Sotos綜合征2例報(bào)道及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

陸勇剛， 胥雨菲， 姚如恩， 李 牛， 郁婷婷， 王秀敏， 沈亦平， 王 劍

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)遺傳科分子診斷實(shí)驗(yàn)室，上海 200127；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌遺傳代謝科，上海 200127；3.美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬波士頓兒童醫(yī)院基因診斷實(shí)驗(yàn)室，美國 波士頓 02115）

Sotos綜合征是一類先天性過度生長疾病，臨床主要表現(xiàn)為典型的特殊面容：巨顱，前額頭突出，眼瞼裂下斜，下頜尖長，前發(fā)際線高，頭顱巨大；青少年期生長過快：身高和頭圍明顯增加，大于同地區(qū)、同性別、同齡兒童的第97百分位數(shù)；神經(jīng)心理發(fā)育遲緩：語言學(xué)習(xí)障礙及智力低下；骨齡提前[1]。目前認(rèn)為該疾病與核受體結(jié)合SET域蛋白（nuclear receptor-binding SET-domain-containing protein 1，NSD1）基因異常有關(guān)，其定位于5號(hào)染色體q35位置，于2002年在1例新生平衡易位（5；8）（q35；q24.1）患者中成功分離出該基因，并與小鼠NSD1基因具有同源性[2-3]。NSD1基因由23個(gè)外顯子組成，開放閱讀框從第2個(gè)外顯子開始，編碼1個(gè)由2 696個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。NSD1基因缺失或其基因內(nèi)突變而導(dǎo)致的單倍劑量不足是Sotos綜合征的主要致病原因，約有70%～90%的患者可以檢測(cè)出NSD1基因的異常，包括無義突變、錯(cuò)義突變、移碼突變、剪接突變和大片段缺失等[4-5]。

截至2016年，中國內(nèi)地可以檢索到并進(jìn)行明確基因診斷的Sotos綜合征共3例，且都為5q35缺失型患者[6-7]。但中國香港的病例研究發(fā)現(xiàn)，中國香港人群中Sotos綜合征NSD1基因突變檢出率為72%，其中只有8%的患者是5q35缺失型，其余64%均為基因內(nèi)突變型[8]，兩者區(qū)別較大。我們報(bào)道的2例Sotos綜合征病例中，1例為5q35缺失型，另1例為基因內(nèi)突變型，這是目前中國內(nèi)地首例無義突變病例，該位點(diǎn)突變未見于中國香港人群報(bào)道中。為此，我們通過復(fù)習(xí)文獻(xiàn)并結(jié)合這2例病例，探討不同基因型與表型的相關(guān)性，以期提高臨床診斷率。

1 材料和方法

1.1 病例資料

病例1：男性，8個(gè)月，因“發(fā)育落后”于2015年7月16日來上海交通大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心就診。足月剖宮產(chǎn)，出身時(shí)體重4.1 kg，皮膚輕度黃染。就診時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育落后于同齡兒，反應(yīng)欠靈敏，獨(dú)坐不穩(wěn)。體格檢查：頭圍48.5 cm（＞3s），頭顱大，前囟（2×2）cm，舟狀頭，前額突出，前頂頭部毛發(fā)稀疏，眼距寬，眼裂下斜，雙手、雙足大，右手食指屈曲畸形，皮膚粗糙，四肢肌張力可[圖1（a）]。頭顱磁共振顯示胼胝體發(fā)育不良，腦室偏大，腦電圖正常。心臟超聲示動(dòng)脈導(dǎo)管未閉。腎臟B超未見明顯異常。Gesell評(píng)分提示有輕度智力低下。臨床擬診為Sotos綜合征。隨訪至2歲，身高95 cm，體重13 kg，語言表達(dá)少，喜歡獨(dú)處，至今不會(huì)獨(dú)走。

