雞β-防御素7的克隆及表達(dá)

易道生，魏曉東，繆永建，陳燕飛

（韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

抗菌肽是具有抗菌、抗病毒作用的小分子多肽，防御素是一類重要的抗菌肽，抗菌肽廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，哺乳動(dòng)物防御素包括α-防御素、β-防御素和θ-防御素三亞類［1-2］。研究表明，防御素有很強(qiáng)的抑菌活性，能有效滅殺細(xì)菌、真菌以及病毒（如HIV病毒）等病原微生物［3-5］。目前，人類對(duì)微生物的抵抗主要使用化學(xué)藥劑和抗生素，但濫用抗生素容易導(dǎo)致動(dòng)物性食品抗生素超標(biāo)和耐藥菌株的出現(xiàn)，直接威脅人類的健康和安全［6］。使用生物體本身產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)——抗菌肽，既能達(dá)到抗菌目的，又可降解無殘留，符合未來生態(tài)安全的發(fā)展趨勢(shì)。

雞體內(nèi)有多種防御素，均屬于β-防御素家族，其中命名為Gal-7的雞β-防御素7主要存在于雞骨髓中［7］，在抵抗微生物侵害的防御過程中發(fā)揮重要作用［8］。改革開放以來，養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，集約化養(yǎng)殖條件下，病原微生物更易導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病，為了降低動(dòng)物的發(fā)病率，保護(hù)養(yǎng)殖業(yè)主的利益和保證動(dòng)物源食品的質(zhì)量安全，急需向養(yǎng)殖業(yè)引入新的綠色高效抗菌藥物。如果用傳統(tǒng)方法從雞體內(nèi)提取防御素或通過化學(xué)方法合成防御素，不但過程繁雜，且效率低、成本高，必將制約其大規(guī)模應(yīng)用。采用基因工程的技術(shù)方法生產(chǎn)防御素為解決這個(gè)難題提供了一種高效低成本的手段。原核表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)小分子蛋白，并且能保持重組蛋白質(zhì)的活性和保護(hù)其免疫原性。近年來，雞防御素基因的克隆表達(dá)逐漸增多，但從雞體內(nèi)克隆Gal-7基因的研究國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。Milona［9］采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了重組雞Gal-7。李民歡等［10］化學(xué)合成了Gal-7，構(gòu)建工程菌體外表達(dá)的Gal-7對(duì)葡萄球菌、沙門氏菌等多種病原菌都具有較強(qiáng)的抑制作用，為Gal-7的應(yīng)用展示出誘人前景。本試驗(yàn)通過RT-PCR法克隆了Gal-7基因，構(gòu)建了pET32a-Gal7表達(dá)載體，通過原核表達(dá)系統(tǒng)，大量表達(dá)Gal-7融合蛋白，為進(jìn)一步研究Gal-7的生物學(xué)特性和結(jié)構(gòu)功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，也為Gal-7天然抗菌藥劑的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、金黃色葡萄球菌。

1.1.2 載體及引物 pET32a、pUC18-T載體，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 酶與化學(xué)試劑 PCR試劑盒、DNA膠回收試劑盒、T載體克隆試劑盒、鎳柱、核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA Ligase、DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素、IPTG、咪唑，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Yeast extract、Tryptone購自O(shè)XOID公司；SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker購自上海升正生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、瓊脂粉、GoldView Acid stain、Tris、Tris-酚，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器設(shè)備 無菌操作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），TC-XX/H（b）型Ferrotec基因擴(kuò)增儀（杭州大和熱磁電子有限公司），電泳儀、紫外分析儀（北京市六一儀器廠），SP-752型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），臺(tái)式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海之信儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 以GenBank公布的Gal-7基因序列（NM_001001194）設(shè)計(jì)1對(duì)引物，

P1：gTggAT CCT TCA TTA TgAggC CTA TTg，P2：AgAAgC TTA gTT ATC AgC TCC TCC ATC。

上游引物加酶切位點(diǎn)BamHⅠ，下游引物加酶切位點(diǎn)HindⅢ 。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 用雞脊髓成熟Gal-7基因?yàn)槟０?，用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增。

反應(yīng)體系：第一鏈cDNA模板1 μL，P1（50 pmol/L）0.5 μL，P2（50 pmol/L）0.5 μL，2× PCR Plus Master Mix 25 μL，添加無DNase雙蒸水補(bǔ)足至50 μL，混勻，離心10 s。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、52℃ 退火 30 s、72℃延伸 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收與T載體連接后，導(dǎo)入E.coli DH5α擴(kuò)增。

1.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建 提取DH5α陽性菌中的T- Gal7，用限制性核酸內(nèi)切酶Hind III 和BamH I對(duì)T-Gal7質(zhì)粒與pET32a載體分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳鑒定及膠回收純化后，各取適量并加入T4 DNA Ligase連接，操作參照試劑盒說明書和《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［11］實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），涂布于有氨芐青霉素選擇性的LB平板上37℃培養(yǎng)。

1.2.4 陽性菌株的篩選與基因表達(dá) 挑取典型菌落，經(jīng)質(zhì)粒酶切、PCR擴(kuò)增和上海生工生物公司測(cè)序，鑒定陽性菌落。測(cè)序正確的菌落，接種于液體培養(yǎng)基，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h。1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物純化及鑒定 對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束的菌液進(jìn)行離心，收集菌體，菌體重懸于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清液，經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm）過濾后，采用NTA-Ni親和柱層析分離純化蛋白，重組蛋白用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度，用紫外分光光度法測(cè)定蛋白含量。

