一株小葉榕抗菌內(nèi)生細(xì)菌的分離、篩選和鑒定

鄧雪萍，楊 博

（1.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，廣東 清遠(yuǎn) 511510；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006）

在健康植物組織內(nèi)部通常生存著一些微生物，但不會(huì)導(dǎo)致宿主植物有明顯的感染癥狀，稱為植物內(nèi)生菌［1］。有研究報(bào)道，植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子經(jīng)過表面消毒后，均能分離到內(nèi)生菌。植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生種類多樣的活性成分，經(jīng)證實(shí)，這些活性成分大多為抗腫瘤活性類［2-3］、抗菌類活性類［4-5］、抗糖尿病物質(zhì)類［2］、活性酶類［6-7］、抗氧化活性類［8］、殺蟲活性類［9-10］、促植物生長(zhǎng)類［11］等。因此，內(nèi)生菌在生物防治、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力非常大，國(guó)內(nèi)外對(duì)內(nèi)生菌的相關(guān)研究也越來越多［10］。

小葉榕（Ficus microcarpa L.f.）是常綠小喬木，樹冠傘形或圓形，葉色深綠，入藥主要用其葉。小葉榕的葉片含有多種藥用成份，如黃酮、三萜類、齊墩果酸、脂肪族化合物和甾體化合物等，經(jīng)證實(shí)，小葉榕水提取物和醇提取物有止咳平喘作用，對(duì)治療心血管疾病、抗炎、抑菌等方面都有顯著效果［12］。目前，還沒查詢到國(guó)內(nèi)外對(duì)小葉榕內(nèi)生菌的相關(guān)研究資料。本試驗(yàn)從清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)種植的小葉榕中分離純化內(nèi)生菌，并篩選抗菌活性菌株，鑒定到菌種，為尋找天然抗菌物質(zhì)提供有用資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物樣本：選取清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)種植的小葉榕的不同植株，采集健康的莖和葉片。

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB），高氏一號(hào)培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基（1%葡萄糖、2%酵母粉、0.3% 磷酸氫二鉀、0.05%氯化鈉，pH 7.0）。

篩選指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger），均由清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用微生物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小葉榕內(nèi)生菌的分離純化 用無菌剪刀剪取植株頂端健康的莖段和嫩葉，用干凈的保鮮袋裝好，立即進(jìn)行下述處理（如不能立即處理，則將樣本置于4℃冰箱中1周內(nèi)處理）：莖段和葉片均采用75%酒精-0.1%升汞法表面消毒，印跡法和最終洗滌水法相結(jié)合檢驗(yàn)消毒效果。分離內(nèi)生菌時(shí)，莖段采用組織塊法，葉片采用組織勻漿法［13］，具體操作見圖1～圖3，所有操作均為無菌操作。對(duì)照平板7 d內(nèi)有菌生長(zhǎng)或分離平板在7 d內(nèi)無菌生長(zhǎng)，均判定表面消毒無效；對(duì)照平板7 d內(nèi)無菌生長(zhǎng)且分離平板在7 d內(nèi)有菌生長(zhǎng)，則判定表面消毒有效。逐日觀察對(duì)照平板和分離平板，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有菌長(zhǎng)出，及時(shí)分離純化到對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，28（±1）℃（內(nèi)生真菌）或36（±1）℃（內(nèi)生細(xì)菌）培養(yǎng)3～7 d。重復(fù)以上步驟，直至分離到純培養(yǎng)物。

圖1 莖段內(nèi)生菌分離步驟

圖2 葉片內(nèi)生菌分離步驟

圖3 對(duì)照平板制備流程

1.2.2 抗菌活性內(nèi)生菌的篩選 發(fā)酵濾液的制備：內(nèi)生菌解凍復(fù)蘇后，取5環(huán)到5 mL無菌生理鹽水制備菌懸液，按1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在34（±1）℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm的無菌微孔濾膜過濾除菌后得發(fā)酵濾液，用作抑菌試驗(yàn)［13-15］，3次重復(fù)（本試驗(yàn)只對(duì)分離得到的兩株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行抗菌活性篩選）。

