蠐螬抗菌肽的制備及其穩(wěn)定性研究

王 成，余以剛，張 青，余祥雄，梁澤明

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

近年來，由于濫用抗生素飼料添加劑導(dǎo)致的抗藥性和藥物殘留問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到人類健康，尋找一類新型的抗菌藥物是解決該問題的有效途徑。昆蟲抗菌肽是昆蟲免疫后血淋巴中的一類抗菌多肽，它具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣的特點，可以抑殺某些真菌、病毒及原蟲，且抗菌機(jī)理獨特，不易產(chǎn)生抗藥性［1］。研究表明，抗菌肽具有作為一類新藥開發(fā)的巨大潛力，但由于抗菌肽的蛋白性質(zhì)，很多種類的抗菌肽穩(wěn)定性特別是酶解穩(wěn)定性差，制備出穩(wěn)定性好的抗菌肽具有重要的實際意義。

抗菌肽又稱抗微生物肽，是生物體液免疫的重要防御因子，在昆蟲的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，抗菌肽主要由脂肪體（類似于哺乳動物的肝臟）分泌，其他組織如消化道、氣管、馬氏管和特定的血細(xì)胞也能夠產(chǎn)生［2］。當(dāng)昆蟲體壁受到損傷或被微生物感染后，抗菌肽被迅速合成，并釋放入血淋巴中作用于細(xì)菌、病毒、真菌等［3］。其活性維持時間因昆蟲種類不同存在明顯差異［4］。

蠐螬隸屬于鞘翅目（Coleoptera），是金龜甲總科（Scarabaeoedea）幼蟲的統(tǒng)稱，又名地蠶、土蠶［5］。借助現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)以及檢測手段分析得知，蠐螬體內(nèi)含有各種氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)、糖類、生物堿和羧酸類化合物，以及較高含量的鈣、鐵、銅、錳等礦物元素［6］。近年來的研究表明，蠐螬具有顯著的抗癌抑癌、抗腫瘤［7］、抗氧化［8］、抗衰老和抗病毒、抗菌功效［9］。本研究使用酶解法以加酶量、酶解時間、料液比、pH為因素優(yōu)化胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白制備蠐螬抗菌肽的制備工藝，并研究pH、溫度、鹽濃度等環(huán)境因素對蠐螬抗菌肽抗菌效果的影響，為蠐螬資源的深度加工利用和自然抗菌產(chǎn)物研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、角蛋白酶（諾維信公司），脫脂蠐螬（廣東漢肽生物工程有限公司），大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（廣州市菌種保藏中心）。

模擬胃液的配制：取胃蛋白酶3.20 g，NaCl 2.00 g，溶解于1.00 L蒸餾水中，HCl調(diào)節(jié)pH值至1.20。

模擬腸液的配制：取胰蛋白酶10.00 g，磷酸二氫鉀6.80 g，溶解于1.00 L蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.50。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿溶酸提法提取蠐螬蛋白 準(zhǔn)確稱取50.00 g脫脂蠐螬樣品，以1∶15（ g/mL）的比例加入750 mL 1.5%的NaOH溶液，于60℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，1 000 r/min下離心10 min，取上清液。往上清液中緩慢倒入8.00 mol/L的HCl，直至不再產(chǎn)生沉淀，1 000 r/min離心力下離心10 min，取沉淀，冷凍干燥待用［10］。

1.2.2 酶解法制備蠐螬抗菌肽 準(zhǔn)確稱取5.00 g蠐螬蛋白樣品，按1∶15（ g/mL）比例加入75.00 mL蒸餾水，用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl將樣品調(diào)整到最適pH，按照50.00 ku/g酶活加入蛋白酶，酶解過程中用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl維持pH。酶解完成后，95℃中水浴15 min，終止酶解反應(yīng)，5 000 r/min離心5 min，取上清液，得到蠐螬酶解液。

