丹參總酚酸純化工藝研究

徐桃枝 晏永新 何愛英 廖春玲

(1.江西省醫(yī)藥學(xué)校，江西 南昌 330200；2.江西新世紀(jì)民星動(dòng)物保健品有限公司，江西 南昌 330096)

引言

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根莖，其有效成分包括水溶性成分和脂溶性成分[1]。丹參是活血化瘀的常用中藥，廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病的中藥復(fù)方中。水溶性丹參酚酸類是丹參的主要有效成分之一，具有抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化和改善記憶功能障礙等作用[2]，是治療冠心病的主要有效成分[3-4]，其中丹酚酸B約占70%。丹參水溶性成分的提取方法多采用水提醇沉法，此方法溶劑消耗大，有效成分有明顯損失。本研究采用分離效果較好的大孔樹脂分離技術(shù)，對(duì)丹參總酚酸進(jìn)行純化研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對(duì)照品丹參酚酸B，中國藥品生物制品檢定所提供；丹參購于江西省樟樹中藥材市場(chǎng)；AB-8，D101，NKA-9型大孔吸附樹脂；Agilent 1200型液相色譜儀，VWD檢測(cè)器，含在線真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱；色譜數(shù)據(jù)的采集與處理由Agilent化學(xué)工作站完成；超聲波清洗儀；電子天平(十萬分之一)；甲醇為分析純和色譜純兩種，乙醇；甲酸；水為重蒸餾水等。

1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

采用HPLC法測(cè)定樣品中丹參酚酸B的含量。取丹參酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成1mL含丹參酚酸B149.76μg的對(duì)照品溶液，分別精密吸取2、4、6、8、12、16、20μL，注入色譜儀，按照以下方法測(cè)定：色譜柱：迪馬DiamonsiLTM(鉆石)C18(5m，250×4.6mm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.4%甲酸(37∶7∶56)；檢測(cè)波長：285nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min。以對(duì)照品的濃度(μg/ml，X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到丹參酚酸B線性方程為：

y=1443.8x-4.3685(r=0.9997)，線性范圍為0.3744～3.744μg。該方法線性關(guān)系良好，回收率為99.89%。

2 純化工藝研究

2.1 純化方法的比較

據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，醇沉法是中藥水提取液常用的精制方法，但其對(duì)化學(xué)成分影響較大，近年來，隨著大孔樹脂吸附法的興起，取代傳統(tǒng)醇沉法的研究越來越多。為了確定較好的精制方法，本研究對(duì)這兩種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果見表1。

(1)醇沉法

取丹參提取樣品液(1g生藥材·mL-1)800mL，均分為8份，每份100mL，每份相當(dāng)于100g生藥，加乙醇至含醇量分別為50%、60%、70%、80%，每一濃度平行各做2份。冷藏過夜，抽濾，濾液定容到500mL，精密吸取5mL至100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，測(cè)定浸膏得率，并用HPLC法測(cè)定丹酚酸B的含量。

(2)大孔樹脂吸附法

取丹參提取樣品液(1g生藥材·mL-1)200mL，均分為2份，每份100mL，每份相當(dāng)于100g生藥，分別離心(4000r/min，15min)，倒出上清液，加適量的水返溶沉淀部分，離心，合并兩次離心液，上AB-8型大孔吸附樹脂柱(生藥量：樹脂量=2：1)。待藥液流盡后，加入蒸餾水洗到Molish反應(yīng)為陰性，再用30%的乙醇洗脫有效成分。將洗脫液濃縮，定容至500mL，精密吸取5mL至100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，測(cè)定浸膏得率，并用HPLC法測(cè)定丹酚酸B的含量。

表1 不同的精制方法的比較研究

醇沉法浸膏得率明顯高于大孔樹脂吸附法，且提取物中丹酚酸B的含量較低，不符合除雜精制的要求。大孔樹脂吸附法對(duì)丹酚酸B保留率和醇沉法沒有很大的差異，但提取物中丹酚酸B的含量將近40%，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)精制的要求，故選用大孔樹脂吸附法純化精制丹參水溶性成分。

