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    肉豆蔻-8散提取物對過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

    2018-05-04 07:58:23張媛彥肖云峰李文妍王玉華
    中國藥科大學(xué)學(xué)報 2018年2期
    關(guān)鍵詞:肉豆蔻胰酶培養(yǎng)液

    張媛彥,肖云峰,李文妍,王玉華*

    (1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,呼和浩特010110;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心,呼和浩特010110;3內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院,呼和浩特010110)

    肉豆蔻-8散是由沉香、肉豆蔻、丁香、廣棗、木香、旋覆花、阿魏和牦牛心八味藥材組成,該方最早收錄于《普濟方集》中[1]。目前該方劑被《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》第二冊收錄[2]。該方具有鎮(zhèn)“赫依”、止痛、溫胃、祛“巴達干”、燥“協(xié)日烏素”的功效,臨床用于各種“赫依”病、心“赫依”熱、心煩、氣短、失眠、心供血不足、心區(qū)疼痛、風(fēng)濕性心臟病等。目前,本課題組對于肉豆蔻-8散的研究主要包括有效成分的含量測定、動物實驗?zāi)P偷乃幮W(xué)研究和藥代動力學(xué)分析等[3-6]。課題組還對肉豆蔻-8散提取物的主要成分進行指認(rèn)和定量分析,其有效成分包括丁香酚、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯和去氫二異丁香酚等。肖云峰等[7]運用整體動物試驗及測定內(nèi)源性物質(zhì)含量的方法,已從體內(nèi)評價了該方劑對實驗動物心臟的保護作用。

    乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)是一種可以排除體液、神經(jīng)等干擾因素并保持心肌結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的體外實驗研究模型。高效、穩(wěn)定的培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞有助于從細(xì)胞層面探討心血管疾病的發(fā)病機制及其治療手段[8]。H2O2作為高活性反應(yīng)分子性氧簇(ROS)之一,極易通過細(xì)胞膜,它可以通過Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生OH-,從而導(dǎo)致膜脂過氧化、DNA鏈斷裂和蛋白質(zhì)的損傷[9]。H2O2易獲得、性質(zhì)穩(wěn)定且應(yīng)用方便,常被用做體外氧化應(yīng)激損傷模型建立的工具[10]。因此,本實驗采用體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞的方法,利用H2O2模擬體內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷,首次從細(xì)胞層面進一步研究肉豆蔻-8散提取物對心肌的保護作用,以綜合評價肉豆蔻-8散的臨床應(yīng)用價值及其可能的作用機制。

    1 材 料

    1.1 肉豆蔻-8散提取物的制備

    稱取肉豆蔻-8散10.0 g于500 mL圓底燒瓶中,加入75%乙醇250 mL,加熱回流2次,每次30 min,合并濾液,蒸干得浸膏約3 g。取肉豆蔻-8散提取物約10 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加入DMSO 100μL使其完全溶解,用無血清培養(yǎng)液稀釋至刻度,配成1 mg/mL肉豆蔻-8散提取物原液。用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,4℃保存,使用時稀釋成相應(yīng)濃度。

    1.2 試 劑

    肉豆蔻-8散(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院制備);DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Hyclone公司);胰蛋白酶(中國Biotopped公司);Ⅱ型膠原酶(德國Sigma公司);30%過氧化氫(天津永晟精細(xì)化工有限公司);DMSO(中國Coolaber公司);MTT(美國 Amresco公司);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)研究所);BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);lactate dehydrogenase(LDH)、creatine kinase(CK)、aspartate aminotransferase(AST)(寧波美康生物科技股份有限公司);Superoxide dismutase(SOD)、malonydialdehyde(MDA)、NO試劑盒(南京建成生物工程研究所);細(xì)胞凋亡試劑盒(美國BD公司)。

    1.3 儀 器

    超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司);倒置式生物顯微鏡(德國Leica公司);酶標(biāo)儀(日本Bio-rad公司);全自動生化分析儀(愛爾蘭Sapphire公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

    1.4 動 物

    清潔級,Wistar乳鼠,1~3 d齡,體重(6.66±2.00)g,購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(蒙)2014-0001。