杯碟法檢測(cè)發(fā)酵濾液抗細(xì)菌、抗酵母菌活性：將指示菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌接種于NA平板，36（±1）℃培養(yǎng)24 h；白色念珠菌接種于PDA平板，28（±1）℃培養(yǎng)48 h。選取單菌落混懸于滅菌生理鹽水，使指示菌液最終濁度與0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管相同，此時(shí)菌懸液中菌數(shù)大概為1.5×108CFU/mL［13，16］。在平板上均勻涂布指示菌液，5 min后用無菌鑷子夾取無菌牛津杯放入平板上，每塊平板可放3～4個(gè)牛津杯，牛津杯之間的距離相等。牛津杯內(nèi)加入200 μL發(fā)酵濾液，蓋上皿蓋，用無菌生理鹽水做對(duì)照。以上均在28（±1）℃暗處培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)完畢，取出牛津杯，測(cè)量抑菌圈直徑。

菌落生長(zhǎng)速率法檢測(cè)發(fā)酵濾液抗絲狀真菌活性：黑曲霉為指示菌，將1 mL發(fā)酵濾液加入到無菌培養(yǎng)皿中，倒入9 mL已冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基，充分搖勻，冷卻后，將直徑6 mm、28（±1）℃培養(yǎng)48 h的黑曲霉菌塊接種于該平板中央，蓋上皿蓋，以不加發(fā)酵濾液的10 mL PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，試驗(yàn)平板和對(duì)照平板均在28（±1）℃暗處培養(yǎng)3～5 d，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，計(jì)算內(nèi)生菌發(fā)酵濾液對(duì)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率（%）［17-18］。

1.2.3 抗菌活性內(nèi)生菌的鑒定 培養(yǎng)特征、菌體形態(tài)觀察及生理生化特性試驗(yàn)：本試驗(yàn)僅對(duì)分離得到的抗菌活性內(nèi)生細(xì)菌QYPT-B01進(jìn)行鑒定。將內(nèi)生菌株接種到NA斜面、NA平板、NB肉湯，34（±1）℃培養(yǎng)2～5 d，觀察內(nèi)生菌的培養(yǎng)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和生化反應(yīng)，按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［19］中的方法進(jìn)行操作和鑒定：抑菌圈直徑0～5 mm 表示無抑制作用，6～15 mm 表示弱抑制作用，＞15 mm 表示強(qiáng)抑制作用。

16S rDNA基因序列測(cè)定：將內(nèi)生細(xì)菌菌株接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯，34（±1）℃下160 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，12 000 r/min離心5 min，在菌體沉淀中加入50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）800 μL和32 μL溶菌酶，使溶菌酶最終濃度為2～4 mg/mL，振蕩均勻；37（±1）℃保溫30～60 min至菌液呈牛乳狀；加入65 μL 25%SDS，顛倒混勻，50～60℃水浴10 min至溶液完全清亮；加入200～400 μL氯仿-異戊醇（24∶1）溶液，充分振蕩混勻，冰上放置10 min；12 000 r/min條件下離心10 min后，取上清液；加入0.7～1倍體積異丙醇，顛倒混勻，將白色絮狀沉淀挑出至70%乙醇中洗滌兩次，吹干，溶于適量的超純水中，振蕩溶解，置于－20℃冰箱中。按上述方法提取基因組DNA后，以其為模板，設(shè)計(jì)引物為 P16sF1：5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAGAACGAACGCT-3′；P16sB1：5′-TACGG CTACCTTGTTACGACTCACCCC-3′。PCR 的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；48℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切割目標(biāo)條帶，使用Roche Applied Science試劑盒純化電泳產(chǎn)物。PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的16S rDNA片段經(jīng)純化后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。利用NCBI網(wǎng)站中的Blast工具（ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），將QYPT-B01菌株的16S rDNA序列與Genbank中已知細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比較，尋找與目的基因序列同源性最高的己知分類地位的菌種，并得到同源性相似百分比。Matsulci［20］研究認(rèn)為，凡是16S rDNA可變區(qū)序列同源性大于97.5%便可認(rèn)為是同一個(gè)種，所以本試驗(yàn)以同源性大于97.5%為菌種的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步利用MGTA7.0.26軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉榕內(nèi)生菌分離純化結(jié)果

