú)應(yīng)用GW4869并不影響HepG2.2.15細(xì)胞自身的HBV DNA的復(fù)制。說明外泌體可能是抑制HBV DNA復(fù)制的效應(yīng)分子。

目前已有大量的文獻(xiàn)涉及外泌體中miRNA的體內(nèi)研究。本研究進(jìn)一步證實(shí)M?外泌體中高水平表達(dá)miRNA-638分子，經(jīng)無血清刺激后表達(dá)上調(diào)。臨床研究結(jié)果顯示，IA期患者血清外泌體相關(guān)miRNA-638表達(dá)較IC期明顯降低。并且IA期患者血清外泌體中miRNA-638的表達(dá)水平與其自身ALT、AST及HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān)。但本研究并未進(jìn)行miRNA-638的阻斷試驗(yàn)，須要進(jìn)一步確定外泌體中miRNA-638對(duì)HBV DNA復(fù)制和HBsAg合成的影響，同時(shí)由于病例數(shù)較少，是否可以作為診斷肝損傷的免疫學(xué)指標(biāo)還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步觀察。另外，入組的2組CHB患者均未接受抗病毒治療，而抗病毒治療是否會(huì)影響到外泌體的分泌和功能還有待進(jìn)一步探索。

圖6 CHB患者血清外泌體miRNA-638與血清轉(zhuǎn)氨酶和病毒復(fù)制的相關(guān)性分析Figure 6 Correlation with exosome associated miRNA-638 derived from serum in CHB patients with serum transaminase and viral replication

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