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    適用于黃酒米漿水處理的酵母菌的篩選

    2018-05-04 07:12:08孫士勇蔡國林馬素梅
    關(guān)鍵詞:漿水黃酒酸化

    孫士勇 , 曹 鈺 *,2, 陸 健 ,, 蔡國林 , 馬素梅

    (1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫214122;3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室,江蘇 無錫 214122)

    米漿水是黃酒釀造過程中浸米工序的副產(chǎn)物,傳統(tǒng)黃酒釀造,浸米時間比較長,比如傳統(tǒng)的攤飯法釀酒時,浸米時間就長達16~20 d?,F(xiàn)在機械化黃酒生產(chǎn)工藝中一般采用較高的溫度保溫浸米,浸米的時間減少,但是仍需要4~5 d[1]。程斐等使用生物酸化浸米的方法,人工接種乳酸菌進行浸米,快速提高米漿水的酸度,將浸米時間縮短為2 d[2-3]。米漿水中含有十分豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、糖類、有機酸等,其中氨基酸的種類多達18種,還有微量元素、B族維生素和礦物質(zhì)等[4]。米漿水產(chǎn)量非常巨大,生產(chǎn)1 t黃酒大約要產(chǎn)生0.65 t米漿水。2014年我國黃酒產(chǎn)量達到330萬t左右,按照測算總共產(chǎn)生約214.5萬t米漿水。采用厭氧-好氧方式處理米漿水,每噸大約花費2元以上,加上設(shè)備購置和維護費用,米漿水的處理帶來了很大的負擔(dān),同時也是對營養(yǎng)物質(zhì)的浪費。

    目前對米漿水的資源化利用還比較局限,俞關(guān)松等[5]把新鮮的米漿水作為復(fù)制糟香型白酒的投料用水,但受到釀造季節(jié)的約束,有一定的局限性。周高峰等[6]添加75%的米漿水來代替自來水制作黃酒熟麥曲。姜佳麗等[7]考察了用米漿水來替代制曲配料用水制備醬油生產(chǎn)用米曲霉、黑曲霉和紅曲霉的制曲效果。但作為制曲用水,整體消耗量較小。

    類胡蘿卜素是一類廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)的脂溶性色素,已被用于藥物、保健食品、飼料和化妝品的生產(chǎn)中[8-12]。類胡蘿卜素對動物和人體具有十分重要的作用,不僅可以作為維生素A的前體[13],同時還具有很強的抗氧化性,能清除體內(nèi)的自由基[14],動物和人體內(nèi)的類胡蘿卜素只能從外界獲取[15-16]??梢援a(chǎn)生類胡蘿卜素的酵母主要有紅酵母屬(Rhodotorula),鎖擲酵母屬(Sporidiobolus),法夫酵母屬(Phaffia),擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)[17-21]。采用酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素具有營養(yǎng)要求簡單、發(fā)酵周期短和發(fā)酵條件易于控制等優(yōu)點[22]。

    作者在環(huán)境中分離篩選了一株近玫色鎖擲酵母,一方面可以利用米漿水中的營養(yǎng)物質(zhì),降低米漿水的COD,大大減輕廢水處理壓力,另一方面也可以生產(chǎn)單細胞蛋白(SCP)和類胡蘿卜素,提高了經(jīng)濟效益。

    1 材料與方法

    1.1 培養(yǎng)基

    YPD培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/dL,酵母膏10 g/dL,葡萄糖20 g/dL,pH自然;

    富集培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/dL,酵母膏10 g/dL,葡萄糖20 g/dL,鏈霉素0.005 g/dL,pH自然;

    酸性YPD培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/dL,酵母膏10 g/dL,葡萄糖20 g/dL,調(diào)pH至 3.5;

    淀粉培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.5 g/dL,KH2PO40.1 g/dL,NaCl 0.01 g/dL,MgSO4·7H2O 0.05 g/dL,CaCl20.01 g/dL,酵母膏 0.02 g/dL,淀粉 2 g/dL,pH6.5;