2.2 大孔樹脂純化工藝參數(shù)考察與優(yōu)化

2.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理與再生

預(yù)處理：將大孔樹脂用95%乙醇浸泡24小時(shí)，再用95%乙醇洗至與水(1：2)混合不產(chǎn)生渾濁，用水漂洗除去雜質(zhì)并洗至無醇味，以水濕法裝柱，用大量的蒸餾水沖洗后備用。

強(qiáng)化再生：使用過的樹脂先用95%乙醇洗至流出液無色，用水洗至無醇味，再加入高于樹脂層10CM的3%～5%鹽酸溶液浸泡2-4小時(shí)，然后進(jìn)行淋洗通柱繼用3～4倍樹脂體積同濃度的鹽酸溶液通柱，然后用凈水洗至接近中性；再用3%～5%的氫氧化鈉溶液浸泡4小時(shí)。最后淋洗通柱，用同濃度的3～4倍樹脂體積的氫氧化鈉溶液通柱，最后用凈水清洗至pH值為中性，備用。

2.2.2 樹脂篩選

將0.5g生藥/mL(丹酚酸B的濃度為10.88mg/mL)樣品液分別通過3種不同型號(hào)的已預(yù)處理好的樹脂柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。用三氯化鐵試劑檢查流出液，待反應(yīng)呈陽性時(shí)，停止上樣，記錄上柱量，計(jì)算總酚酸吸附量。樹脂柱用水洗脫至洗脫液近無色，再用95%乙醇洗脫至洗脫液無色，測(cè)定洗脫液中丹酚酸B含量，將乙醇洗脫液蒸干，稱重，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 樹脂篩選結(jié)果

注：吸附量為單位干樹脂吸附的總量，單位g/g或mg/g。下同。

由表2可知，在篩選的3種不同極性的大孔樹脂中，用弱極性的AB-8樹脂分離純化丹參酚酸B的效能明顯優(yōu)于其它2種樹脂，故選用AB-8樹脂純化丹參水溶性成分丹參酚酸。

2.2.3 上樣濃度的確定

將不同濃度樣品液分別通過AB-8樹脂柱(20g干樹脂)進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。用三氯化鐵試劑檢查流出液，待反應(yīng)呈陽性時(shí)，停止上樣，記錄上柱量，計(jì)算總酚酸吸附量。結(jié)果見表3。從表3可知，上樣濃度以0.5g生藥/mL(丹酚酸B的濃度為10.88mg/mL)為宜。

表3 上樣濃度確定

2.2.4 吸附流速確定

將濃度為0.5g生藥/mL的樣品液通過AB-8樹脂柱(20g干樹脂)，分別以1、2和3mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。用三氯化鐵試劑檢查流出液，待反應(yīng)呈陽性時(shí)，停止上樣，記錄上柱量，計(jì)算總酚酸吸附量。結(jié)果見表4。從表4可知，吸附流速以1mL/min為宜。

表4 吸附流速確定

2.2.5 泄漏曲線考察

按上述所確定的吸附條件，取樣品液通過AB-8樹脂柱(36g干樹脂)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，棄去前10mL流出液后開始分段收集。每10mL收集1份，共收集11份。每份流出液精密吸取1mL，加蒸餾水稀釋至50mL，測(cè)定丹酚酸B的含量。結(jié)果見表5。據(jù)此繪制泄漏曲線(圖1)。

表5 泄漏曲線考察結(jié)果

圖1 泄漏曲線

從測(cè)定結(jié)果和泄漏曲線可知，第5份丹酚酸B濃度開始急劇增大，說明此時(shí)丹酚酸開始泄漏，故確定樣品液最大上柱體積為60mL，計(jì)算丹酚酸B最大吸附量為18.65mg/g，相當(dāng)于0.83g生藥材/g干樹脂。