    2 方 法

    2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

    實驗操作在無菌條件下進行。取1~3 d齡Wistar乳鼠,浸泡75%酒精消毒。用眼科剪沿劍突正中線略偏左側(cè)剪取心臟心尖部,置預(yù)冷的PBS緩沖溶液中清洗3遍,將其轉(zhuǎn)移入0.1%胰酶中,均勻剪成約1 mm3的碎塊,棄上清液。加入0.1%胰酶6 mL吹打管吹打,37℃水浴消化6 min,不斷振搖,自然沉降后,棄上清液。再加入0.08%胰酶與0.05%Ⅱ型膠原酶的混合酶5 mL于37℃水浴消化5 min,中間振搖3 min,吸取上清液,用等體積預(yù)冷含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化,重復(fù)消化10次。細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾至離心管中,1 000 r/min,離心 10 min。用含 20%FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)1 h,以差速貼壁的方法去除已貼壁的成纖維細(xì)胞。吸出細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中,加入終濃度為0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶40μL,以抑制成纖維細(xì)胞的生長,繼續(xù)培養(yǎng),48 h后換液。取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞用于實驗。

    2.2 分組及給藥

    實驗共分為5組:正常對照組、模型組、肉豆蔻-8散(高、中、低)劑量組。正常對照組加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng),作用12 h后換液,繼續(xù)用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h;模型組加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng),作用12 h后換液,加入終濃度為100μmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)液,作用2 h;肉豆蔻-8散低、中、高劑量組分別加入終濃度為25、50、100μg/mL含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液,作用12 h后換液,再加入終濃度為100μmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)液,作用2 h。

    2.3 MTT法檢測心肌細(xì)胞活力

    2.3.1 H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型的建立 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度每毫升3×105個,在96板上每孔接種100μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,吸棄原培養(yǎng)液。正常對照組每孔加入無血清培養(yǎng)液100μL;模型組每孔加入H2O2終濃度分別為25、50、100、200、400μmol/L無血清培養(yǎng)液 100μL。在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,每孔加入 MTT溶液(0.5 mg/mL)20μL,繼續(xù)孵育4 h,吸棄原培養(yǎng)液,每孔加入 DMSO 150μL,振蕩10 min,于酶標(biāo)儀490 nm處讀取吸收度,計算細(xì)胞抑制率。

    2.3.2 肉豆蔻-8散提取物對正常心肌細(xì)胞的影響取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升3×105個,在96板上每孔接種100μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,吸棄原培養(yǎng)液。正常對照組每孔加入無血清培養(yǎng)液100μL;給藥組每孔加入含肉豆蔻-8散提取物終濃度分別為 25、50、100μg/mL的無血清培養(yǎng)液100μL。在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后,采用MTT法檢測心肌細(xì)胞活力。

    2.3.3 肉豆蔻-8散提取物對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升3×105個,在96板上每孔接種100μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作,孵育2 h結(jié)束后,于倒置顯微鏡下觀察各孔中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,并采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率為各組吸收度和正常組吸收度的比值。

    2.4 生化指標(biāo)檢測

    2.4.1 培養(yǎng)液中LDH、CK、AST含量的檢測 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升6×105個,在6板上每孔接種2 mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作,孵育2 h結(jié)束后,分別收集各孔培養(yǎng)液。1 000 r/min,離心7 min,吸取上清液至離心管中,每組平行處理6份。采用全自動生化分析儀對處理好的樣本進行檢測,檢測指標(biāo)包括LDH、CK和AST。

    2.4.2 細(xì)胞中MDA、SOD、NO含量的檢測 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升6×105個,在6板上每孔接種2 mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作,孵育2 h結(jié)束后,棄去每孔培養(yǎng)液,每孔加入PBS緩沖液2 mL,用細(xì)胞刮刀收集各組細(xì)胞并重懸,1 000 r/min,5 min,棄上清液。用 RIPA裂解液于冰臺上裂解細(xì)胞,進行BCA定量,嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書測定細(xì)胞中MDA、SOD、NO的含量。