病例2：男性，3歲，因“發(fā)育落后”于2016年3月30日來上海交通大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心就診。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育落后，17個(gè)月會(huì)走路，2歲能叫媽媽，目前語言表達(dá)少。有癲癇發(fā)作史，曾注射流感疫苗出現(xiàn)抽搐，2歲半時(shí)發(fā)生低熱抽搐，10 d前出現(xiàn)無熱抽搐，發(fā)作后體溫39 ℃。體格檢查：身高101 cm，體重17 kg，頭圍52.8 cm（＞2s），頭顱大，臉長，前額突出，下頜尖長，前頂頭部毛發(fā)稀疏，眼距寬，眼裂下斜[圖2（a）]。頭顱磁共振顯示腦室擴(kuò)張，腦水腫可能。心臟超聲示動(dòng)脈導(dǎo)管未閉。腎臟B超未見明顯異常。Gesell評(píng)分提示有輕度智力落后，特別語言能和應(yīng)人能較差，有自閉癥傾向。臨床擬診為Sotos綜合征。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 樣本留取方法 經(jīng)上述患兒監(jiān)護(hù)人知情同意，采患兒外周靜脈血2 mL，采用QIAamp DNA Blood Mini試劑盒（德國Qiagen GmbH公司）提取基因組DNA，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司）定量后，- 20 ℃保存。

1.2.2 基因芯片 取250 ng DNA，使用限制性內(nèi)切酶NspⅠ進(jìn)行酶切消化。采用CytoScan HD Array試劑盒（美國Affymetrix公司）進(jìn)行基因芯片雜交，嚴(yán)格按試劑說明書操作。應(yīng)用Chromosome Analysis Suite（ChAS 3.1）軟件（美國Affymetrix公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 高通量測(cè)序 取3 μg DNA，使用Covarias M220核酸剪切儀（美國Covaris公司）將DNA打斷成150～200 bp的片段。根據(jù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，采用SureSelectXT Human All Exon試劑盒（美國Agilent Technologies公司）進(jìn)行文庫構(gòu)建。構(gòu)建的文庫在Illumina cBot簇生成系統(tǒng)（美國Illumina公司）上進(jìn)行橋式擴(kuò)增，之后在HiSeq 3000測(cè)序系統(tǒng)（美國Illumina公司）上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量評(píng)估后，使用NextGENe v 2.4.1軟件（美國SoftGenetics公司）將讀序列與參考基因組（Human 37.3，SNP135；http：//hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/snp135Mask/）進(jìn)行比對(duì)以及SNVs和Indels的標(biāo)注，結(jié)果轉(zhuǎn)換成VCF格式文件上傳至Ingenuity Variant Analysis平臺(tái)（美國Qiagen GmbH公司），對(duì)SNVs和Indels進(jìn)行注釋和過濾篩選。如發(fā)現(xiàn)有候選致病性變異，再用一代測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 芯片分析結(jié)果

病例1患兒采用全基因組芯片分析，發(fā)現(xiàn)在5號(hào)染色體q35.2-35.3位置有1個(gè)雜合性缺失，基因位置為chr5：175，570，677～177，477，711，大小為1 907 kb[圖1（b）]。NSD1基因位于5號(hào)染色體177，133，025～177，300，215，該區(qū)域位于缺失片段內(nèi)，提示NSD1基因整個(gè)丟失。

2.2 基因測(cè)序結(jié)果

病例2患兒通過高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)NSD1基因存在1個(gè)雜合無義突變c.1262G＞A， p.Trp421*，并經(jīng)一代測(cè)序驗(yàn)證（圖2）。父母未發(fā)現(xiàn)該基因型變異，因此患兒為新生突變（De novo）。該基因變異位點(diǎn)位于chr5：177，209，661，在第5個(gè)外顯子上，密碼子TGG改變形成1個(gè)終止密碼子TAG，蛋白質(zhì)翻譯在第421位的色氨酸前提前終止。

2.3 文獻(xiàn)閱讀分析

通過閱讀文獻(xiàn)[6-7]并結(jié)合本研究的這2例病例，分析了中國內(nèi)地5例Sotos綜合征的臨床表現(xiàn)和NSD1基因突變的類型。具體結(jié)果見表1。

