高效液相色譜測定明日葉中查爾酮的含量

鄧建梅，余傳波，鄭毅

（攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川攀枝花617000）

明日葉（Angelica keiskei）也叫明日草、咸草等。最初來源于日本的伊豆島，是傘形科草本植物的一種[1-2]。葉卵圓形，莖多，分枝能力較強(qiáng)，其生命力強(qiáng)盛，根系很發(fā)達(dá)，能在很多惡劣的環(huán)境中存活，具有“今日摘葉，明日長新芽”，故又叫“明日草”，由于自身含有大量的維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)和查爾酮等活性物質(zhì)，被譽(yù)為“二十一世紀(jì)的健康食品”。其中，黃酮類活性物質(zhì)在明日葉中含量較高，而查爾酮是一種重要的黃酮類化合物，其基本構(gòu)成是1，3-二苯基丙烯酮[3-6]。有研究表明查爾酮對(duì)癌癥和腫瘤具有很強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)還可以降血糖，降低膽固醇，具有抗血栓，抗菌消炎、防艾滋病等諸多功效[7-8]。在國外，許多國家已經(jīng)開始大面積種植明日葉，且作為一種健康蔬菜而普遍食用。在中國，明日葉已在臺(tái)灣地區(qū)被廣泛種植，在云南、江蘇、上海、山東、東北等多個(gè)地區(qū)也已經(jīng)被逐漸引進(jìn)并進(jìn)行大面積種植。

目前國內(nèi)有學(xué)者用分光光度計(jì)對(duì)明日葉中查爾酮的提取工藝進(jìn)行了研究，但具體的工藝參數(shù)不夠清楚，另外未見報(bào)道用高效液相色譜對(duì)其查爾酮進(jìn)行測定，尤其對(duì)高效液相色譜法測定明日葉中查爾酮的色譜條件更沒有學(xué)者研究，如能結(jié)合現(xiàn)代儀器對(duì)其查爾酮進(jìn)行測定，將是對(duì)明日葉進(jìn)行有效應(yīng)用的一個(gè)新的途徑。本試驗(yàn)正是采用超聲波輔助提取明日葉中查爾酮，高效液相色譜法測定查爾酮含量，以期為綜合應(yīng)用明日葉奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

明日葉：干熱河谷特色生物資源開發(fā)技術(shù)中心；查爾酮（99%）：上海雅吉生物科技有限公司；甲醇：色譜純其他試劑均為分析純。

1200型高效液相色譜儀：安捷倫公司；（KH2200DB）超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲波儀器廠。

1.2 查爾酮測定方法

1.2.1 樣品處理

將明日葉放于托盤中，自然風(fēng)干72 h，粉碎后，用60目篩篩選并存儲(chǔ)于棕色試劑瓶中密封保存以備用。

準(zhǔn)確稱取明日葉干粉樣品0.5 g，放置于100 mL錐形瓶中，參考寧鴻珍等[9]的方法對(duì)明日葉查爾酮進(jìn)行提取，將得到的提取液用真空泵進(jìn)行抽濾，用3 mL～5 mL乙醇洗滌濾渣2至3次，將所得到的濾液再次抽濾；所得濾液轉(zhuǎn)移到燒瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，再將濃縮的濾液水浴干燥，便得到了明日葉中查爾酮的粗提取物。

1.2.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

檢測色譜柱為phenomenex C18柱（5 μm，4.6 mm×150mm），柱溫 30℃，波長為 360nm[10]，流速 0.8mL/min，每次進(jìn)樣20 μL。為保證查爾酮類化合物能很好的被測定，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化，以不同濃度的甲醇∶水、甲醇∶0.4%磷酸作為流動(dòng)相，其比例設(shè)置為50∶50、55 ∶45、60 ∶40、65 ∶35、70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20、85 ∶15、90∶10。考察標(biāo)準(zhǔn)品的出峰情況。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇溶解準(zhǔn)確稱量好的查爾酮標(biāo)品20.00 mg，溶解并定容至50 mL，再按梯度配制成10、20、40、80、160、320 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

稱取約0.5 g明日葉粉末，加入一定濃度的乙醇進(jìn)行超聲波輔助提取。設(shè)置提取時(shí)間為10、20、30、40、50 min；料液比為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）；設(shè)置溫度為50、60、70、80、90℃；乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，測定明日葉查爾酮的含量。每組至少3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test design