    2.5 肉豆蔻-8散提取物對H2 O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷凋亡的影響

    2.5.1 Hoechst染色觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài) 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)細(xì)胞密度為每毫升2×105個,在24孔板上每孔接種0.5 mL,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作,孵育2 h結(jié)束后,棄去每孔培養(yǎng)液。每孔加入Hoechst 33342染液250μL,避光孵育30 min,棄去染液,PBS緩沖液清洗3次,于熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)。

    2.5.2 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個,在6板上每孔接種2 mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作,孵育2 h結(jié)束后,分別收集各孔培養(yǎng)液。1 000 r/min,離心5 min,棄去上清液。用0.25%胰酶消化不同組別孔底的心肌細(xì)胞。消化過程終止后,1 000 r/min,離心5 min,棄去上清液。合并以上兩次所得細(xì)胞,用PBS緩沖液清洗2次,棄去PBS緩沖液,加入1×結(jié)合緩沖液100μL重懸細(xì)胞,按照AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒操作說明,1 h內(nèi)完成檢測。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計,所有數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié) 果

    3.1 H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型的建立

    與正常對照組比較,不同濃度的H2O2組均有極顯著性差異(P<0.01)。隨H2O2劑量增大,心肌細(xì)胞損傷率增加且呈濃度依賴性。其中,加入100μmol/L H2O2抑制率達到50%左右,符合實驗要求。因此,選擇100μmol/L H2O2作為實驗損傷模型。結(jié)果見圖1。

    Figure 1 H2 O2-induced cardiomyocyte injurymodel**P<0.01 vs control group

    3.2 肉豆蔻-8散提取物對正常心肌細(xì)胞的影響

    與正常對照組比較,各給藥組對心肌細(xì)胞活力無明顯影響(P>0.05)。這表明肉豆蔻-8散提取物對正常心肌細(xì)胞沒有影響,不會干擾后續(xù)肉豆蔻-8散提取物對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷影響的實驗結(jié)果。結(jié)果見圖2。

    Figure2 Effectof Roudoukou-8 San on normal cardiomyocytes(ˉx±s,n=6)

    3.3 肉豆蔻-8散提取物對H2 O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

    如圖3所示,與正常對照組比較,模型組吸收度顯著降低,細(xì)胞存活率顯著下降,說明模型組心肌細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)。25、50、100 μg/mL肉豆蔻-8散各劑量組與模型組相比,其細(xì)胞存活率均有所提高,且具有極顯著性差異(P<0.01)。肉豆蔻-8散低劑量組與高劑量組之間具有極顯著性差異(P<0.01),中劑量組與高劑量組之間具有顯著性差異(P<0.05)。說明肉豆蔻-8散提取物能明顯提高H2O2損傷心肌細(xì)胞的活力,且作用呈劑量依賴性,以高劑量組保護作用最佳。

    3.4 肉豆蔻-8散提取物對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)影響

    于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察,分組處理前,各組心肌細(xì)胞生長狀態(tài)良好。不同實驗組經(jīng)藥物干預(yù)之后,正常組呈單層簇狀生長,且偽足多而飽滿,搏動明顯,節(jié)律一致;H2O2模型組出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞數(shù)減少、細(xì)胞胞漿空泡、偽足少、細(xì)胞脫落、懸浮、溶解壞死等明顯損傷現(xiàn)象;肉豆蔻-8散各劑量組與H2O2模型組比較,心肌細(xì)胞形態(tài)不同程度好轉(zhuǎn),且以高劑量(100μg/mL)組改善效果最明顯。結(jié)果見圖4。

    Figure 3 Effects of Roudoukou-8 San on H2 O2-induced cardiomyocyte injury(ˉx±s,n=6)**P<0.01 vs Control;##P<0.01 vs Modol;△P<0.05,△△P<0.01 vs Roudoukou-8 San(100μg/mL)

    3.5 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK和AST的含量

    與正常對照組比較,模型組上清液中LDH、CK和AST釋放量顯著增加(P<0.01);與模型組相比,肉豆蔻-8散低劑量組(25μg/mL)、中劑量組(50μg/mL)、高劑量組(100μg/mL)上清液中LDH、CK和AST含量明顯下降(P<0.01),且隨著給藥組濃度增加呈劑量依賴性。結(jié)果見表1。