1.2.3 牛津杯法測抑菌活性 以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯法測定蠐螬酶解樣品抑菌活性［11］。使用LA復(fù)活菌株，LB培養(yǎng)，增值菌株。測定時，使用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至1.00×106CFU/mL。牛津杯直徑為6.00 mm，上樣量為150 μL。抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好［12］。

1.2.4 水解度的測定 實驗中水解度的測定按照 pH-stat法測定［13］。

1.2.5 單因素實驗 以抑菌效果（抑菌圈直徑）為指標(biāo)，在酶解溫度（37℃）恒定的條件下，研究以下4個因素對抗菌肽抑菌效果的影響，實驗重復(fù)3次。

加酶量的選擇：準(zhǔn)確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 ku/g添加胰蛋白酶，酶解時間為60 min，料液比為1∶20（g/mL），pH為8.00的條件下進(jìn)行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳酶用量。

酶解時間的選擇：準(zhǔn)確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，料液比為1∶20（ g/mL），pH為8的條件下進(jìn)行酶解，酶解時間分別為30、60、90、120、150 min。酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳酶解時間。

料液比的選擇：準(zhǔn)確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（ g/mL），酶解時間為90 min，pH為8的條件下進(jìn)行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳料液比。

pH的選擇：準(zhǔn)確稱取4份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，酶解時間為90 min，料液比為1∶20（ g/mL），pH分別為6.50、7.00、7.50、8.00、8.50的條件下進(jìn)行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳酶解pH。

1.2.6 正交法優(yōu)化胰蛋白酶制備抗菌肽條件 在酶解溫度（37℃）恒定的條件下，以加酶量、酶解時間、料液比和酶解pH為因素，分別設(shè)置4個水平進(jìn)行正交實驗［14-15］，優(yōu)化蠐螬抗菌肽制備條件（表1）。

表1 正交實驗各因素及水平

1.2.7 蠐螬抗菌肽穩(wěn)定性研究 （1）蠐螬抗菌肽酸堿度穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物1.0 mL，用0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L HCl 配制一系列pH值為 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00、13.00的溶液，取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實驗。對照實驗組為一系列不同pH值的溶液（不加抗菌肽樣品）。

（2）蠐螬抗菌肽的溫度穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物 1.00 mL，分別在 20、30、40、60、80、100℃條件下放置30 min，處理完成后放置至室溫，取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實驗。空白對照樣品為無菌蒸餾水。

（3）蠐螬抗菌肽鹽濃度穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物1.00 mL，用NaCl 配制一系列鹽濃度為 0、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00、120.00、140.00、160.00、180.00、200.00 mmol/L的溶液，取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實驗。對照樣品為一系列不同鹽濃度的溶液（不加抗菌肽樣品）。

（4）蠐螬抗菌肽水解穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物1.00 mL，根據(jù)上述配制方法比例配制模擬胃液和模擬腸液，分別在37℃中水浴處理30 min，以未處理的抗菌肽溶液和不添加胃/胰蛋白酶的人工胃/胰液為對照。取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 加酶量對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

圖1 加酶量對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

如圖1所示，當(dāng)加酶量在20.00～40.00 ku/g范圍增加時，蠐螬蛋白酶解產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果均增強(qiáng)，而當(dāng)加酶量大于40.00 ku/g時，酶解產(chǎn)物的抑菌效果變?nèi)?；加酶量大?0.00 ku/g時，酶解產(chǎn)物對兩種實驗菌幾乎沒有抑制效果。產(chǎn)生這種效果的可能原因是：加酶量增大時，胰蛋白酶對蠐螬蛋白的水解程度增強(qiáng)，將具有抗菌活性的多肽水解為分子量更小的多肽，從而使抗菌肽失去了抗菌活性［16］。

