含醇發(fā)酵乳的研制

賈夢凡 ， 呂 欣

（1.西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119）

目前發(fā)酵乳多由嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌等乳酸菌發(fā)酵而成。近年來，隨著人民生活水平的提高，人們對發(fā)酵乳的風味質(zhì)地、新奇口感以及營養(yǎng)強化等方面有了更高的追求[1]。其中，開菲爾、酸馬奶酒等引起了廣泛關注[2]。酸馬奶酒是一種以新鮮馬乳為原料，自然發(fā)酵而成的具有一定保健功效，呈乳白色、均勻的含醇發(fā)酵乳飲料，其對心血管疾病、神經(jīng)性疾病、消化系統(tǒng)疾病、糖尿病、肺結(jié)核及肺氣腫等都具有一定治療作用，并對某些癌癥有防治作用[3-5]。但是馬奶的季節(jié)性、來源少及低產(chǎn)量限制了酸馬奶酒的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[6]。

作者以牛乳為原料，利用從新疆酸馬奶中分離得到的乳酸菌及酵母菌混合發(fā)酵生產(chǎn)含醇發(fā)酵乳，優(yōu)選乳酸菌和酵母菌并進行分子鑒定，進一步研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種體積分數(shù)及接種比例等對發(fā)酵乳的影響，建立以牛乳為原料生產(chǎn)含醇發(fā)酵乳的最優(yōu)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）[7]；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）[8]；脫脂牛乳：將脫脂牛乳粉溶于蒸餾水（1∶9）中攪拌均勻，加入5%白砂糖，在114℃條件下滅菌10 min后，迅速冷卻待用。乳酸菌及酵母菌：分離自新疆酸馬奶酒；白砂糖：市售一級；細菌基因組DNA提取試劑盒：OMEGA公司；酵母菌基因組DNA提取試劑盒：上海生物工程有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

722s可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司制造；Thermo Fisher高速冷凍離心機：美國熱電公司；3420A氣相色譜儀：北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；PHS-3C精密pH計：上海日島科學儀器有限公司；MJ Mini梯度PCR儀：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)：北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的篩選 將從酸馬奶中分離出的9株乳酸菌凍干菌種分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，活化兩代后保存于4℃MRS斜面待用。并取30 mL菌液于8 000 r/min離心3 min，倒去懸浮液，給沉在離心管底部的菌體加入20 mL生理鹽水，懸浮，再離心2 min后，將沉淀菌體接種于滅菌脫脂乳中。于37℃發(fā)酵至凝乳，再接種至100 mL滅菌脫脂乳中，通過感官評定篩選乳酸菌菌株進行后續(xù)乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵試驗研究。

1.3.2 酵母菌的篩選 將從酸馬奶中分離出的14株酵母菌凍干菌種分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，活化兩代后保存于4℃YPD斜面待用。并取30 mL菌液于8 000 r/min離心3 min，倒去懸浮液，給沉在離心管底部的菌體加入20 mL生理鹽水，懸浮，再離心2 min后，將沉淀菌體接種于滅菌脫脂乳中。于28℃發(fā)酵至產(chǎn)生大量氣泡，再接種至100 mL滅菌脫脂乳中，通過感官評定篩選酵母菌菌株用于后續(xù)乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵試驗的研究。

1.3.3 菌株DNA的提取、擴增及分子鑒定 乳酸菌的提取按照OMEGA細菌基因組DNA提取試劑盒操作，擴增參照文獻[9]操作；酵母菌的提取按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒操作，擴增參照文獻[10-11]操作。

將電泳回收產(chǎn)物用冰袋保存寄到生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測得乳酸菌菌株16S rDNA序列及酵母菌菌株26S rDNA序列后，在NCBI上進行BLAST比對。利用MEGA6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 單因素和正交試驗 分別選取乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵溫度為 26、28、30、32、34、36、38 ℃，混合發(fā)酵時間為 8、10、12、14、16、18、20 h， 接種比例（乳酸菌/酵母菌）為 2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，接種體積分數(shù)為 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；進行單因素發(fā)酵試驗，選出對試驗結(jié)果影響較大的指標參數(shù)進行正交試驗，從而優(yōu)化工藝參數(shù)，得到較優(yōu)產(chǎn)品。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設計因素水平表，做正交表進行正交試驗，優(yōu)化含醇發(fā)酵乳的工藝參數(shù)。試驗因素與水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.3.5 分析方法 理化指標：pH用PHS-3C精密pH計測定[12]；滴定酸度用酸堿滴定法測定[13]；酒精度用氣相色譜法測定[14]；總酸及氨基酸態(tài)氮按照奶酒國標GB/T 23546-2009方法測定[15]；持水力按照文獻[16]的方法測定；還原糖質(zhì)量濃度參照文獻[17]的方法測定。

感官指標：本產(chǎn)品感官評定方法采用綜合評分法，略有改動[18]。在有明亮的自然光、溫度為25℃的房間內(nèi)依據(jù)產(chǎn)品特點進行感官評定，感官評分標準（滿分100分）見表2。

表2 含醇發(fā)酵乳感官評分表Table 2 Sensory evaluation of the fermented milk with low alcohol

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 乳酸菌 取活化兩代后的9株乳酸菌MRS菌液30 mL，于8 000 r/min離心3 min，除去懸浮液后，給沉在離心管底部的菌體都加入20 mL生理鹽水，再離心2 min，將9種菌體分別接種于滅菌脫脂乳中，再將脫脂乳放置于37℃發(fā)酵24 h后，進行感官評定，見表3。選擇6號乳酸菌菌株進行后續(xù)試驗。

表3 乳酸菌發(fā)酵性能試驗結(jié)果Table 3 Results of lactic acid bacteria fermentation performance test

