普洱熟茶的發(fā)酵微生物研究進(jìn)展

郝彬秀，李頌，田海霞，馬躍，劉海新，王春玲

（中國茶葉有限公司，北京102209）

黑茶，又稱后發(fā)酵茶，是我國傳統(tǒng)六大茶類中由微生物參與生產(chǎn)加工的一個特殊品類。近些年，云南普洱熟茶、湖南安化黑茶、廣西六堡茶和湖北青磚茶等黑茶消費量不斷增加，這其中普洱的知名度最高。

普洱茶產(chǎn)于我國云南地區(qū)，是指以云南大葉種茶葉為原料制成的緊壓茶或散茶。普洱茶按照其加工工藝，又分為普洱生茶和普洱熟茶，其中普洱生茶是由鮮葉經(jīng)過殺青、揉捻、曬干得到曬青毛茶后，直接壓制而成：普洱熟茶則在曬青毛茶的基礎(chǔ)上渥堆發(fā)酵三至四周后制成[1]。普洱熟茶屬于典型的后發(fā)酵茶，具有滋味醇和甘甜，湯色紅褐明亮等特點，其微生物發(fā)酵工藝是形成其獨特品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。

普洱茶一直被認(rèn)為是一種健康飲品，很多研究表明普洱熟茶具有降血糖、降血脂等功效[2-3]。普洱熟茶渥堆發(fā)酵過程中的微生物種類、變化規(guī)律和主要作用已經(jīng)被國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究。隨著研究的不斷深入，對普洱熟茶中關(guān)鍵微生物的分析也不斷有所突破，如何通過現(xiàn)代微生物技術(shù)生產(chǎn)出更有安全保障、品質(zhì)更為穩(wěn)定的普洱熟茶成為研究熱點，也得到消費者的廣泛關(guān)注。本文對普洱熟茶中微生物對茶葉品質(zhì)形成所起的作用及普洱熟茶安全性等熱點問題進(jìn)行綜述。

1 微生物發(fā)酵對普洱熟茶品質(zhì)形成的作用

普洱茶經(jīng)過渥堆發(fā)酵，茶葉成分發(fā)生了明顯變化，茶多酚、兒茶素和茶黃素含量大幅減少，沒食子酸、茶紅素和茶褐素大量增加，游離氨基酸含量下降，游離糖和水溶性多糖含量增加[4]。上述成分的改變使得普洱熟茶與未發(fā)酵的茶葉相比，兒茶素含量下降，而其所帶有的苦澀味顯著降低，茶葉的滋味更為醇厚，對腸胃的刺激性也相應(yīng)降低。除此之外，咖啡因物質(zhì)含量也有變化，有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初期咖啡因有所降低，隨著時間推移，微生物發(fā)酵作用的增強，咖啡因逐漸增高，黑曲霉、米曲霉、根霉、酵母等微生物能夠升高咖啡因在普洱茶中的含量[5]。

上述的成分變化來源于微生物及其代謝產(chǎn)物的作用，這也就是渥堆發(fā)酵在普洱熟茶生產(chǎn)過程中起著決定性作用的原因。各類微生物在渥堆發(fā)酵過程中產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等多種酶類物質(zhì)，這些酶作用于多酚、大分子糖類物質(zhì)等底物，一方面有助于茶葉內(nèi)含物的滲出，增加茶湯滋味和色澤，另一方面形成了新的滋味香氣物質(zhì)，造就了普洱熟茶醇厚甘甜的品質(zhì)[6]。同時，由于特有的微生物代謝產(chǎn)物和茶葉成分，普洱熟茶在調(diào)節(jié)糖類代謝、降脂減肥等方面的功效也被廣泛關(guān)注[7]，如由塔賓曲霉、溫特曲霉等產(chǎn)生的洛伐他汀對普洱茶的功效起到關(guān)鍵作用。

2 普洱熟茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物及其作用

由于普洱茶渥堆過程的微生物來源于環(huán)境以及原料鮮葉，因此不同地區(qū)、不同原料的普洱茶渥堆過程中的優(yōu)勢微生物種類有所不同，而也正是因為這些不同種群的微生物形成了云南各地普洱茶的不同風(fēng)味品質(zhì)。目前研究認(rèn)為參與普洱熟茶發(fā)酵的微生物主要包括：第一、霉菌，如黑曲霉、米曲霉、青霉等；第二、酵母，如Blastobotrys adeninivorans，釀酒酵母；第三、細(xì)菌，如凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等；第四、放線菌，如鏈霉菌等，具體總結(jié)見表1。