    3.6 心肌細(xì)胞中MDA、SOD、NO的含量

    與正常對照組相比,模型組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活力明顯降低(P<0.01),MDA和NO含量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,肉豆蔻-8散低劑量組(25μg/mL)心肌細(xì)胞內(nèi) SOD活力上升(P<0.05),中劑量組(50μg/mL)和高劑量組(100μg/mL)心肌細(xì)胞內(nèi) SOD活力明顯上升(P<0.01);各劑量肉豆蔻-8散給藥組均可明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)MOD和NO水平(P<0.01),且隨著給藥組濃度增加呈劑量依賴性。結(jié)果見表2。

    3.7 Hoechst染色觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)

    Hoechst熒光細(xì)胞核染色結(jié)果顯示,正常對照組心肌細(xì)胞成均一的核染,且未見異常核,見圖5-A;模型組細(xì)胞呈典型凋亡狀態(tài),鏡下可見染色質(zhì)濃集、核固縮、核碎裂、細(xì)胞數(shù)量少等多種凋亡形態(tài)學(xué)特征,見圖5-B;肉豆蔻-8散低、中、高劑量組可見核固縮、破裂等現(xiàn)象明顯減小、細(xì)胞數(shù)量較模型組增多,其細(xì)胞形態(tài)分別見圖5-C、5-D、5-E。

    3.8 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率

    結(jié)果顯示,正常對照組只有少部分細(xì)胞發(fā)生凋亡,見圖6-A;模型組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,見圖6-B;而肉豆蔻-8散各劑量組與模型組相比,細(xì)胞的凋亡情況明顯減少,但并不可以恢復(fù)至正常水平,見圖6-C、6-D、6-E。

    對流式細(xì)胞圖導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計算心肌細(xì)胞凋亡率,結(jié)果見表3。

    Table 1 Content of LDH,CK and AST in the culture solution of cardiomyocytes

    Table 1 Content of LDH,CK and AST in the culture solution of cardiomyocytes

    **P<0.01 vs control grop;##P<0.01 vs model groupLDH:Lactate dehydrogenase;CK:Creatine kinase;AST:Aspartate aminotransferase

    Group LDH(U/L) CK(U/L) AST(U/L)Control 20.18±4.93 5.38±1.14 2.10±0.42 Model 73.97±8.80** 12.13±1.26** 11.18±0.74**Roudoukou-8 San(25μg/mL) 53.55±5.22## 9.8±0.73## 7.90±0.69##Roudoukou-8 San(50μg/mL) 46.13±4.88## 8.58±0.66## 6.13±0.54##Roudoukou-8 San(100μg/mL) 27.15±5.13## 7.30±0.64## 4.03±0.46##

    Table 2 Contents of MDA,SOD,and NO in myocardial cells

    Table 2 Contents of MDA,SOD,and NO in myocardial cells

    *P<0.05,**P<0.01 vs control grop;##P<0.01 vs model group MDA:Malonydialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;NO:Nitric oxide

    Group MDA/(nmol/mg prot) SOD/(U/mg Hb) NO/(μmol/L)Control 0.65±0.12 67.92±8.51 6.24±1.49 Model 2.82±0.30** 35.38±5.79** 36.25±3.30**Roudoukou-8 San(25μg/mL) 1.99±0.16## 43.03±4.79* 27.13±4.28##Roudoukou-8 San(50μg/mL) 1.56±0.25## 50.30±5.14## 16.02±3.36##Roudoukou-8 San(100μg/mL) 0.95±0.12## 59.84±6.41## 10.10±2.13##

    Figure 5 Hoechst staining to observe the apoptoticmorphology of cardiomyocytesA:Control;B:Model;C:Roudoukou-8 San(25μg/mL);D:Roudoukou-8 San(50μg/mL);E:Roudoukou-8 San(100μg/mL)

    Figure 6 Flow cytometry detection ofmyocardial cell apoptosis rateA:Control;B:Model;C:Roudoukou-8 San(25μg/mL);D:Roudoukou-8 San(50μg/mL);E:Roudoukou-8 San(100μg/mL)