2.1.2 酵母菌 取活化兩代后的14株酵母YPD菌液30 mL，于8 000 r/min離心3 min，除去懸浮液后，給沉在離心管底部的菌體都加入20 mL生理鹽水，再離心2 min，將14種菌體分別接種于滅菌脫脂乳中，再將脫脂乳放置于28℃發(fā)酵24 h后，進行感官評定，見表4。

表4 酵母菌發(fā)酵性能試驗結(jié)果（脫脂乳中不含蔗糖）Table 4 Results of yeast fermentation performance test（no sucrose in the skim milk）

7號、9號、12號氣泡產(chǎn)生量適中，剎口感適中且品嘗時具有發(fā)酵產(chǎn)生的特殊風味，選擇7、9及12號酵母菌菌株進行下一步試驗。

對選出的酵母菌再進行試驗，觀察它們在含5%蔗糖脫脂乳中的發(fā)酵情況并進行品嘗和記錄，見表5。

表5 酵母菌發(fā)酵性能試驗結(jié)果（脫脂乳中含5%蔗糖）Table 5 Results of yeast fermentation performance test（5%sucrose in the skim milk）

7號氣泡產(chǎn)生量適中，有輕微剎口感且發(fā)酵風味濃郁，而9號、12號產(chǎn)生大量氣泡且有凝乳現(xiàn)象，搖動產(chǎn)生渣狀沉淀，剎口感過于強烈，使人有不適感，故選擇7號酵母菌菌株進行后續(xù)試驗。

2.1.3 菌株分子鑒定結(jié)果 優(yōu)選出的乳酸菌分子鑒定結(jié)果為Lactobacillus crustorum，酵母菌為Trichosporon asahii。

對于面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）及阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii），目前多數(shù)研究報道只是將其從一些原料中分離鑒定出來，如面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）曾在酸面團中分離得到[19-20]；席琳喬等[21]發(fā)現(xiàn)青貯復合系主要由4種微生物組成，其中包括Lactobacillus crustorum；董小婉[22]等在新疆哈薩克族酸奶中也分離得到過Lactobacillus crustorum；王薇等[23]首次從清香型白酒釀造過程中分離獲得Trichosporon asahii，是對中國清香型白酒釀造酵母資源的補充；蘇俊等[24]從山西偏關縣的酸性稷米汁中分離出Trichosporon asahii，發(fā)現(xiàn)其有廣闊的pH耐受性。但是，關于菌株發(fā)酵條件等的研究報道很少，我們將Lactobacillus crustorum與Trichosporon asahii在牛乳中共發(fā)酵得到優(yōu)化的含醇發(fā)酵乳，對菌種的發(fā)酵條件等作了初步探究，見圖1-2。

圖1 乳酸菌基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the lactic acid bacterium according to 16S rDNA sequences

圖2 酵母菌基于26S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the yeast according to 26S rDNA sequences

2.2 正交試驗結(jié)果與討論

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗確定含醇發(fā)酵乳最佳生產(chǎn)工藝，優(yōu)化發(fā)酵條件，結(jié)果見表6。

由表6可知，影響含醇發(fā)酵乳質(zhì)量的因素主次順序為D﹥B﹥A﹥C，即接種比例﹥發(fā)酵時間﹥發(fā)酵溫度﹥接種體積分數(shù)。因此本試驗條件下確定的含醇發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵條件組合為A3B1C1D3，即發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為14 h，接種體積分數(shù)為4%，接種比例（乳酸菌/酵母菌）為 2∶3。 閆彬等[25]研究初步確定了雙菌混合發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件，但其采用兩階段發(fā)酵，發(fā)酵工藝較為復雜，我們嘗試在發(fā)酵過程中同時加入乳酸菌與酵母菌靜置培養(yǎng)，使其自然發(fā)酵，所得優(yōu)化工藝參數(shù)與馬榮山等[26]的研究結(jié)果相近。

表6 含醇發(fā)酵乳發(fā)酵工藝L9（34）正交試驗結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiments about optimization fermentation conditions of the fermented milk with low alcohol

2.3 含醇發(fā)酵乳產(chǎn)品理化指標

按照最優(yōu)工藝參數(shù)進行發(fā)酵，所得含醇發(fā)酵乳的理化指標見表7。

與馬榮山[26]等比較，總酸質(zhì)量濃度相近，酒精度較低，與黃翠姬[27]等比較，滴定酸度及酒精度偏低，與張和平[28]等比較，酒精度相近，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度高。由于試驗方法及所用菌種的不同，所得產(chǎn)品理化指標的測定結(jié)果存在差異。

表7 含醇發(fā)酵乳理化指標測定結(jié)果Table 7 Results of physical and chemical indexes

3 結(jié)語

作者以牛乳為原料，利用分離自新疆酸馬奶中的乳酸菌及酵母菌，從中優(yōu)選出一株乳酸菌及一株酵母菌并進行分子鑒定，乳酸菌為Lactobacillus crustorum，酵母菌為Trichosporon asahii，通過單因素及正交試驗優(yōu)化含醇發(fā)酵乳的生產(chǎn)工藝，優(yōu)化的工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間14 h，接種體積分數(shù) 4%，接種比例（乳酸菌/酵母菌）2∶3，在該條件下測定了含醇發(fā)酵乳成品的理化指標。本研究所用菌株均分離自新疆酸馬奶，并將乳酸菌與酵母菌同時發(fā)酵，產(chǎn)品風味獨特，與酸馬奶接近，且生產(chǎn)工藝較簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具實用性。因此，本研究為含醇發(fā)酵乳的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供了一定理論依據(jù)。

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