2.2 酶解時間對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

如圖2所示，當(dāng)酶解時間在30～90 min時，蠐螬酶解產(chǎn)物對實驗菌的抑制效果隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)酶解時間超過90 min時，酶解產(chǎn)物的抑菌效果明顯降低。實驗認(rèn)為，酶解時間為90 min時，酶解產(chǎn)物的抑制效果最好。這是由于長時間的酶解會將抗菌肽酶解為更小的分子，這些小分子肽是不具有抑菌活性的，因此酶解物的抑菌活性會在90 min以后開始下降。

圖2 酶解時間對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

2.3 料液比對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

由圖3可知，在實驗條件內(nèi)，酶解產(chǎn)物的抑菌效果隨著料液比的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)料液比為1∶20 （g/mL）時，胰蛋白酶水解物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

2.4 pH對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

由圖4可知，在實驗選取的pH范圍內(nèi)，當(dāng)pH小于8.00時，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑菌效果隨著pH的增大而增加，但當(dāng)pH為7.50和8.00時，酶解產(chǎn)物的抑制效果沒有明顯改變，當(dāng)pH大于8.00時，酶解產(chǎn)物的抑菌效果明顯下降，因此pH8.00為制備蠐螬抗菌肽的最佳pH值。

圖3 料液比對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

圖4 pH對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

2.5 胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白條件優(yōu)化

從表2可以看出，當(dāng)蠐螬蛋白酶解度為15.21%、15.61%和16.03%時，酶解液對兩種實驗菌的抑制效果差別不大，分別為9 mm和11 mm左右。當(dāng)酶解度較低如10.11%時，對實驗菌株的抑制效果不佳，可能是由于酶解程度不夠；當(dāng)酶解程度較高如20.01%時，對實驗菌株的抑制效果也不是最好，可能是由于酶解程度過高，抗菌肽片段太短造成的。通過極差分析可知，各因素對蠐螬蛋白酶解度的影響效果不一樣，各因素的顯著性依次為加酶量（A）>酶解時間（B）>pH（D）>料液比（C），胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白實驗中各實驗因素影響金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果的主次順序為：加酶量（A）＞酶解時間（B）＞料液比（C）＞ pH（D）。

表2 胰蛋白酶作用效果正交試驗L16

對大腸桿菌而言，胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的最優(yōu)水平組合為A2B1C2D3和A2B3C4D1即當(dāng)加酶量為40.00 ku/g、酶解時間為30 min、料液比為1∶15 （g/mL）、pH為8.00時，以及當(dāng)加酶量為40.00 ku/g、酶解時間為90 min、料液比為1∶25、pH為7.00時，酶解產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制效果最好，兩種酶解條件下，得到的酶解產(chǎn)物對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到最大，為9.00 mm（牛津杯直徑為6.00 mm），這種條件下獲得的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為10.50、10.60 mm。

對金黃色葡萄球菌而言，胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的最優(yōu)水平組合為A3B3C1D2，即當(dāng)加酶量為50.00 ku/g、酶解時間為90 min、料液比為1∶10 （g/mL）、pH為7.50時，酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為11.50 mm，而酶解產(chǎn)物對大腸桿菌的抑菌圈直徑為8.70 mm。這與Tsukiyama等［17］的研究結(jié)果基本一致，其原因可能與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)［18-19］。

為了制備具有更好抑制效果的蠐螬抗菌肽，將酶解脫脂蠐螬蛋白制備抗菌肽的各因素最優(yōu)水平組合確定為A3B3C1D2，即以加酶量為50.00 ku/g、酶解時間為90 min、料液比為1∶10（g/mL）、pH為7.50的條件酶解制備蠐螬抗菌肽。此時制備的酶解產(chǎn)物對E.coli和S.A的抑菌圈直徑分別為8.70、11.50 mm。