表1 普洱熟茶中的發(fā)酵微生物Table 1 Research progress of fermented microbes in Pu-erh tea

不同種類的微生物在發(fā)酵過程中有著不同作用。目前認(rèn)為霉菌類微生物是普洱熟茶品質(zhì)形成的基礎(chǔ)。馮玲然研究指出，黑曲霉產(chǎn)生多種水解酶，如葡萄糖淀粉酶、纖維素酶等，其產(chǎn)生的多酚氧化酶能夠降低茶多酚含量，減少普洱茶的苦澀味道，且茶多酚可逐漸被氧化成茶褐素，從而形成普洱茶不同于其他茶葉的紅褐色的明亮湯色[14]，有學(xué)者認(rèn)為茶褐素是普洱熟茶的最重要功效成分，發(fā)揮了調(diào)節(jié)糖類代謝、降脂減肥等作用[15]；一些黑曲霉菌株還能夠提高普洱茶的茶多糖含量，研究顯示利用這些菌株進(jìn)行單菌株發(fā)酵的茶葉與其原料葉片相比增加了158%的茶多糖含量[16]，而黑曲霉發(fā)酵的普洱茶香氣也有明顯特點，其沉香中帶有花果香氣[11]。米根霉能產(chǎn)生大量果膠酶，茶葉中的果膠會在酶作用下水解成水溶性果膠和其他可溶性糖類，增加普洱茶醇厚口感和甘甜味道[14]；而少根根霉對于普洱茶香氣中的甲氧基苯及其衍生物的含量較高，形成陳香濃厚，滋味甘滑的特點[11]。米曲霉能夠明顯提升普洱茶香氣和滋味[14]；灰綠曲霉和青霉也能夠降解茶葉中的纖維和果膠，提升醇厚口感[17]，青霉還能夠產(chǎn)生多種酶類及有機酸，可產(chǎn)生葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、檸檬酸、抗壞血酸等。

除了上述常被報道的霉菌類微生物外，酵母及細(xì)菌在發(fā)酵過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。酵母能夠分泌很多活性酶，如蔗糖酶、麥芽糖酶等，還能夠代謝產(chǎn)生茶褐素[18]。近年來，Blastobotrys adeninivorans（又稱Arxula adeninivorans）被一些研究者認(rèn)為是渥堆過程中的關(guān)鍵優(yōu)勢菌，具有耐高溫和耐鹽的能力，能夠產(chǎn)生氧化酶，加快氧化或轉(zhuǎn)化茶葉中多酚類物質(zhì)，促進(jìn)茶葉風(fēng)味的轉(zhuǎn)變[19]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵的普洱茶香氣成分中，萜烯醇類化合物及其衍生物，以及甲氧基苯及其衍生物含量較高，因此茶湯滋味醇和甘滑，陳香明顯[10]。

普洱熟茶中主要的細(xì)菌群落為歐文氏菌屬、無色桿菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、短桿菌屬、葡萄球菌屬[20]。其中，芽孢桿菌屬發(fā)揮了很大作用，尤其在發(fā)酵后期能夠產(chǎn)生豐富酶類，如多酚氧化酶、過氧化物酶等，從而促進(jìn)茶多酚類物質(zhì)經(jīng)過氧化、縮合形成多聚物，有利于普洱茶品質(zhì)提高[10]。此外，放線菌也被認(rèn)為參與了普洱熟茶的發(fā)酵過程，利用燼灰鏈霉菌（Streptomyces cinereus）等能夠縮短普洱茶發(fā)酵時間，其發(fā)酵的茶葉含有大量的多酚，并有很強的清除DPPH自由基的能力；桿菌狀鏈霉菌（Streptomyces bacillaris）則能夠使發(fā)酵茶葉含有大量γ-氨基丁酸[13]。