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

通過對(duì)流動(dòng)相的優(yōu)化操作，實(shí)驗(yàn)表明流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)越高，出峰時(shí)間越早，出峰效果更好。并且當(dāng)流動(dòng)相為甲醇∶0.4%磷酸為85∶15時(shí)，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖清晰單一，波峰完全分離且無雜峰拖尾峰。所以流動(dòng)相選擇甲醇∶0.4%磷酸為85∶15作為流動(dòng)相為最佳。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 單因素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[9]，測定吸收波長為360 nm的吸光值，得出線性回歸方程：y=0.041 1x+0.051 7，R2=0.998 3，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 查爾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Chalcone standard curve

2.2.2 正交試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2為查爾酮液相色譜圖，由圖看出其保留時(shí)間為3.213 min，用進(jìn)樣針分別取20 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，繪制出查爾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y=34.695x+20.776，R2=0.999 7（N=6）。

2.3 精密度試驗(yàn)

用微量進(jìn)樣針分別吸取查爾酮320 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在此條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為 1.78%，說明

圖2 查爾酮標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 The chromatogram of chalcone standard

此方法精密度較好，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)Table 2 The precision test

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液 21 μL，經(jīng)過 0、2、4、6、8 h 和 24 h分別進(jìn)樣，得出RSD為1.1%，表明試液在24 h內(nèi)基本不變，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 The stability test

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算得出RSD為1.51%，重現(xiàn)性較好。結(jié)果見表4。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5，樣品中查爾酮的平均回收率為97.43%，說明加樣回收率較好。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of reproducible test

表5 回收率試驗(yàn)Table 5 The recovery experiment

2.7 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.7.1 不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間在10 min～20 min時(shí)，測得查爾酮的吸光值隨時(shí)間增長而逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間超過20 min時(shí)，測得查爾酮的吸光值有明顯下降且不再有大幅度的提高。這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用乙醇溶液作為萃取溶劑，萃取時(shí)間增加，溶劑揮發(fā)較多，使乙醇溶液濃度下降，使萃取效果降低。而在提取時(shí)間為20 min時(shí)，查爾酮能較好的被提取出來。故最佳提取時(shí)間為20 min。

2.7.2 不同料液比對(duì)提取效果的影響

料液比對(duì)提取效果的影響見圖4。

由圖4可知，吸光值隨料液比的增大而升高，其中料液比未達(dá)到1∶40（g/mL）時(shí)，吸光值增長相對(duì)較快，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶40（g/mL）后，吸光值增長相對(duì)緩慢。因?yàn)榱弦罕雀邥?huì)使兩相間的濃度差增大，傳質(zhì)動(dòng)力也會(huì)增大，所以提取效果也會(huì)更好。因?yàn)檫^大的料液比，會(huì)增加溶劑的使用量且在后面的操作中增加能耗和拉長時(shí)間，通過對(duì)提取效果、原料消耗和后續(xù)處理難度等問題進(jìn)行分析、平衡，試驗(yàn)確定以1 ∶40（g/mL）為最佳料液比。

圖4 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.4 The influence of liquid ratio on extraction effect

2.7.3 不同提取溫度對(duì)提取效果的影響

提取溫度對(duì)提取效果的影響見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由圖5可知，提取效果隨溫度增加先升高再降低，當(dāng)提取溫度為70℃使，此時(shí)有最大的吸光度值，所以可得明日葉查爾酮的提取的最佳提取溫度為70℃。因?yàn)闇囟冗^低，減慢提取物的溶出和降低傳質(zhì)速率：溫度過高，會(huì)極大的增加能耗，還可能會(huì)使提取物分解和揮發(fā)，甚至破壞化合物的分子結(jié)構(gòu)。所以可得明日葉查爾酮的提取的最佳提取溫度為70℃。

2.7.4 不同乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

不同乙醇濃度對(duì)提取效果的影響見圖6。

圖6 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on extraction efficiency

由圖6可知，整個(gè)過程吸光值呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。開始乙醇濃度升高，溶液極性升高，吸出大量的查爾酮，當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，會(huì)使溶液的極性下降，提取物的溶解度隨之下降，導(dǎo)致提取物不能充分溶解出來，另外一些可溶于醇的成分被析出，與查爾酮形成競爭機(jī)制，導(dǎo)致提取效果相對(duì)較差。

2.8 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以樣品1號(hào)為例，其色譜圖見圖7，其保留時(shí)間為3.159 min，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間3.213 min基本對(duì)應(yīng)，證實(shí)了查爾酮的存在。其它樣品測定方法與此相同，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表6。