    Table 3 Apoptosis rate of cardiomyocytes detected by flow cytometry

    Table 3 Apoptosis rate of cardiomyocytes detected by flow cytometry

    **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model grop

    Group Apoptosis rate/%Control 3.68±0.69 Model 51.19±2.02**Roudoukou-8 San(25μg/mL) 35.90±2.14##Roudoukou-8 San(50μg/mL) 29.20±1.88##Roudoukou-8 San(100μg/mL) 15.82±1.81##

    結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型組有極顯著性差異(P<0.01),H2O2模型組細(xì)胞凋亡率顯著增加;與模型組比較,肉豆蔻-8散各劑量組均有極顯著性差異(P<0.01),肉豆蔻-8散各劑量組心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降,表明肉豆蔻-8散提取物可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,且凋亡率隨肉豆蔻-8散劑量的增加逐漸降低。

    4 討 論

    本研究對原代乳鼠心肌細(xì)胞進行分離和培養(yǎng),利用100μmol/L H2O2建立體外心肌氧化損傷模型。MTT檢測結(jié)果顯示,H2O2能夠使細(xì)胞活力顯著減低,肉豆蔻-8散提取物可以增加H2O2損傷心肌細(xì)胞的活力。通過倒置光學(xué)顯微鏡和Hoechst染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)肉豆蔻-8散提取物能夠顯著改善H2O2誘導(dǎo)狀態(tài)下心肌細(xì)胞形態(tài)、增高其存活率并降低其凋亡率。

    心肌酶活性變化是判斷心肌損傷的重要標(biāo)志。目前臨床上多以血清中LDH、CK、AST活性升高作為心肌缺血的早期診斷指標(biāo),LDH還可以作為衡量細(xì)胞壞死的指標(biāo)[11-12]。正常生理狀態(tài)下,心肌細(xì)胞中心肌酶LDH、CK和AST活性非常低,而當(dāng)心肌細(xì)胞膜受損后,心肌酶將迅速大量釋放,導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH、CK和AST含量明顯增高[13]。實驗結(jié)果顯示,用H2O2干預(yù)的肉豆蔻-8散不同劑量組均能夠顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK和AST活性且呈劑量依賴性,表明肉豆蔻-8散提取物能夠抑制損傷心肌細(xì)胞LDH、CK和AST的漏出,維護細(xì)胞膜的完整性,起到保護心肌細(xì)胞的作用。

    不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜主要成分之一,在氧自由基的攻擊下極易發(fā)生脂質(zhì)過氧化而生成MDA。MDA的含量常??煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,能夠間接反映出心肌細(xì)胞損傷的程度[14];SOD是生物體內(nèi)清除自由基的重要酶類之一,是評估機體抗氧化防御體系功能的重要指標(biāo)。SOD可對抗或阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害,并及時修復(fù)受損細(xì)胞,具有特殊的生理活性[15];NO是一種新型的生物信息遞質(zhì),NO的含量過高會對心肌細(xì)胞產(chǎn)生強烈的毒性損傷[16-17]。實驗結(jié)果表明,肉豆蔻-8散各劑量組細(xì)胞內(nèi)MDA含量較模型組明顯降低,SOD活力明顯比模型組增高;經(jīng)H2O2損傷后,心肌細(xì)胞內(nèi)NO含量明顯升高,造成線粒體酶活性被抑制。肉豆蔻-8散提取物可明顯降低損傷后心肌細(xì)胞內(nèi)NO含量。

    本實驗通過流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI染色,測定細(xì)胞凋亡率。實驗結(jié)果顯示,肉豆蔻-8散提取物可明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡,對H2O2損傷的心肌細(xì)胞凋亡有明顯保護作用。

    本研究認(rèn)為肉豆蔻-8散提取物對心肌細(xì)胞具有顯著抗過氧化損傷保護作用,可以抑制細(xì)胞凋亡,提示肉豆蔻-8散可能成為良好的防治心血管疾病的物質(zhì)基礎(chǔ),有望為心血管疾病的治療發(fā)揮重要作用。

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