多數(shù)研究者認(rèn)為在整個發(fā)酵過程中，黑曲霉（A.niger）始終占據(jù)數(shù)量上的優(yōu)勢，黑曲霉在發(fā)酵初期能夠?qū)⒉枞~中大分子降解成小分子，使得這些物質(zhì)能夠被其他微生物所利用，因此發(fā)酵后期酵母、青霉等微生物數(shù)量也有增長[5]。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對比分析也表明，普洱茶發(fā)酵前期和中期優(yōu)勢微生物都是黑曲霉[21]。Abea應(yīng)用PCR-DGGE方法分析后認(rèn)為普洱茶發(fā)酵過程優(yōu)勢菌為黑曲霉和Blastobotrys adeninivorans，霉菌和酵母能利用各種茶葉多糖作為碳源，進(jìn)行代謝活動，當(dāng)兩者大量繁殖時抑制細(xì)菌生長，從而使曲霉和酵母成為優(yōu)勢菌[19]。張陽采用PCR-DGGE法研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和格拉青霉菌（P.glabrum）是普洱茶發(fā)酵的優(yōu)勢菌[12]。而近年來也有學(xué)者提出不同意見，呂昌勇利用宏基因組學(xué)進(jìn)行微生物多樣性分析，結(jié)果顯示細(xì)菌是普洱茶發(fā)酵過程中的主要菌群，占總微生物的76.26%，真核生物為16.35%[22]，其中酵母占真核生物的大多數(shù)，含量遠(yuǎn)大于霉菌[18]。

3 普洱熟茶中微生物的安全性問題

由于普洱熟茶目前的發(fā)酵工藝仍屬于“自然發(fā)酵”，開放式的渥堆發(fā)酵環(huán)境導(dǎo)致了其發(fā)酵過程中的不可控程度較高，每批次參與發(fā)酵的微生物及發(fā)酵程度都不穩(wěn)定，且近年來，對于普洱熟茶的安全性逐步引來質(zhì)疑。

客觀來講，目前未見公開的普洱熟茶毒性報道，還沒有任何科學(xué)證據(jù)表明普洱熟茶不安全。一些毒理學(xué)研究結(jié)果對普洱熟茶的安全性持肯定態(tài)度：Wu的細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)普洱茶無細(xì)胞毒性與遺傳毒性[23]，動物實驗顯示普洱熟茶屬于實質(zhì)無毒類食品，且無明顯不良反應(yīng)[24]。人體試驗的急性毒性實驗在10 g/d的劑量下未發(fā)現(xiàn)血液和生理學(xué)變化，長期毒性試驗也未發(fā)現(xiàn)變化[25]。關(guān)于毒素問題，也有大量研究持樂觀態(tài)度，這些結(jié)果指出普洱熟茶不含有赭曲霉毒素、雜色曲霉毒素、伏馬毒素、桔霉素和黃曲霉毒素[26-27]。

另一方面，有研究指出某些參與普洱熟茶發(fā)酵的微生物有產(chǎn)毒素能力，值得關(guān)注。例如，研究者從普洱茶中檢出了黃曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A，嘔吐毒素等[19]。濕倉儲存的普洱茶中也被報道檢測出了黃曲霉毒素B1、伏馬毒素、嘔吐毒素和T-2毒素。必須指出，不當(dāng)?shù)拇鎯Νh(huán)境，特別是南方的一些高濕環(huán)境會增加普洱熟茶中產(chǎn)生毒素的風(fēng)險。在最新的報道中，Zhang對普洱熟茶進(jìn)行了毒素檢測，發(fā)現(xiàn)了展青毒素、Cyclo（L-Pro-L-Tyr）、灰綠曲霉酰胺、Neoechinulin A、羥基大黃素、枝孢菌素、大黃素、羊茅麥角堿、羊茅麥角堿A、羊茅麥角堿C、百脈根甙、畸形素C、霉酚酸、大黃素甲醚、松蘿酸和玉米赤霉烯酮等25種有毒化合物。研究顯示展青毒素含量高，但尚不確定展青毒素的來源。Cyclo（L-Pro-L-Tyr）化合物由溶桿菌和互隔交鏈孢霉產(chǎn)生，從所有的普洱熟茶樣品均被檢出。灰綠曲霉酰胺是一種由帚狀曲霉產(chǎn)生的毒素，所有的實驗茶樣中均被檢出。Neoechinulin A化合物是一種吲哚生物堿，由一些散囊菌屬微生物產(chǎn)生，所有茶樣中均被檢出[28]。此外，其他研究也顯示普洱熟茶存在真菌毒素，Haas曾在4個樣品中檢出赭曲霉毒素A[26]。Zhu發(fā)現(xiàn)嘔吐毒素在普洱茶中的檢出比例高達(dá)90%，即70個樣品中有63個樣品檢出[27]。

