皮質(zhì)酮誘導(dǎo)小鼠抑郁伴發(fā)的學(xué)習(xí)記憶損傷

范琳犀，楊玉潔，姜 寧，陳遠(yuǎn)偉，劉新民*，王 瓊*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院/中葡中醫(yī)藥國際合作中心，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，四川 滬州 646000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所， 北京 100193； 4.云南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，昆明 650500)

現(xiàn)代社會高強(qiáng)度、高壓力的生活和工作，使人們的身心長期處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致抑郁癥頻發(fā)[1]。大量研究表明隨著病情的發(fā)展，抑郁癥患者出現(xiàn)不同程度的學(xué)習(xí)記憶障礙[2-3]。用皮質(zhì)酮給藥常用于抑郁動物模型的建立[4-5]，國外對皮質(zhì)酮口服4周用于誘導(dǎo)的動物抑郁樣行為表現(xiàn)伴發(fā)學(xué)習(xí)記憶能力影響也有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過皮頸下注射不同劑量的皮質(zhì)酮，觀察動物抑郁樣行為的改變，進(jìn)而研究其對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，為抑郁伴發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙及其防護(hù)藥物的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，60只，6～8周齡，體重(20±1)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司提供[SCXK(京)2016-0011]。實(shí)驗(yàn)期間喂養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)動物房[SYXK(京)2013-0023]，供給充足的標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔水，光照時(shí)間12 h/12 h(照明/黑暗)，室溫22℃～25℃，濕度條件為(55±10)%。動物適應(yīng)喂養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動物3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

皮質(zhì)甾酮(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，7XJCB-GP)；吐溫-80(Sigma，P1754)；二甲基亞砜(DMSO，Amresco，3116C455)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司，D16081311)。

小鼠自主活動實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)、小鼠懸尾實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)、小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)、小鼠水迷宮實(shí)時(shí)測試系統(tǒng)(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員科研訓(xùn)練中心和北京康森益友科技有限公司聯(lián)合研發(fā))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及給藥

C57BL/6J小鼠40只按體重分成4組，空白組、皮質(zhì)酮20 mg/kg低劑量組、皮質(zhì)酮40 mg/kg中劑量組和皮質(zhì)酮80 mg/kg高劑量組，每組10只。C57BL/6J小鼠20只按體重分為2組，空白組、皮質(zhì)酮40 mg/kg組，每組10只?？瞻捉M皮下注射含0.1% DMSO(二甲亞砜)和0.1% 吐溫-80的0.9%氯化鈉注射液的溶媒，皮質(zhì)酮組皮下注射皮質(zhì)酮溶液(含溶媒，使用前混勻)，給藥體積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)造模21 d[6-7]，行為學(xué)檢測期間依然給予皮質(zhì)酮注射。

1.3.2 空場實(shí)驗(yàn)[8-9]

在自主活動實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)測試箱中心將小鼠輕輕放下，適應(yīng)3 min，然后計(jì)算機(jī)監(jiān)測動物在后10 min內(nèi)總的及中央?yún)^(qū)的運(yùn)動路程、運(yùn)動時(shí)間、運(yùn)動速度等指標(biāo)，分析動物的自發(fā)活動情況。

1.3.3 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)[10-11]

將小鼠以倒掛的狀態(tài)固定于懸尾實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)箱中, 調(diào)整支架高度，從而使小鼠懸空大約離箱底5 cm，適應(yīng)2 min, 軟件自動統(tǒng)計(jì)小鼠后4 min的不動時(shí)間。

1.3.4 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[12-13]

用強(qiáng)迫游泳監(jiān)測小鼠的活動狀況。將小鼠置于小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)桶中，水溫為25℃，適應(yīng)2 min, 軟件自動統(tǒng)計(jì)小鼠后4 min內(nèi)的不動時(shí)間。

1.3.5 物體位置識別實(shí)驗(yàn)[14-15]

該實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)階段：適應(yīng)期、熟悉期、測試期。適應(yīng)期3 d，每天將實(shí)驗(yàn)動物單個(gè)放入物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，熟悉10 min。第4天，熟悉期時(shí)，將兩個(gè)完全相同的物體放入試驗(yàn)箱內(nèi)相鄰的磁鐵處固定，記錄小鼠5 min內(nèi)對兩物體的探索總時(shí)間。間隔30 min后，進(jìn)入測試期。測試期將其中一個(gè)物體移到另一物體的斜對角，記錄5 min內(nèi)小鼠對兩物體的探索時(shí)間。用辨別指數(shù)(DI)來評價(jià)動物的學(xué)習(xí)記憶能力，辨別指數(shù)計(jì)算公式為DI=(N-F)/(N+F)×100%，其中N為新物體探索時(shí)間，F(xiàn)為熟悉物體探索時(shí)間。

1.3.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[16-17]