圖7 樣品液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of sample

表6 查爾酮最佳提取條件結(jié)果Table 6 The optimum extraction conditions of chalcone

對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，料液組的極差為2.460，乙醇濃度組的極差為2.040，超聲溫度組的極差為1.262，超聲時(shí)間組的極差為1.062。從表中可以看出：對(duì)查爾酮的含量影響最大的是料液比，超聲時(shí)間對(duì)明日葉中查爾酮含量的影響最低，乙醇濃度和超聲溫度對(duì)查爾酮含量影響不大。通過正交試驗(yàn)得出，試驗(yàn)最優(yōu)組合料液比1∶30、乙醇濃度為80%、超聲溫度為80℃和超聲時(shí)間為30 min時(shí)。為了驗(yàn)證明日草黃酮最佳提取工藝的可靠性，在最優(yōu)條件下，料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度為80%、超聲溫度為80℃和超聲時(shí)間為30 min做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取算數(shù)平均值，其結(jié)果見表7。

表7 驗(yàn)證性試驗(yàn)Table.7 The replication experiment

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，查爾酮含量平均值為22.675 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.98%此偏差與偏離算術(shù)平均值的程度均在2.0%以內(nèi)，考慮試驗(yàn)誤差，表明該提取工藝參數(shù)較為穩(wěn)定。因此，采用正交試驗(yàn)得到的查爾酮提取工藝最優(yōu)條件的數(shù)據(jù)可靠。

3 結(jié)論

1）在查爾酮的提取過程中，質(zhì)量/體積對(duì)查爾酮提取率的影響最為顯著，乙醇濃度對(duì)提取率影響較大，其次是提取溫度，提取時(shí)間幾乎對(duì)查爾酮提取沒有影響。最佳組合條件為：在料液比為1∶30（g/mL）、提取溫度為80℃、乙醇濃度為80%和提取時(shí)間為30 min時(shí)，得到最高的查爾酮含量：為22.765 mg/g。這比陳欣華等[12]研究提出的查爾酮含量7.53 mg/g要高出兩倍多，這可能是采用現(xiàn)代高端儀器-高效液相色譜測量，減少了試驗(yàn)誤差，使得含量相對(duì)較高。

2）本試驗(yàn)表明，明日葉查爾酮的含量可通過現(xiàn)代儀器-高效液相色譜法測定，為查爾酮類化合物的獲得提供一種可利用資源，同時(shí)也為合理開發(fā)明日葉的藥用成分提供一定的依據(jù)。但本試驗(yàn)只是對(duì)其查爾酮含量進(jìn)行了測定，對(duì)提取的查爾酮沒有做進(jìn)一步的研究，在后續(xù)的試驗(yàn)中可以就其生理生化性質(zhì)等方面進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]李佳,張智俊,周長芳,等.明日葉的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(6):1142

[2]劉彬,楚冬海.超聲波提取明日葉總黃酮的工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(2):338-339

[3]Tatuji Enoki,Hiromu Ohnogi,Kinuko Nagamine,et al.AntidiabeticActivities of Chalcones Isolated from a Japanese Herb[J].Angelicakeiskei agricultural and food chemistry,2007,55(15):6013-6017

[4]Toshihiro Akihisa,Takashi Kikuchi,Hisashi Nagai,et al.4-Hydroxud－erricin from Angelica keiskei Roots Induces Caspase-dependentApoptotic Cell Death in HL60 Human Leukemia Cells[J].J Oleo Sci,2011,60(2):71-77

[5]Junichi Nagata,Tomoko Morino,Morio Saito.Effects of Dietary Angelica keiskei on Serum and Liver Lipid Profiles,and Bodu Fat Accumulations in Rats[J].J Nutr Sci Vitaminol,2007,53:133-137

[6]Chien-Yi Chen.Elemental analysis of the Taiwanese health foodAngelica keiskei by INAA[J].RadioanalyticalandNuclearChem－istry,2002,252(3):551-558

[7]孫赫,鐘進(jìn)義,孟揚(yáng).明日葉查爾酮對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞PCNA和BCL-2蛋白表達(dá)的影響[J].毒理學(xué)雜志,2011,25(1):33-36

[8]ZHENG H W,NIU X W,ZHU J,et al.Progress in research of biological activites of chalcones[J].Chin J New Drugs(中國新藥雜志),2007,16(18):1445-1449

[9]寧鴻珍,陳欣華,王曼曼,等.超聲波輔助提取明日葉查爾酮的工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā),2014,35(8):34-37

[10]孫蓮,張麗靜,孟磊,等.高效液相色譜法測定桑葉中的蘆丁[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2004,23(2):27-28

[11]劉娥,郭鵬.高效液相色譜法測定鐘祥苦蕎茶中蘆丁的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33(13):1110-1111

[12]陳欣華,王曼曼,寧鴻珍,等.明日葉中查爾酮三種提取方法的比較研究[J].食品工業(yè)2014,35(6)91-93