一些研究者從普洱熟茶中發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)真菌毒素的微生物菌株，例如部分黑曲霉、局限曲霉和桔青霉產(chǎn)毒株。但發(fā)酵微生物與茶葉中毒素的關(guān)系尚未經(jīng)過系統(tǒng)研究，一些研究指出茶葉所包含的常見產(chǎn)毒菌株在發(fā)酵過程不會產(chǎn)生毒素。例如，李亞莉?qū)ⅫS曲霉接種在普洱茶葉中，發(fā)酵結(jié)束后未從實驗組茶葉中檢出黃曲霉毒素[29]；Zhang在茶樣中檢出能夠產(chǎn)生赭曲霉毒素的黑曲霉和赭曲霉，但未在茶樣中檢出赭曲霉毒素[28]。針對上述現(xiàn)象，學(xué)界有不同的解釋。有研究表明普洱茶中的黑曲霉能夠抑制黃曲霉的生長和產(chǎn)毒，并且能夠降解黃曲霉毒素B1[30]；也有觀點認(rèn)為茶葉中的氨基酸或多酚類等成分能夠抑制產(chǎn)毒微生物產(chǎn)生真菌毒素類物質(zhì)，如Mo認(rèn)為茶葉提取物能夠阻止菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素，但不抑制黃曲霉的生長[31]。

4 討論

關(guān)于普洱熟茶中微生物種類、功能及其安全性的研究已經(jīng)成為了茶行業(yè)，乃至發(fā)酵行業(yè)的一個研究熱點。目前關(guān)于普洱熟茶的微生物種類和安全性的相關(guān)研究不少，但結(jié)果重復(fù)性差，甚至互相矛盾，究其原因，是普洱熟茶的發(fā)酵尚屬于一個沒有標(biāo)準(zhǔn)化控制的自然發(fā)酵工序，即便同一普洱工廠不同批次普洱熟茶也會存在差異，其發(fā)酵過程的微生物種類、數(shù)量并不可控。生產(chǎn)環(huán)境的變化，季節(jié)的更替等自然因素的變化也會導(dǎo)致普洱熟茶發(fā)酵過程中菌群的波動。因此，只有將微生物和工藝領(lǐng)域的研究與普洱茶產(chǎn)業(yè)更加緊密地結(jié)合起來，才能獲得更有說服力和價值的數(shù)據(jù)。

普洱茶，特別是經(jīng)過發(fā)酵的普洱熟茶已經(jīng)成為了我國茶產(chǎn)業(yè)，甚至是健康產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。作為一種發(fā)酵食品，普洱熟茶的獨特風(fēng)味和健康功效逐步被更多人接受。在保留傳統(tǒng)制茶技藝的同時，將普洱熟茶的發(fā)酵工藝做得更加規(guī)范，將更先進(jìn)的發(fā)酵理念、工藝技術(shù)和評價手段引入這一傳統(tǒng)行業(yè)勢在必行。首先，普洱熟茶發(fā)酵過程中的微生物分析有待進(jìn)一步完善。結(jié)合非培養(yǎng)技術(shù)，如宏基因組或高通量測序等技術(shù)手段，總結(jié)微生物生長消亡規(guī)律，探明微生物生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)變化以及各種微生物在發(fā)酵過程中的作用，明確哪些微生物是形成普洱茶品質(zhì)的核心，存在哪些較易污染的潛在產(chǎn)毒菌株；第二，分析普洱熟茶的獨特健康價值，闡明其中核心的功效成分組，為指導(dǎo)生產(chǎn)、選育菌株、開發(fā)工藝提供基礎(chǔ)理論依據(jù)；第三，現(xiàn)階段應(yīng)該加強產(chǎn)品毒素和致病菌的監(jiān)控，在生產(chǎn)環(huán)節(jié)加強衛(wèi)生監(jiān)督，并研制和開發(fā)清潔化生產(chǎn)工藝和設(shè)備，利用經(jīng)過完整安全性評價的發(fā)酵菌株進(jìn)行干預(yù)強化，甚至是接種發(fā)酵，最大化地消除環(huán)境不可控帶來的食品安全風(fēng)險，將目前開放式的自然發(fā)酵工藝升級為有質(zhì)量控制和檢測標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝。

普洱熟茶是我國傳統(tǒng)后發(fā)酵茶的代表，微生物及配套發(fā)酵工序通過改變茶葉成分，使普洱熟茶形成了其獨特品質(zhì)。通過不斷改良生產(chǎn)工藝，加強質(zhì)量控制，建立普洱熟茶的品質(zhì)及安全標(biāo)準(zhǔn)，推動茶葉發(fā)酵產(chǎn)業(yè)升級，是進(jìn)一步做大做強我國茶產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵。

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