從小葉榕植物樣本中分離得到7株絲狀真菌和2株細(xì)菌。將分離得到的9株內(nèi)生菌進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有一株絲狀真菌不能生長(zhǎng)（表1）。

表1 小葉榕內(nèi)生菌的分離純化結(jié)果

2.2 抗菌活性內(nèi)生菌篩選結(jié)果

分離得到的一株小葉榕內(nèi)生細(xì)菌（命名為QYPT-B01）發(fā)酵濾液對(duì)革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌和大腸埃希菌有較強(qiáng)的抑制作用（圖4，封三；表2），其中對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑達(dá)23.28（±0.286）mm，對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有較弱的抑制作用，而對(duì)枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。QYPT-B01菌株發(fā)酵濾液對(duì)白色念珠菌沒有抑制作用，對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用（圖5，封三；表3），培養(yǎng)3 d后該菌株發(fā)酵濾液對(duì)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)77.25（±0.212）%，培養(yǎng)5 d后抑菌率達(dá)82.39（±0.140）%。在培養(yǎng)過程中，對(duì)照平板黑曲霉菌落厚、菌絲多且強(qiáng)壯、形成大量黑色孢子，而試驗(yàn)平板菌落薄、菌絲少且纖細(xì)、沒有孢子形成，培養(yǎng)4 d后菌落大小不再有變化。試驗(yàn)分離到的另一株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)5種指示菌均無抑制作用。

表2 QYPT-B01菌株發(fā)酵濾液對(duì)4種指示菌的抑菌效果

表3 QYPT-B01菌株發(fā)酵濾液對(duì)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

2.3 抗菌活性內(nèi)生菌鑒定結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)特征、菌體形態(tài)觀察及生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果 QYPT-B01菌株在34（±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，在NA斜面上其菌苔呈灰白色，邊緣不規(guī)則，向四周擴(kuò)展，表面有皺褶、干燥、不透明；在NA平板上其菌落灰白色，較大，扁平，邊緣不規(guī)則，菌落向四周擴(kuò)展明顯，呈樹根狀，表面有皺褶、干燥、不透明；在NB肉湯液面形成一層灰白色的菌膜，培養(yǎng)液仍澄清。革蘭氏染色呈陽性，顯微鏡下觀察呈直桿狀，芽孢近中生，孢子囊不膨大。菌株的主要生理生化特征見表4。結(jié)合培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察和生理生化特性，初步鑒定QYPT-B01菌株為芽孢桿菌屬。

2.3.2 16S rDNA測(cè)序結(jié)果 QYPT0-B1菌株的16S rDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分析，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，QYPT-B01菌株的16S rDNA擴(kuò)增片斷長(zhǎng)約1.5 kb，細(xì)菌16S rDNA的長(zhǎng)度一般為1.550（±0.200）kp。將PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到全長(zhǎng)為1.426 kp的16S rDNA序列。該序列與GenBank中的細(xì)菌16S rDNA序列比較，獲得同源序列為芽孢桿菌屬（Bacillus）的16S rDNA序列，其相似性達(dá)到98%。QYPT-B01菌株的16S rDNA序列與66株枯草芽孢桿菌16S rDNA序列的相似性也達(dá)98%（表5）?；赒YPT-B01菌株和芽孢桿菌屬的10個(gè)模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA7.0.26 軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值（Bootstrap）以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹的置信度。從建立的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）可以看出，QYPTB01和枯草芽孢桿菌的進(jìn)化距離最靠近。結(jié)合培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察和生理生化特性，最終鑒定內(nèi)生細(xì)菌QYPT-B01為枯草芽孢桿菌。