2.6 蠐螬抗菌肽的環(huán)境穩(wěn)定性

從圖5可以看出，蠐螬抗菌肽在pH為6.00的環(huán)境下，抑菌活性最好，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為11.80 mm，對大腸桿菌的抑菌圈為9.00 mm。當(dāng)pH增加到8時，抗菌肽的抑菌活性急劇下降。這與抗菌肽的蛋白特性有關(guān)，只有當(dāng)pH小于蛋白質(zhì)等電點時，抗菌肽分子的凈電荷才為正；而當(dāng)pH大于等電點時，抗菌肽分子凈電荷為零甚至為負(fù)，起不到抗菌的作用。

圖5 不同pH下蠐螬抗菌肽的抑菌活性

圖6表示的是蠐螬抗菌肽經(jīng)過不同溫度處理30 min后，抑菌活性隨溫度的變化情況，由于在不同的pH值條件下，蠐螬抗菌肽的抑菌活性會隨pH值的改變而改變，故在溫度穩(wěn)定性試驗時將pH調(diào)整到6.00。蠐螬抗菌肽在低于100℃的溫度處理下，仍然保持原有的抗菌活性，而當(dāng)處理溫度超過100℃時，抗菌肽的抑菌活性開始出現(xiàn)明顯下降。表明蠐螬抗菌肽能在高溫下保持抑菌活性，具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖6 不同溫度下蠐螬抗菌肽的抑菌活性

據(jù)報道，環(huán)境中的鹽濃度對抗菌肽的抗菌活性也有很大影響。從圖7可以看出，對于不同的細(xì)菌，鹽濃度對抗菌肽的抑菌活性影響不同。對金黃色葡萄球菌而言，當(dāng)鹽濃度超過140.00 mmol/L，抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯減弱，而且隨著鹽濃度的升高，抑制活性降低；當(dāng)鹽濃度大于80.00 mmol/L時，抗菌肽對大腸桿菌的抑制活性隨著鹽濃度的增加而明顯減弱，當(dāng)鹽濃度大于180.00 mmol/L時，抗菌肽對大腸桿菌基本沒有抑制效果。

圖7 鹽濃度對蠐螬抗菌肽抑菌活性的影響

由于抗菌肽的蛋白特性，實驗研究了蠐螬抗菌肽的耐胃蛋白酶和耐胰蛋白酶水解情況?？瞻讓φ毡硎镜氖窍擉┛咕脑谒芤褐袑Υ竽c桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。由圖8可知，蠐螬抗菌肽在不含胃蛋白酶的模擬胃液中，對實驗菌的生長抑制效果有所減弱，而在不加胰蛋白酶的模擬腸液中，抗菌肽對實驗菌的生長抑制效果不變。這是由于模擬胃/腸液中各因素綜合影響的結(jié)果?？咕慕?jīng)過胃蛋白酶處理之后，其對實驗菌的抑制效果完全消失；但經(jīng)過胰蛋白酶處理之后的抗菌肽對實驗菌的生長抑制效果略微減弱。表明蠐螬抗菌肽沒有抗胃蛋白酶水解的能力，但有較強(qiáng)的抗胰蛋白酶水解能力。

圖8 蠐螬抗菌肽的水解穩(wěn)定性

3 結(jié)論與討論

本研究通過酶解法制備出對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抗菌效果的蠐螬抗菌肽，優(yōu)化了胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的酶解條件，并研究了蠐螬抗菌肽的穩(wěn)定性，得出以下結(jié)論：

胰蛋白酶制備蠐螬抗菌肽的最適條件是加酶量為50.00 ku/g，酶解時間為90 min，料液比為1∶10 （g/mL），酶解pH為7.50。此時，蠐螬蛋白的水解度為15.21%，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制直徑分別為11.50 mm和8.70 mm。蠐螬抗菌肽的酸穩(wěn)定性比較好，但是不具有堿穩(wěn)定性，最佳pH為6.00；蠐螬抗菌肽具有較好的耐熱穩(wěn)定性；鹽濃度對不同的實驗菌，影響不同，對大腸桿菌而言，當(dāng)溶液中的鹽濃度大于80.00 mmol/L時，抗菌肽的抑制效果逐漸減弱；對金黃色葡萄球菌而言，當(dāng)溶液中鹽濃度大于180.00 mmol/L時，抗菌肽的抑制效果才開始出現(xiàn)明顯下降。蠐螬抗菌肽具有良好的耐胰蛋白酶水解穩(wěn)定性，但不具有耐胃蛋白酶水解穩(wěn)定性。