用小鼠水迷宮實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測小鼠的活動狀況。實(shí)驗(yàn)分為定位導(dǎo)航階段和空間探索階段。定位航行階段，共6 d，每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練前后各適應(yīng)15 s，檢測時(shí)間為90 s，若時(shí)間范圍內(nèi)找到平臺，算作尋臺成功并記錄其逃避潛伏期；若動物沒有發(fā)現(xiàn)平臺，訓(xùn)練結(jié)束，其逃避潛伏期記錄為90 s?？臻g探索階段，撤去平臺，將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，監(jiān)測其在90 s內(nèi)動物的總游程、平均速度，以及穿過原平臺所在位置的速度和穿臺次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同劑量皮質(zhì)酮對小鼠空場實(shí)驗(yàn)的影響

如表1所示，與空白組比較，皮質(zhì)酮組20 mg/kg能減少空場實(shí)驗(yàn)中的中央?yún)^(qū)運(yùn)動路程和中央?yún)^(qū)運(yùn)動路程比率(P<0.05)；皮質(zhì)酮組40 mg/kg能明顯減少空場實(shí)驗(yàn)中的中央?yún)^(qū)路程/時(shí)間、中央?yún)^(qū)運(yùn)動路程/時(shí)間、中央?yún)^(qū)運(yùn)動路程比率/時(shí)間比率(P<0.05)；皮質(zhì)酮組80 mg/kg能明顯減少空場實(shí)驗(yàn)中的中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)運(yùn)動路程/時(shí)間、中央?yún)^(qū)運(yùn)動路程比率(P<0.05)；而皮質(zhì)酮各劑量組的總路程、運(yùn)動時(shí)間和運(yùn)動速度等指標(biāo)與空白組相比，差異無顯著性。

2.2 不同劑量皮質(zhì)酮對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的影響

如圖1所示，與空白組相比較，皮質(zhì)酮組40,80 mg/kg的懸尾不動時(shí)間顯著增長(P<0.05或P< 0.01)。

2.3 皮質(zhì)酮40 mg/kg對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動時(shí)間的影響

研究皮質(zhì)酮40 mg/kg對小鼠抑郁樣行為的影響，結(jié)果如圖3所示，皮質(zhì)酮組的懸尾不動時(shí)間與空白組相比較明顯增加(P< 0.05)；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)皮質(zhì)酮組的不動時(shí)間顯著高于空白組(P< 0.01)。

2.4 中劑量皮質(zhì)酮對小鼠物體位置識別實(shí)驗(yàn)的影響

選用40 mg/kg皮質(zhì)酮造模，研究其對小鼠物體位置識別影響，如圖4所示，在熟悉期，與空白組比，皮質(zhì)酮給藥組小鼠對物體探索總時(shí)間減少，但差異無顯著性；在檢測期，與空白組比較，皮質(zhì)酮給藥組小鼠的相對辨別指數(shù)顯著降低(P< 0.05)。

表1 不同劑量皮質(zhì)酮對小鼠的空場實(shí)驗(yàn)的影響Tab.1 Effect of different doses of corticosterone on open-field test in the mice

注：與空白組相比較，*P< 0.05。

Note.Compared with the control group，*P< 0.05.

注：(A)空白組；(B)皮質(zhì)酮組20 mg/kg；(C)皮質(zhì)酮組40 mg/kg；(D)皮質(zhì)酮組80 mg/kg；與空白組相比較，*P< 0.05。圖1 不同劑量皮質(zhì)酮對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動時(shí)間的影響Note.(A)Control group.(B)Corticosterone 20 mg/kg group.(C)Corticosterone 40 mg/kg group.(D)Corticosterone 80 mg/kg group. Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.1 Effect of different doses of corticosterone on immobility time in tail suspension test of the mice

注：與空白組相比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 皮質(zhì)酮40 mg/kg對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動時(shí)間的影響Note.Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 Effect of corticosterone 40 mg/kg on immobility time in tail suspension test and forced swimming test of the mice

2.5 中劑量皮質(zhì)酮對小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

選用40 mg/kg皮質(zhì)酮造模，研究其對小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果如圖3所示，在小鼠水迷宮空間探索階段，皮質(zhì)酮組相對于空白組逃避潛伏期均增加，在第3、4、6天的潛伏期明顯多于空白組(P< 0.05)；如圖5所示，在小鼠水迷宮空間探索階段，與空白組比較，皮質(zhì)酮組在水迷宮空間探索的目標(biāo)象限穿臺次數(shù)、總游程、平均速度、目標(biāo)想象游程、目標(biāo)象限速度有明顯下降(P< 0.05)。

注：與空白組相比較，*P< 0.05。圖3 皮質(zhì)酮40 mg/kg對小鼠水迷宮定位導(dǎo)航階段潛伏期的影響Note.Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.3 Effects of corticosterone 40 mg/kg on the escape latency in Morris water maze (place navigation) of the mice

