肝素調(diào)控豬嗜中性粒細(xì)胞對精子的趨化和吞噬作用

李井春，李 琦，韓淑敏，張 帆，孫思怡，李雁冰，魏國生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

豬在配種和人工授精 （artificial insemination，AI）后，有45%左右的精子通過子宮頸回流而喪失［1-2］。此外，大部分精子由于精液誘導(dǎo)的子宮局部免疫反應(yīng)而被子宮內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞（PMNs）清除［3］。雖然T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和PMNs是健康非懷孕豬子宮上皮中的主要白細(xì)胞類型，但在發(fā)情期和發(fā)情間期只有PMNs數(shù)量顯著增加［4］。由人工授精引發(fā)的大量PMNs進(jìn)入子宮腔［5］，AI后24 h內(nèi)將生殖道精子數(shù)減少至1%［6］。目前，調(diào)控PMNs向子宮腔快速趨化移動和吞噬活性的機(jī)制還不清楚。

如何調(diào)控PMNs的快速趨化及對精子的吞噬，已成為人工授精技術(shù)研究的熱點之一。有研究報道，咖啡因在一定程度上能夠有效抑制PMNs對精子的趨化和吞噬作用［7］。此外，通常用作抗凝血劑的肝素可以刺激公牛精子獲能，并且被證實可以抑制兔PMNs的吞噬作用［8-10］。然而，關(guān)于肝素對豬PMNs吞噬作用和公豬精子趨化性影響的研究鮮有報道。

該研究主要應(yīng)用趨化小室檢測豬嗜中性粒細(xì)胞對精子的趨化性，利用共培養(yǎng)方法檢測PMNs對精子的吞噬性，以探究不同濃度的肝素對豬PMNs趨化和吞噬活性的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和培養(yǎng)液

Histopaque-1077、肝素 （heparin）等均購自Sigma公司。采用TL-HEPES-PVA培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗 （由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物繁殖學(xué)實驗室提供的改良配方配制）。

1.2 豬PMNs的準(zhǔn)備

采用前腔靜脈采血法，采集健康大白母豬（由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場提供）血液10～20 mL，經(jīng)檸檬酸鹽抗凝處理后于4℃條件下保存，并在2 h內(nèi)運回實驗室；將血液在1 000×g、4℃條件下離心10 min，收集血漿和血細(xì)胞之間的白色PMNs層，置于15 mL干燥無菌離心管中，重復(fù)上述操作3次。收集含有PMNs的混合液用D-PBS稀釋，并在4℃條件下以320×g離心10 min，取上清液用4 mL的PBS稀釋，待用。將稀釋的混合液小心放到預(yù)先制備的Histopaque-1077（3 mL）液面上并離心（400×g、30 min、25 ℃）。離心后，將上清液（主要包括巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）去除，剩下的是PMNs和血細(xì)胞，用紅細(xì)胞溶解液 （150 mmol/L NH4Cl、12 mmol/L KHCO3、0.13 mmol/L EDTA）溶解紅細(xì)胞，直至將所有的紅細(xì)胞溶解，剩下PMNs為止，最后用PBS洗滌3次，置于4℃冰箱中保存，備用。

1.3 精子的準(zhǔn)備

通過手握法收集4頭公豬（長白公豬）精液中富含精子的部分 （30～50 mL）。精液用改良的Modena溶液稀釋5倍，在收集后2 h內(nèi)將稀釋后的樣品運送到實驗室。 通過離心（750×g，3 min）洗滌1次后，將精子以1×107細(xì)胞/mL的濃度重懸于TL-HEPES-PVA溶液中。分別利用LIVE/DEAD精子活力試劑盒和常規(guī)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)精子的活率和活力分別為（91.5±1.8）%和（81.5±2.4）%，精子質(zhì)量符合后續(xù)試驗要求。

1.4 血清的制備

當(dāng)采取黃體期的豬靜脈血制備PMNs時，分別收集4頭母豬的血漿，并在4℃下以1 000×g離心10 min?；厥丈锨逖宀⒃?20℃下儲存直至使用。在56℃下熱處理30 min使血清（5 mL）試樣滅活，然后在-20℃下貯存，備用。