圖1 病例1患兒特殊面容及基因芯片結(jié)果

圖2 病例2患兒特殊面容及基因測(cè)序結(jié)果

表1 中國內(nèi)地5例Sotos綜合征病例的臨床表現(xiàn)和NSD1基因突變類型

3 討論

中國內(nèi)地這5例Sotos綜合征病例大多表現(xiàn)為生長發(fā)育過快，盡管其中1例出生時(shí)過度生長不明顯，但隨訪至45個(gè)月時(shí)身高＞同齡兒童平均值的3s，其中3例具有典型的特殊面容，前額突出、前額毛發(fā)稀少、眼距寬及眼裂下斜。另2例為新生兒，可能表現(xiàn)不明顯。5例病例的共同特征是生長發(fā)育過快但表現(xiàn)不一，頭顱巨大（1例出生時(shí)不明顯），具有不同程度的智力低下，尤其語言發(fā)育都比較落后，并且中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有影像學(xué)的改變，這些表現(xiàn)完全符合Sotos綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。其他個(gè)別的特征還包括骨齡超前、新生兒黃疸、新生兒喂養(yǎng)困難、心血管系統(tǒng)異常、泌尿系統(tǒng)畸形、驚厥、手足畸形等，這些都屬于Sotos綜合征的次要表現(xiàn)[10]。在成人中，該疾病最常見的癥狀依次為學(xué)習(xí)困難、脊柱側(cè)凸、眼科疾病、精神行為失常和大腦影像異常[11]。

這5例病例均檢測(cè)出了NSD1基因異常，其中4例為5q35缺失型，另1例為基因內(nèi)突變型。但中國香港地區(qū)患者的5q35缺失型檢出率僅為12%（3/26），多數(shù)為基因內(nèi)突變型，檢出率達(dá)88%（23/26）[8]。而在日本患者的研究中，5q35缺失型的比例高達(dá)82%（49/60），基因內(nèi)突變型的比例只有18%（11/60）[12]，兩者差異明顯，這可能跟種族基因結(jié)構(gòu)相關(guān)。在日本患者中，其NSD1基因兩端側(cè)翼存在低拷貝重復(fù)，減數(shù)分裂時(shí)會(huì)發(fā)生非等位同源重組，導(dǎo)致NSD1基因缺失，具有相同的斷裂位點(diǎn)[12]。由于樣本量過小，我們無從推測(cè)中國內(nèi)地的基因突變譜，但鑒于中國香港地區(qū)的基因型分布，中國內(nèi)地的基因內(nèi)突變型比例可能偏低，這可能跟基因的檢測(cè)技術(shù)相關(guān)。目前，中國內(nèi)地醫(yī)院臨床上基因檢測(cè)主要采用芯片、多重連接探針擴(kuò)增等技術(shù)，高通量測(cè)序技術(shù)還沒有大量普及，因此無法檢測(cè)出基因內(nèi)突變型的患者，漏檢的可能性很高。

NSD1蛋白包含許多保守功能域，包括2個(gè)PWWP，4個(gè)PHD，1個(gè)相鄰的AWS（Pre-SET）、SET和Post-SET結(jié)構(gòu)域（www.uniprot.org），其中PHD和PWWP是一類解讀組蛋白甲基化狀態(tài)的效應(yīng)分子，根據(jù)組蛋白修飾狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能或招募其他蛋白共同產(chǎn)生效應(yīng)[13-14]。另3個(gè)SET相關(guān)功能域具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，主要對(duì)核小體組蛋白H3的第36位賴氨酸（H3K36）進(jìn)行甲基化修飾[15-16]。在4例5q35缺失型患兒中有2例NSD1基因完全缺失，1例明確第5～18外顯子缺失，另1例由于技術(shù)限制，只知道染色體長臂NSD1基因區(qū)域缺失，但不清楚具體位點(diǎn)。還有1例無義突變患兒的蛋白翻譯終止在第420位氨基酸，只保留了1個(gè)PWWPⅠ功能域，其他功能域缺失。顯而易見，這5例病例的NSD1基因結(jié)構(gòu)的雜合性缺失或改變導(dǎo)致一半的NSD1蛋白無法有效表達(dá)或蛋白結(jié)構(gòu)遭破壞而無相應(yīng)的功能，出現(xiàn)了Sotos綜合征的表現(xiàn)，是1個(gè)劑量敏感型基因。目前認(rèn)為NSD1是1個(gè)輔助轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄激活的雙向調(diào)控作用，對(duì)胚胎早期及出生后生長發(fā)育起重要作用[17]。Sotos綜合征的這種既身體生長過快又精神發(fā)育遲緩的矛盾表現(xiàn)很可能與NSD1蛋白的雙向調(diào)控異常相關(guān)。另外，5例病例都有腦影像異常、智力落后、語言學(xué)習(xí)障礙，提示NSD1對(duì)大腦發(fā)育有重要影響。