表4 內(nèi)生細(xì)菌QYPT-B01菌株與枯草芽孢桿菌主要生理生化特征比較

圖6 QYPT-B01菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

從小葉榕植物樣本中分離得到7株絲狀真菌和2株細(xì)菌，將分離得到的9株內(nèi)生菌進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有一株絲狀真菌不能生長(zhǎng)。可能是由于某些內(nèi)生菌的生長(zhǎng)需要依賴宿主植物提供的環(huán)境條件，所以在普通培養(yǎng)基上難以生長(zhǎng)，需進(jìn)一步研究適合其生長(zhǎng)的植物體外培養(yǎng)條件。

對(duì)分離得到的兩株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)QYPT-B01菌株發(fā)酵培養(yǎng)72 h，其發(fā)酵濾液對(duì)銅綠假單胞菌和大腸埃希菌有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌試驗(yàn)平板培養(yǎng)48 h，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑達(dá)23.28（±0.286）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱。QYPT-B01菌株發(fā)酵濾液對(duì)黑曲霉菌絲的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，試驗(yàn)平板培養(yǎng)5 d后抑菌率達(dá)82.39（±0.140）%。綜上所述，小葉榕QYPT-B01菌株能產(chǎn)生主要針對(duì)革蘭氏陰性菌和絲狀真菌的抗菌活性物質(zhì)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)抗菌能力較強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌QYPT-B01菌株進(jìn)行了培養(yǎng)特征和菌體形態(tài)觀察、生理生化特性試驗(yàn)、16S rDNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最終鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表5 QYPT-B01菌株與6株枯草芽孢桿菌的16S rRNA基因同源性比較

圖7 QYPT-B01菌株在Bacillus屬中的系統(tǒng)發(fā)育地位

小葉榕由于易生長(zhǎng)，遮陰效果好，所以分布十分廣泛，也是街道、公園、綠地、公路、企事業(yè)單位常用的園林景觀植物。但是受氣候、栽培因素等影響，小葉榕極易發(fā)生病蟲害，如槐尺蛾、刺蛾、灰白蠶蛾、榕木虱、榕管薊馬、葉斑病、煤污病、炭疽病等［21］。傳統(tǒng)的治療方法有合理密植、科學(xué)修剪、化學(xué)藥劑噴注和生物防治等方法，目前主要是用化學(xué)藥劑噴霧法［22］。從保護(hù)生態(tài)環(huán)境和可持續(xù)發(fā)展的角度看，生物防治是最好的防治方法，對(duì)人、畜、植物均安全，主要包括保護(hù)有益天敵和使用生物農(nóng)藥兩種措施。小葉榕內(nèi)生菌QYPT-B01是枯草芽孢桿菌，具有防治植物病害的作用，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)成功研制出一批枯草芽孢桿菌菌劑［23-24］。國(guó)內(nèi)已開發(fā)并投入生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌商品制劑有麥豐寧、百抗、紋曲寧、依天得、亞寶等。QYPT-B01內(nèi)生菌能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，今后可進(jìn)一步研究該活性代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌的拮抗作用，以開發(fā)具生防作用的微生物菌劑。植物與動(dòng)物和人類一樣，均屬于真核系統(tǒng)，而內(nèi)生菌能寄生在植物體內(nèi)，說明內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)毒性較低或無毒，否則宿主組織會(huì)受損傷甚至死亡，可見，植物本身已對(duì)活性成分進(jìn)行了初篩，利用QYPT-B01內(nèi)生菌作為生防菌劑的來源優(yōu)勢(shì)明顯，具有良好的應(yīng)用前景。

綜上可知，今后可進(jìn)一步研究QYPT-B01菌株發(fā)酵液中活性物質(zhì)的組分及其對(duì)植物病原菌的拮抗作用，以進(jìn)一步開發(fā)生物防治菌劑。

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