在本研究中，用胰蛋白酶制備得到蠐螬抗菌肽，實現(xiàn)了昆蟲資源的有效利用，但制備的蠐螬抗菌肽還只是初步的酶解混合物，抑菌效果還沒有達(dá)到抗生素的效果，后續(xù)工作將對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，以提高抗菌效果；另外，制備的抗菌肽雖然有良好的耐胰蛋白酶水解穩(wěn)定性，但不具有耐胃蛋白酶水解穩(wěn)定性，因此下一步工作將對抗菌肽進(jìn)行改性或者制成納米粒子以提高抗菌肽的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

［1］宋宏霞，曾名勇，劉尊英，等.抗菌肽的生物活性及其作用機(jī)理［J］.食品工業(yè)科技，2006（9）：185-188.

［2］孫龍.兩種鞘翅目昆蟲抗菌肽的分離純化與活性研究［D］.北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2012.

［3］孫恩濤，秦志輝.昆蟲抗菌肽研究進(jìn)展［J］.熱帶病與寄生蟲學(xué)，2006，4（1）：47-50.

［4］趙東紅，戴祝英，周開亞.昆蟲抗菌肽的功能、作用機(jī)理與分子生物學(xué)研究最新進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，1999，19（5）：14-18.

［5］劉麗霞.用于蠐螬防治的Bt土壤顆粒劑篩選［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［6］劉媛媛，曹蔚，張雅，等.蠐螬生物堿提取工藝及體內(nèi)外抗腫瘤活性研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2014 （2）：160-163.

［7］劉媛媛.蠐螬抗腫瘤活性化學(xué)成分的篩選與分離［D］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

［8］金莉莉.蠐螬抗腫瘤活性物質(zhì)的研究［D］.延吉：延邊大學(xué)，2006.

［9］Gordon Y Jerold，Romanowski Eric G，Mcdermott Alison M.A Review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs［J］.Current Eye Research，2005，30（7）：505-515.

［10］潘怡歐.昆蟲蛋白質(zhì)提取工藝的比較研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［11］佘之蘊(yùn)，黃寶瑩，劉海卿，等.牛津杯法測定食品添加劑對五種益生菌的抑菌活力［J］.食品工業(yè)，2016，37（1）：171-174.

［12］譚才鄧，朱美娟，杜淑霞，等.抑菌試驗中抑菌圈法的比較研究［J］.食品工業(yè)，2016，37（11）：122-125.

［13］尚田田，徐彥召，杭柏林，等.抗菌肽的抗菌機(jī)理及構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（9）：26-28.

［14］陶立國.人工設(shè)計多肽的結(jié)構(gòu)及其抗菌機(jī)理研究［D］.鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2016.

［15］Bulet P，Hetru C，Dimarcq J L，et al.Antimicrobial peptides in insects; structure and function［J］.Developmental & Comparative Immunology，1999，23（5）：329-344.

［16］Tsukiyama，R，et al.Antibacterial activity of licochalcone A against spore-forming bacteria［J］.Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2002.46（5）：1226-1230.

［17］問鑫，高鳳仙.抗菌肽殺菌機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國飼料，2013（24）：8-11.

［18］Miyoshi N，Saito T，Ohmura T，et al.Functional structure and antimicrobial activity of persulcatusin，an antimicrobial peptide from the hard tick Ixodes persulcatus［J］.Parasites &Vectors，2016，9（1）：85.