Caco-2細(xì)胞單層模型中水飛薊賓吸收機(jī)制研究

胡 林，童 煥，丁 茹，王湛博，尤淋君，楊 勁*

（中國(guó)藥科大學(xué) 1藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中心，南京210009；2新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，南京211198）

水飛薊素是菊科植物水飛薊（Silybum marianum（L.）Gaertn.）干燥果實(shí)的活性提取物。水飛薊賓（silybin）是水飛薊素的黃酮木質(zhì)素類(lèi)化合物的主要活性成分［1］，水飛薊賓葡甲胺為水飛薊賓的成鹽衍生物，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。水飛薊賓是公認(rèn)的具有保肝作用的藥物，在國(guó)內(nèi)臨床上應(yīng)用于急慢性肝炎、脂肪肝的肝功能異常的恢復(fù)。目前國(guó)內(nèi)市售的制劑有水飛薊賓膠囊和水飛薊賓葡甲胺片，其中膠囊劑是水飛薊賓和卵磷脂復(fù)合物［2］。水飛薊賓具有低水溶性和低脂溶性的物理特性，原料藥口服生物利用度低［3］。通過(guò)在比格犬體內(nèi)比較市售的水飛薊賓膠囊和水飛薊賓葡甲胺片、水飛薊賓原料藥羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）混懸液的絕對(duì)生物利用度（bioavailablity，BA）發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓原料藥的絕對(duì)BA小于5%，膠囊劑和成鹽片劑的絕對(duì)BA相比于原料藥有很大的提高，但兩者提高BA的程度有較大差異（結(jié)果另文發(fā)表）。目前僅有少數(shù)文獻(xiàn)有部分水飛薊賓的吸收機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。水飛薊賓的胃腸道吸收分?jǐn)?shù)為20%～47%［4］，在大鼠單向腸灌流試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水飛薊賓在小腸吸收良好［5－6］，水飛薊賓的表觀滲透系數(shù)（Papp（AP-BL））約為3×10－7cm／s［7］，跨膜通透性低。這些研究結(jié)果不全面、不系統(tǒng)、機(jī)制不明確，且結(jié)論彼此矛盾。已證實(shí)藥物在Caco-2單層細(xì)胞的滲透性與藥物在人體中胃腸道吸收有良好的相關(guān)性，它是預(yù)測(cè)藥物在人體吸收的金標(biāo)準(zhǔn)［8－9］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用 Caco-2單層細(xì)胞模型研究不同濃度的水飛薊賓和水飛薊賓葡甲胺的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通透性，為進(jìn)一步改良水飛薊賓的劑型，增加生物利用度，并減少生物利用度的變異提供理論基礎(chǔ)。

Figure 1 Structure of silybin and silybin-N-meglumine

1 材 料

1.1 藥品和細(xì)胞株

水飛薊賓原料藥（純度：98%，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；水飛薊賓葡甲胺原料藥（純度：83.45%，南京宸翔醫(yī)藥研究有限責(zé)任公司）；氯唑沙宗對(duì)照品（純度：99.99%，批號(hào)：100364-201302，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；熒光黃［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］；鹽酸普萘洛爾（純度：99.00%）、阿替洛爾（純度：99.00%）購(gòu)于 Biochemistry公司；Caco-2細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，實(shí)驗(yàn)中所用的代數(shù)在20～45代之間。

1.2 試劑和材料

DMEM培養(yǎng)基（含 4.0 mmoL／L谷氨酰胺，4 500 mg／L葡萄糖）、胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；青鏈霉素（美國(guó) Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶、非必需氨基酸（美國(guó) Gibco公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)ROE Scientific公司）；其他試劑均為分析純；Millicell懸掛式培養(yǎng)小室（材料：聚酯膜，孔徑：1.0μm，膜面積：0.3 cm2；美國(guó) Millipore公司）；培養(yǎng)皿、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（上海圣納堡生物科技開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.3 儀 器

LC／MS／MS液質(zhì)聯(lián)用儀（4000 Q-Trap質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司；Agilent 1290超高效液相儀，美國(guó)Agilent公司）；跨膜電阻儀（Millcell?-ERS-2，美國(guó)Millipore公司）；恒溫振蕩儀（浙江卓恒公司）；生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Nexcelom Bioscience公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）。

2 方 法

2.1 HBSS緩沖液中水飛薊賓的檢測(cè)

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kinetex XB-C18（2.1×50 mm，2.6μm，Phenomenex公司）；流速：0.3 mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣盤(pán)溫度：6℃；進(jìn)樣體積10μL；洗針液：甲醇-水（1∶1）；流動(dòng)相：純水（含0.1%甲酸，A相）；乙腈（B相）；梯度洗脫：0～0.5 min，20%B；0.5～1 min，20～65%B；1～2.4 min，65%B，2.4～2.5min，65% ～90%B；2.5～3.4 min，90%B；3.4～3.5 min，90% ～20%B；3.5～4.5 min，20%B。