    乳酸培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.5 g/dL,KH2PO40.1 g/dL,NaCl 0.01 g/dL,MgSO4·7H2O 0.05 g/dL,CaCl20.01 g/dL,酵母膏 0.02 g/dL,用乳酸調(diào) pH 至 3.5~3.7;

    MRS培養(yǎng)基:葡萄糖2 g/dL,蛋白胨1 g/dL,乙酸鈉0.5 g/dL,牛肉膏1 g/dL,檸檬酸氫二銨0.2 g/dL,酵母膏 0.5 g/dL,MgSO4·7H2O 0.058 g/dL,吐溫80 0.1 g/dL,MnSO4·4H2O 0.025 g/dL,K2HPO40.2 g/dL,pH 6.2~6.4。

    1.2 生物酸化浸米漿水(BAS)的制備及成分分析

    稱取一定質(zhì)量糯米,按1∶1.25的米水比加水,接種植物乳桿菌進行生物酸化浸米,30℃浸漬2 d后,過濾得到生物酸化浸米漿水(BAS,Bio-acidified Seriflux)。測定米漿水的pH、總酸、總糖、淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、氨態(tài)氮和COD。

    1.3 菌株的分離

    1.3.1 一級篩選 在學(xué)校及附近生活區(qū)采集水樣、土樣、花草、食品樣本,于富集培養(yǎng)基中富集過夜,涂布于YPD固體培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)2 d,挑取紅色菌落,鏡檢觀察是否為酵母菌。

    1.3.2 二級篩選 將第一步篩選到的產(chǎn)色素酵母菌株接種到酸性YPD培養(yǎng)基中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h,測定培養(yǎng)后的pH、生物量、色素產(chǎn)量,同時將菌液離心后用無菌水洗滌兩次,用等體積無菌水重懸,30℃放置2 h進行饑餓處理,滴加在乳酸平板和淀粉平板上,30℃培養(yǎng)72 h,觀察菌株對乳酸和淀粉的利用情況,綜合考慮,篩選出性能較優(yōu)的菌株。

    1.3.3 三級篩選 將上一步篩選的酵母菌株接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基過夜作為種子液,將菌液離心后用無菌水洗滌兩次,用等體積無菌水重懸,以5%的接種體積分數(shù)接種于BAS(裝液量20%)中,30℃,200r/min培養(yǎng)48 h,測定pH、細胞數(shù)、色素產(chǎn)量、COD去除率,選擇綜合性能最優(yōu)的菌株。

    1.4 菌株R-70的形態(tài)特征

    顯微形態(tài):挑取酵母菌培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù),吸取一滴在潔凈的載玻片上,蓋上蓋玻片,用高倍鏡觀察細胞的形狀、大小和生殖方式。

    菌落形態(tài):將新鮮培養(yǎng)的酵母菌在YPD平板上劃線,30℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落的顏色、質(zhì)地、表面和邊緣形狀等特征。

    1.5 菌株R-70的生理學(xué)特征

    對酵母菌進行糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化、脲酶試驗和生長溫度試驗,方法參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[23]。

    1.6 菌株R-70的分子生物學(xué)鑒定

    使用酵母基因組DNA快速抽提試劑盒提取酵母的總DNA, 使用通用引物NL-1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL-4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3') 對菌株 26S rDNA近5'端的D1/D2區(qū)域進行PCR擴增,目標(biāo)產(chǎn)物的長度大約為600 bp,PCR反應(yīng)條件為:94℃變性 1 min,53℃退火 1 min,72℃延伸 1 min,36個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,回收后純化,由上海生物工程有限公司進行序列測定,根據(jù)測序結(jié)果,在NCBI上用BLASTN對擴增序列進行同源性比較,用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining分析方法進行分子系統(tǒng)分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行1 000次的Bootstraps檢驗。