另外，有研究認(rèn)為Sotos綜合征臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度與基因結(jié)構(gòu)的破壞程度呈正相關(guān)[10，18-20]：5q35缺失型患者的臨床癥狀最嚴(yán)重，出現(xiàn)嚴(yán)重智力落后、心血管疾病、泌尿系統(tǒng)畸形和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的頻率更高，還可能跟高胰島素血癥性低血糖癥和腫瘤相關(guān)，但過度生長表現(xiàn)較輕微；截短突變（無義突變、剪接突變和移碼突變）次之，僅表現(xiàn)輕度智力低下，其他系統(tǒng)異常比例較低，然而過度生長表現(xiàn)最嚴(yán)重；錯(cuò)義突變患者臨床表現(xiàn)最輕微，智力可正常，也無其他系統(tǒng)病變，只有過度生長表現(xiàn)，并且都發(fā)生在蛋白功能域中。但本研究的1例患兒是5q35缺失型，另1例截短突變也可能因?yàn)榘l(fā)生在基因頭部，導(dǎo)致大部分蛋白功能域缺失，表型與5q35缺失型患兒相差無幾，而且這2類基因型樣本量過少，并不足以區(qū)分截短突變和5q35缺失型的臨床特征。到目前為止，我們還未檢測(cè)到錯(cuò)義突變的患者，不了解其臨床表現(xiàn)程度。通過對(duì)照基因型與臨床表型，我們認(rèn)為蛋白功能域中的錯(cuò)義突變是研究該功能域具體作用的理想模型。

Sotos綜合征的確診主要基于臨床表現(xiàn)和基因診斷。對(duì)于臨床上典型的或疑似的Sotos綜合征患者，首先可采用基因芯片或多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)等技術(shù)檢測(cè)染色體拷貝數(shù)變異，如未發(fā)現(xiàn)任何基因的大片段缺失，必須進(jìn)一步進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)可能的致病性單核苷酸變異，以免漏檢NSD1基因內(nèi)突變。但目前也只有70%～90%的Sotos綜合征患者可檢測(cè)出NSD1基因異常，剩余10%～30%的患者或由于臨床上被錯(cuò)誤歸入Sotos綜合征，或以目前的檢測(cè)技術(shù)水平未能發(fā)現(xiàn)NSD1基因變異。CHOUFANI等[21]依據(jù)組蛋白修飾與DNA甲基化之間的相互聯(lián)系，開發(fā)了一種表觀遺傳學(xué)診斷方法，通過分析NSD1+/-特異性的CpG甲基化水平診斷Sotos綜合征。與正常對(duì)照相比，NSD1的功能缺失性突變會(huì)導(dǎo)致相關(guān)位點(diǎn)的CpG甲基化水平明顯下降。該方法的敏感性和特異性均為100%，可以明確診斷Sotos綜合征，并可與其他具有交叉臨床表現(xiàn)的疾病如Weaver綜合征鑒別，還能區(qū)分臨床意義未明的突變是良性還是致病性的。

目前，針對(duì)Sotos綜合征患者沒有根本性的治療方法，只能對(duì)癥治療，以減輕或預(yù)防相關(guān)臨床癥狀。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，我們有希望采用基因治療的手段治愈患者?，F(xiàn)今研究最熱的技術(shù)是CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，對(duì)于NSD1基因內(nèi)突變，在突變位點(diǎn)可引入一條正常的單鏈DNA模板，利用CRISPR-Cas9打斷雙鏈DNA，通過同源重組修復(fù)該基因[22]。但對(duì)于整個(gè)NSD1基因的缺失，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，借助病毒載體在特殊染色體位置整合一個(gè)有功能的新基因可能是個(gè)更好的選擇。

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