1.2.6 雞Gal-7重組蛋白的抗菌活性 Gal-7融合蛋白的抗菌活性以金黃色葡萄球菌為受試菌，采用混菌瓊脂平板打孔擴(kuò)散法［12］。金黃色葡萄球菌劃線接種于LB平板培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)后置于4℃冰箱作為菌種備用。無菌工作臺(tái)內(nèi)，用內(nèi)徑約6 mm的打孔器在金黃色葡萄球菌指示菌平板上均勻打孔，每孔加50 μL不同濃度純化的雞Gal7重組蛋白，對(duì)照孔加入50 μL無菌水，吸收后置37℃培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞Gal-7基因擴(kuò)增

以來自雞脊髓的Gal-7成熟單鏈DNA為模版，P1、P2為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到125 bp目的產(chǎn)物（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)T載體連接和大腸桿菌擴(kuò)增，測(cè)序后與GenBank公布的雞Gal-7基因比對(duì)，同源性為99%，核酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列如圖2所示。

圖1 雞Gal-7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 雞Gal-7基因序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

DH5α擴(kuò)增的Gal-7基因和pET32a質(zhì)粒，經(jīng)過提純、雙酶切，提取、連接，轉(zhuǎn)化于E.coli BL21（DE3），選擇抗氨芐青霉素陽性的菌落擴(kuò)增，再次提取質(zhì)粒酶切鑒定，在5 000、125 bp處出現(xiàn)條帶（圖3），表明提取的質(zhì)粒含有Gal-7目的基因，表達(dá)質(zhì)粒pET32a- Gal7構(gòu)建成功。

2.3 重組雞Gal-7蛋白的表達(dá)純化與活性檢測(cè)

將表達(dá)載體pET32a-Gal7導(dǎo)入E.coli BL21（DE3），經(jīng)過1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h，表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到產(chǎn)量顯著增加，收集菌體經(jīng)過超聲破細(xì)胞、NTA-Ni親和柱純化分離，獲得該表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，大小和純度與預(yù)測(cè)一致（圖4）。使用金黃色葡萄球菌為指示菌，用打孔法檢測(cè)重組蛋白的活性，結(jié)果表明，本試驗(yàn)獲得的雞Gal-7重組蛋白，有很強(qiáng)的抗金黃色葡萄球菌活性，最低抑菌濃度為0.10 mg/mL（圖 5）。

圖3 pET32a-Gal7表達(dá)載體構(gòu)建

圖4 Gal-7融合蛋白純化前后對(duì)比

圖5 Gal-7重組蛋白的抗菌活性

3 結(jié)論與討論

雞β-防御素家族是一群由18～50個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成、分子量約3～5 ku、富含半胱氨酸、帶正電荷的陽離子多肽，一般分布在染色體的3q3.5～3q3.7位置，其表達(dá)有種屬與組織特異性［13］。防御素家族具有抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、原生動(dòng)物、部分真菌、被膜病毒、支原體、某些腫瘤等多種功能，是構(gòu)成機(jī)體天然非特異性黏膜免疫的重要組成分子，抗菌能力大小與α-螺旋結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度、正電荷多寡呈正相關(guān)，防御素的表達(dá)還受到炎性分子等的誘導(dǎo)效應(yīng)［4-5，9-10，14］。防御素的抗菌機(jī)理主要是靜電效應(yīng)，抗菌肽作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，與細(xì)菌表面負(fù)電荷相互作用，導(dǎo)致膜的通透性增大，以此穿透、殺滅細(xì)菌［3，15-16］。郭峰等［14］經(jīng)過對(duì)防御素處理過的細(xì)菌進(jìn)行電鏡觀祭，發(fā)現(xiàn)防御素作用于細(xì)菌后，破壞了細(xì)胞壁，在細(xì)菌外壁形成了囊泡，細(xì)菌質(zhì)壁分離，內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡，推測(cè)細(xì)菌細(xì)胞壁和膜上都存在防御素的作用位點(diǎn)。由DNA序列推測(cè)的氨基酸排列表明，雞β-防御素分子中包含6個(gè)半胱氨酸殘基，從防御素分子的組成結(jié)構(gòu)和抗菌機(jī)理分析，有學(xué)者認(rèn)為成熟肽分子中的3 對(duì)二硫鍵對(duì)活性至關(guān)重要［17-18］，Lin［19］對(duì)二硫鍵的研究也證明了二硫鍵在抗菌方面起到關(guān)鍵作用。本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化得到的重組雞β-Gal7 抑菌活性較強(qiáng)，且蛋白質(zhì)含有6個(gè)半胱氨酸，理論上可形成3對(duì)二硫鍵。

本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)雞Gal-7，采用常溫、低轉(zhuǎn)速、低IPTG 濃度誘導(dǎo)表達(dá)，得到了大量的可溶性蛋白。隨后通過一系列的純化過程獲得雞Gal-7 蛋白并進(jìn)行電泳鑒定，而重組雞Gal-7的體外抑菌試驗(yàn)的初步研究表明，對(duì)金黃色葡萄菌有較強(qiáng)的抑菌作用，最低有效濃度達(dá)到0.10 mg/mL。本研究結(jié)果為新型環(huán)?？咕砑觿┑难芯刻峁┝丝煽客緩?，為進(jìn)一步研究防御素的抗菌功能和機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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