    1.7 菌株R-70在BAS中的生長情況

    將篩選的紅酵母接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h,每隔4小時取樣,血球計數(shù)板法測定細胞數(shù),R-70菌株的色素為胞內(nèi)色素,使用酸熱法破壁后用丙酮提取色素并測定[24],離心后烘箱法[25]測定上清液的COD。

    1.8 BAS中接種菌株R-70培養(yǎng)后的成分變化

    將篩選的紅酵母接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h,每隔4小時取樣,測定培養(yǎng)液的pH,靛酚藍-分光光度法[26]測定氨態(tài)氮質(zhì)量濃度,測定培養(yǎng)液的還原糖和氨基酸態(tài)氮,測定方法參考國標(biāo)GB/T 13662-2008。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 生物酸化浸米漿水(BAS)的成分分析

    自然浸漬的米漿水受到米種類、產(chǎn)地來源、水溫等多種因素影響,其組成和COD存在差異和波動顯著現(xiàn)象。為保障研究工作的開展,作者采用生物酸化浸米漿水進行實驗。稱取一定質(zhì)量糯米,按1∶1.25的米水比加水,接種植物乳桿菌進行生物酸化浸米,30℃放置2 d后,過濾得到BAS,測定成分,結(jié)果見表1。

    表1 BAS的成分分析Table 1 Component analysis of Bio-acidified Seriflux

    由表1可以看出,米漿水營養(yǎng)豐富,經(jīng)過生物酸化浸米的米漿水,成分比較穩(wěn)定,有利于后期發(fā)酵過程的穩(wěn)定性。生物酸化浸米得到的米漿水,pH較低,含有一定的淀粉和有機酸,其中有機酸主要為乳酸,約占88.98%,在后期的篩菌過程中,除生長情況和COD降解率外,也考察菌株對淀粉和乳酸的利用情況。

    2.2 菌株的篩選

    在環(huán)境中分離篩選到108株紅色酵母菌株,測定菌株的生物量、色素產(chǎn)量和色素質(zhì)量分數(shù),并且考察了各菌株對淀粉和乳酸的利用能力,部分篩選結(jié)果見表2。

    表2 二級篩選的部分結(jié)果Table 2 Part of results of secondary screening

    R-30可以以乳酸為惟一碳源,R-46、R-50、R-70和R-85菌株的產(chǎn)色素能力較強,選擇這5株相對較優(yōu)的酵母菌株進入下一步篩選。

    分別接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)24 h,用無菌水洗滌2次,制備種子液。以5%的接種體積分數(shù)接種于BAS中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)48 h,分別測定培養(yǎng)前后的米漿水各個指標(biāo),結(jié)果見表3。

    R-70菌株對米漿水COD的降解率最高,達到90.38%,色素產(chǎn)量也是最高,達到5.57 mg/L,處理后的發(fā)酵液pH相較于其他四株酵母都要低,為8.41。此外,R-30菌株可以以乳酸為惟一碳源生長,但是其他特性相對較差。綜合考慮,選擇R-70菌株作為利用米漿水的最優(yōu)菌株。

    表3 菌株在BAS中的培養(yǎng)篩選結(jié)果Table 3 Results of strain inoculated in BAS

    2.3 菌株的形態(tài)特征

    R-70菌株菌落呈橘紅色,表面濕潤,邊緣平滑,易挑起。菌體呈橢球形,大小約為(3.0~4.5)μm×(6.0~9.5) μm,以出芽方式進行繁殖,見圖 1。

    圖1 R-70菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological character of R-70

    2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    以通用引物進行PCR擴增,經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳,得到片段長度大約為600 bp的擴增產(chǎn)物,見圖2。

    圖2 菌株R-70的26S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 26S rRNA of R-70

    回收并純化PCR產(chǎn)物,進行測序。將測得的DNA序列在NCBI上用BLASTN進行同源性比較,用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining分析方法進行分子系統(tǒng)分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。

    圖3 R-70的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain R-70

    結(jié)果表明,菌株R-70與Sporidiobolus pararoseusNL8208205的同源性達到97%,親緣關(guān)系最近,由此可初步確定R-70菌株為Sporidiobolus pararoseus(近玫色鎖擲酵母)。