1.5 PMNs的吞噬試驗

根據(jù)Matthijs等［11］報道的方法做部分調(diào)整。取四孔培養(yǎng)皿，加入PMNs以及含有不同濃度肝素（0、100、500、1 000 μg/mL） 的 TL-HEPES-PVA 培養(yǎng)液80 μL，之后培養(yǎng)皿中放入預(yù)先準(zhǔn)備好的精子20 μL，與 PMNs液混合，PMNs和精子的最終濃度分別為 8×106細(xì)胞/mL和 2×106細(xì)胞/mL， 最后置于38.5℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。向培養(yǎng)后的混合液中滴加100 μL的肝素充分混合，用移液器吸取少量樣本制片，在400倍顯微鏡下觀察PMNs的吞噬率 （每個樣本至少觀察200個以上的PMNs），最后計算PMNs對精子的吞噬率。

1.6 PMNs的趨化性測定

利用Blind well chamber進(jìn)行PMNs的趨化性試驗［12］。根據(jù)試驗設(shè)計，在趨化小室的下層小室放入待測的樣品（含精子、卵黃和豬精漿等）100 μL，之后放入膜孔徑8 μm的膜（市售），然后安裝趨化小室的上層并在上層添加100 μL含1×107細(xì)胞/mL PMNs的TL-HEPES-PVA培養(yǎng)液，最后將整個趨化小室放到38.5℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min，培養(yǎng)完成后，取出趨化小室，棄去上層小室中的PMNs液，將孔徑8 μm的膜取出，用PBS洗滌除去附著于膜表面的PMNs，置于載玻片上，自然干燥，然后用固定液固定15 min，風(fēng)干后用吉姆薩染液染色20 min，然后用水漂洗至無殘留液，再用固定液固定制片封存，待鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的肝素對豬PMNs吞噬性的影響

從圖1可以看出，在血清存在的條件下，添加不同濃度的肝素可以降低血清刺激PMNs對精子的吞噬活性（P＜0.01）。隨著肝素濃度的增加，PMNs的吞噬率呈下降趨勢，當(dāng)肝素濃度為1 000 μg/mL時，豬PMNs對精子的吞噬率最低。但是，在培養(yǎng)液中添加 100 μg/mL 和 500 μg/mL 肝素時，PMNs對精子的吞噬活性在二者之間沒有顯著差異 （P＞0.05）。

圖1 不同濃度的肝素對豬PMNs吞噬精子活性的影響

2.2 不同濃度的肝素對豬PMNs趨化性的影響

從表1可以看出，當(dāng)在培養(yǎng)室的上部添加100、500、1 000 μg/mL 的肝素進(jìn)行趨化活性檢測時，隨著肝素濃度的增加，PMNs趨化性指數(shù)呈下降趨勢（P＜0.05），而在添加量為 100 μg/mL 和 500 μg/mL肝素時沒有顯著差異（P＞0.05）。添加1 000 μg/mL肝素時，PMNs的趨化性指數(shù)最低 （P＜0.05）。

表1 不同濃度的肝素對豬PMNs趨化性的影響

3 討論

研究表明，通過添加新鮮血清可顯著刺激PMNs的趨化活性，但熱滅活血清不會增加PMNs的趨化活性，因此，該研究利用新鮮血漿作為激活豬PMNs活性的激活劑。肝素在采集血液白細(xì)胞時通常用作抗凝血劑。肝素抑制PMNs吞噬作用的機(jī)制是肝素與質(zhì)膜結(jié)合并屏蔽了配體，包括與PMNs結(jié)合的配體。在該研究中，肝素不僅顯著降低了豬PMNs的吞噬活性，而且顯著降低了PMNs的趨化活性，因此，似乎肝素抑制了PMNs的凝集與結(jié)合，也改變了PMNs的功能，從而降低其了遷移能力。肝素也被用做在體外誘導(dǎo)精子獲能［8］。超活化是精子獲能的標(biāo)志［13-14］。非?；钴S的精子可能難以被PMNs吞噬。然而，在該研究中，即使肝素僅在培養(yǎng)室的上部（含有PMNs），PMNs的趨化活性也顯著降低。此外，當(dāng)精子與PMNs共培養(yǎng)時，肝素對吞噬精子的PMNs發(fā)生率的影響較大，尤其是當(dāng)肝素濃度為1 000 μg/mL時，PMNs對精子的吞噬率最低，因此，筆者推測吞噬精子的PMNs百分比下降，不是由于肝素誘導(dǎo)的獲能引起的活化精子增加，而是由于肝素使得PMNs的活性降低。

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