2.2.6 洗脫溶媒的選擇

按上述所確定的吸附條件，取樣品液(0.5g生藥/mL)30mL上AB-8大孔樹脂柱(30g干樹脂)，依次用蒸餾水200mL，10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇各100 mL梯度洗脫，蒸餾水洗脫液收集50mL4份，10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫液分別收集50mL 4份。測(cè)定丹酚酸B含量，以瓶號(hào)和丹酚酸B含量為坐標(biāo)繪制洗脫曲線，見圖2。

1-4號(hào)水洗脫液；5-8號(hào)10%乙醇洗脫液；9-12號(hào)20%乙醇洗脫液；13-16號(hào)30%乙醇洗脫液；17-20號(hào)50%乙醇洗脫液；21-24號(hào)70%乙醇洗脫液；25-28號(hào)95%乙醇洗脫液 圖2 丹酚酸B大孔樹脂吸附梯度洗脫曲線圖

梯度洗脫曲線顯示：丹酚酸B主要集中在30%乙醇以前的洗脫液中，其中10%，20%和30%的洗脫液中丹酚酸B總量占全部醇洗脫的88.7%，而三者當(dāng)中30%乙醇洗脫的解吸速度最快，故選用30%乙醇作為洗脫溶媒。

2.2.7 洗脫流速確定

按上述所確定的吸附條件進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附后，AB-8大孔樹脂柱(30g干樹脂)先分別用水洗脫至洗脫液近無色，再以50%乙醇為洗脫劑，分別以1、2和3mg/mL的流速進(jìn)行洗脫。分別測(cè)定乙醇洗脫物中丹酚酸B含量。結(jié)果見表6。從表6可知，洗脫流速以1mL/min為宜。

2.2.8 洗脫曲線考察

按上述所確定的吸附和洗脫條件，取樣品液50mL(0.5g生藥/mL)進(jìn)行上柱(30g干樹脂)、吸附和洗脫，分段收集洗脫液。收集水洗脫液2份，每份為125mL，30%乙醇洗脫液13份，每份25mL，共收集15份。分別測(cè)定丹酚酸B含量，結(jié)果見表7。據(jù)此繪制洗脫曲線，見圖3。

從表7及洗脫曲線可知，第12份洗脫液的含量已明顯降低，故確定洗脫劑用量為10倍藥材量。

2.2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

按確定的上述工藝條件，做3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表8。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由以上重復(fù)性實(shí)驗(yàn)可知，該大孔樹脂的除雜工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)中常用水提法提取丹參中總酚酸，水提取液中雜質(zhì)較多，如無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、糖、鞣質(zhì)等，使得到的水提取液中丹參總酚酸的濃度較低。為了提高提取液中酚酸類物質(zhì)的濃度，常采用醇提水沉淀法、吸附澄清法、高速離心法、超濾法等方法進(jìn)行分離純化處理。但這些操作往往具有有效成份損失較高、生產(chǎn)周期長、分離處理成本高等缺點(diǎn)。大孔吸附樹脂具有吸附量大、解吸和再生容易等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于中藥行業(yè)中，本文試驗(yàn)結(jié)果表明，其可用于丹參總酚酸的分離純化。

3.2 樹脂洗脫試驗(yàn)中，常用的洗脫劑有乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，為減少對(duì)產(chǎn)品刺激性的影響及保護(hù)環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為洗脫劑，丹參總酚酸主要集中在30%乙醇洗脫液中，50%洗脫液中雖然有一定量，但總酚酸的含量明顯偏低，而70%～90%洗脫液中幾乎不含丹參總酚酸，由此可預(yù)測(cè)，乙醇的洗脫濃度范圍應(yīng)在30%～50%范圍內(nèi)，進(jìn)而采用動(dòng)態(tài)洗脫方法，確定了乙醇的最佳濃度。

[1]高霞，王著明，等.不同水提醇沉法純化丹參總酚酸工藝的比較[J].吉林醫(yī)學(xué)，2009，30(7)：614.

[2]戈升榮，俞一心，謝更新.丹酚酸的藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2002，25(9)：683-685.

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[4]王雨華，周學(xué)謙.丹參多酚酸類分析方法及制備工藝的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2017，7(40)：1012.

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