    2.5 菌株的的生理學(xué)特征

    2.5.1 糖發(fā)酵實驗 參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》,對R-70進行了糖的發(fā)酵實驗,結(jié)果見表4。R-70菌株對這幾種糖都不發(fā)酵產(chǎn)氣。

    表4 R-70的糖發(fā)酵實驗Table 4 Sugar fermentation tests of R-70

    2.5.2 碳氮源同化實驗及其他生理特征 對R-70菌株進行碳源、氮源同化實驗,脲酶試驗和生長溫度試驗,結(jié)果見表5。

    表5 R-70的生理生化特征Table 5 Physiological characteristic of R-70

    通過比對 《酵母菌的特征與鑒定手冊》,菌株R-70的生理特征鑒定結(jié)果為近玫色鎖擲酵母,與經(jīng)26S rDNA分子鑒定的結(jié)果一致。

    2.6 R-70菌株在BAS中的生長情況

    將近玫色鎖擲酵母R-70接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中,30℃、200r/min培養(yǎng)過夜,作為種子液,用無菌水洗滌兩次,以6%的接種體積分數(shù)接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h,每隔4小時取樣,測定細胞數(shù)、色素產(chǎn)量、pH,結(jié)果見圖4。

    圖4 R-70在米漿水中的生長情況Fig.4 Growth curves of R-70 inoculated in BAS

    由圖4可以看出,酵母數(shù)在36 h達到最大,為7.8×107/mL,之后呈緩慢下降趨勢,R-70所產(chǎn)色素主要是類胡蘿卜素,屬于次級代謝產(chǎn)物,36 h開始有一個較快的增加速度,在44 h達到一個較高值5.26 mg/L,之后緩慢增加,72 h的色素產(chǎn)量為5.92 mg/L。米漿水的初始pH為3.68,隨著培養(yǎng)時間的增加,米漿水的pH呈上升趨勢,在28 h左右pH升高速度加快,在44 h左右之后趨于平緩,升高速度變慢,72 h的pH達到8.44,可能與R-70產(chǎn)脲酶有關(guān),R-70在生長過程中產(chǎn)氨,使pH升高。

    2.7 米漿水成分的變化

    將R-70菌株接種YPD培養(yǎng)基中,30℃、200r/min培養(yǎng)過夜,作為種子液,用無菌水洗滌兩次,以6%的接種體積分數(shù)接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h,每隔4小時取樣,8 000 r/min離心5 min,測定上清液中的COD、還原糖和氨態(tài)氮,結(jié)果見圖5。

    BAS的初始COD為51 806 mg/L,接種R-70培養(yǎng)后上清液的COD變化見圖5。到44 h達到最低,COD為4 600 mg/L,COD去除率達到91.12%,之后呈升高趨勢。還原糖呈現(xiàn)下降趨勢,40 h下降到一個較低值,之后基本保持不變。上清液中氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化與R-70菌株產(chǎn)脲酶有關(guān),在前期質(zhì)量濃度較低,隨著培養(yǎng)時間的延長而緩慢增加,40 h左右之后增加速度加快,72 h的氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.45 g/L,R-70在發(fā)酵過程中產(chǎn)氨的量可以將米漿水中的乳酸中和并且氨過量,使發(fā)酵液呈堿性。

    圖5 BAS發(fā)酵后上清液成分的變化情況Fig.5 Change of composition in BAS supernatant

    3 結(jié) 語

    黃酒生產(chǎn)中的浸米漿水產(chǎn)量大,營養(yǎng)物質(zhì)豐富。從環(huán)境中篩選到一株紅色酵母R-70,經(jīng)過26S rDNA分子鑒定,確定該酵母為近玫色鎖擲酵母,在米漿水中培養(yǎng),可以有效地降解米漿水的COD,減輕廢水處理的壓力,而且可以產(chǎn)生高附加值的單細胞蛋白和類胡蘿卜素,具有良好的應(yīng)用價值。

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