3 討論

皮質(zhì)酮是嚙齒類動物腎上腺皮質(zhì)中合成的主要腎上腺皮質(zhì)激素(即糖皮質(zhì)激素)，用于調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和代謝過程。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)HPA軸與腎上腺皮質(zhì)激素相互調(diào)節(jié)維持機(jī)體的功能[18]，而長期大量的腎上腺皮質(zhì)激素的攝入可導(dǎo)致HPA軸功能的紊亂，從而導(dǎo)致抑郁癥癥狀的出現(xiàn)[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)長期、高水平的糖皮質(zhì)激素可激活海馬糖皮質(zhì)激素受體，造成海馬組織的損傷，出現(xiàn)情緒及學(xué)習(xí)記憶障礙[21-22]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑郁癥可導(dǎo)致認(rèn)知功能的改變[23]。據(jù)Gregus等[24]的研究發(fā)現(xiàn)不斷重復(fù)的給予動物大量的皮質(zhì)酮可導(dǎo)致動物抑郁樣行為的改變，且傷害性小周期相對較短，為進(jìn)一步探討皮質(zhì)酮注射對機(jī)體的影響，本實(shí)驗(yàn)通過皮質(zhì)酮皮頸下注射的方式，通過空場、懸尾、強(qiáng)迫游泳、物體位置識別、水迷宮等實(shí)驗(yàn)來系統(tǒng)觀察皮質(zhì)酮對動物的抑郁樣行為伴發(fā)學(xué)習(xí)記憶能力改變。

研究報(bào)道在空場實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)動物在中央?yún)^(qū)的運(yùn)動路程等指標(biāo)顯著減少時(shí)，顯示動物對新環(huán)境的好奇度降低，表現(xiàn)出抑郁癥樣的特征[25]；在懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時(shí)間增加則是“絕望”無助樣行為的表現(xiàn)[26]，當(dāng)動物出現(xiàn)抑郁樣行為時(shí)主要表現(xiàn)為快感缺失和無助樣行為。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中、高劑量給藥組在空場實(shí)驗(yàn)中能明顯減少動物在中央?yún)^(qū)的路程、時(shí)間、運(yùn)動路程比率、運(yùn)動時(shí)間比率，表明模型動物對新環(huán)境的好奇度降低，在懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，模型動物的懸尾和強(qiáng)迫游泳的不動時(shí)間顯著增加，說明慢性皮質(zhì)酮皮下注射給藥引起了小鼠抑郁樣行為的改變，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[27-28]。

注：(A)空白組；(B)皮質(zhì)酮組40 mg/kg；與空白組相比較，*P< 0.05。圖4 皮質(zhì)酮40 mg/kg對小鼠物體位置識別實(shí)驗(yàn)的探索總時(shí)間和相對辨別指數(shù)的影響Note.(A)Control group.(B)Corticosterone 40 mg/kg. Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.4 Effect of corticosterone 40 mg/kg on the total exploration time and discrimination index of object location recognition in the mice

注：(A)總游程/cm；(B)目標(biāo)象限游程/cm；(C)平均速度/cm/s；(D)目標(biāo)象限速度/cm/s；(E)目標(biāo)象限穿臺次數(shù)；與空白組相比較，*P< 0.05。圖5 皮質(zhì)酮40 mg/kg對小鼠水迷宮空間探索階段活動的影響Note.(A)Swimming distance, cm.(B)Swimming distance in target quadrant, cm.(C)Swimming speed, cm/s.(D)Swimming speed in target quadrant, cm/s.(E)Number of target crossing. Compared with the control group,*P< 0.05.Fig.5 Effects of corticosterone 40 mg/kg on mice in the Morris water maze (spatial probe) test

物體位置識別實(shí)驗(yàn)用于評估短期空間學(xué)習(xí)能力的方法，是檢測動物對新穎物體偏好性原理基礎(chǔ)上的自發(fā)狀態(tài)下的物體識別記憶能力的一種方法[29]。在物體位置識別實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)酮慢性皮下注射給藥能使小鼠對物體位置識別的相對辨別指數(shù)顯著減少，說明皮質(zhì)酮損害了小鼠的物體位置識別能力[30]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是用于評價(jià)動物的長期空間記憶和參考記憶的實(shí)驗(yàn)方法[31]，且定位航行的潛伏期和空間探索階段的穿臺次數(shù)主要用于動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究采用慢性皮下注射的方式給予小鼠皮質(zhì)酮3周后，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)酮組動物在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的定位航行潛伏期顯著增加，在空間探索期在平臺象限的總游程、平均速度、游程、速度均有明顯下降，且穿臺次數(shù)明顯降低，表明皮質(zhì)酮慢性皮下注射損害了動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。本實(shí)驗(yàn)從短期和長期的實(shí)驗(yàn)方法檢測中發(fā)現(xiàn)，小鼠的空間學(xué)習(xí)能均受到損傷。

綜上，本研究通過連續(xù)21 d慢性皮下注射的方式給予小鼠皮質(zhì)酮40 mg/mL，誘導(dǎo)了小鼠抑郁樣行為的改變，同時(shí)也對動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力造成了損傷，為抗抑郁藥物的開發(fā)提供初步的參考。

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