2.1.2 質(zhì)譜方法 離子采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）?？倳r(shí)間4.5 min，切入質(zhì)譜時(shí)間為1.2 min，切出質(zhì)譜時(shí)間為2.8 min。氣路參數(shù)：CUR：25 psi（1 ps＝6 894.8 Pa）；IS：－4 500 V；TEM：500℃；GS1：50 psi；GS2：50 psi。化合物參數(shù)：水飛薊賓：定量離子對(duì) 481.2／300.8；DP：－100 V；CE：－28 V；CXP：－15 V；EP：－10 V。氯唑沙宗（內(nèi)標(biāo)）：定量離子對(duì) 168.1／131.7；DP：－65 V；CE：－27.6 V；CXP：－6 V；EP：－10 V。

2.1.3 水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密稱(chēng)取2份水飛薊賓10.20 mg于10 mL量瓶中，用乙腈定容到刻度線，即得1 mg／mL的母液。其中一份稀釋為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：0.02，0.1，0.2，1，2，10，20，30μg／mL。另一份稀釋為質(zhì)控樣品工作液：0.04，1.6，8，24μg／mL。分別精密移取標(biāo)曲工作液和質(zhì)控工作液10μL，加細(xì)胞溫孵過(guò)空白HBSS緩沖液190μL，渦旋混勻，即得模擬標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（1，5，10，50，100，500，1 000，1 500 ng／mL）和質(zhì)控樣品（2，80，400，1 200 ng／mL）。

2.1.4 前處理方法 移液槍移取樣品30μL加氯唑沙宗乙腈溶液（內(nèi)標(biāo)，54 ng／mL）10μL，混勻后，加乙腈（析出緩沖鹽）270μL渦旋混勻，12 000 r／min，4℃，離心 5 min，取上清液 75μL與超純水75μL混勻進(jìn)樣。

2.2 HBSS緩沖液中阿替洛爾和普萘洛爾的檢測(cè)

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×50 mm，2.7μm）；流速：0.3 mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣盤(pán)溫度：6℃；進(jìn)樣體積5μL；洗針液：甲醇-水（1∶1）；流動(dòng)相：純水（含0.1%甲酸，A相）；乙腈（B相）；梯度洗脫：0～0.6 min，10%B；0.6～0.8min，10% ～65%B；0.8～2.4min，65%B，2.4～2.5min，65% ～90%B；2.5～3.1min，90%B；3.1～3.2 min，90% ～10%B；3.2～4.5 min，10%B。

2.2.2 質(zhì)譜方法 氣路參數(shù)：CUR：28 psi；IS：4 500 V；TEM：400℃；GS1：10 psi；GS2：10 psi?；衔飬?shù)：阿替洛爾：定量離子對(duì)267.6／145.3；DP：60 V；CE：40 V；CXP：13 V；EP：15 V。普萘洛爾：定量離子對(duì) 260.6／116.4；DP：47 V；CE：25 V；CXP：10 V；EP：10 V。奧美拉唑（內(nèi)標(biāo)）：定量離子對(duì)346.7／198.3；DP：35 V；CE：15 V；CXP：10 V；EP：10 V?？倳r(shí)間4.5 min，切入質(zhì)譜時(shí)間為0.5 min，切出質(zhì)譜時(shí)間為2.5 min。

2.2.3 普萘洛爾和阿替洛爾的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密稱(chēng)取阿替洛爾10.00 mg、鹽酸普萘洛爾11.45 mg，分別放置于10 mL量瓶中，用甲醇定容到刻度線，即得1 mg／mL的母液。分別精密移取阿替洛爾母液（1 mg／mL）和普萘洛爾母液（1mg／mL）1mL置于10mL量瓶中，用甲醇定容到刻度線即得100μg／mL的混合母液。使用混合母液依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：0.04，0.1，0.2，0.4，1，2，4，10μg／mL。按上述操作制備另一份混合母液依次稀釋為質(zhì)控樣品工作液：0.1，0.8，8μg／mL。分別精密移取標(biāo)曲工作液和質(zhì)控工作液10μL，加細(xì)胞溫孵過(guò)空白HBSS緩沖液190μL，渦旋混勻，即得模擬標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品。

2.3 熒光黃的檢測(cè)

精密稱(chēng)取熒光黃15.65 mg于100 mL量瓶中，使用HBSS緩沖液定容至刻度，即得300μmol／L熒光黃溶液。用HBSS逐級(jí)稀釋300μmol／L熒光黃為 5，10，50，100，500，1 000 nmol／L標(biāo)曲工作溶液，采用多功能酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)466 nm，發(fā)射波長(zhǎng)522 nm測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的熒光強(qiáng)度。

2.4 Caco-2細(xì)胞模型的建立和評(píng)價(jià)

小室中的接種與培養(yǎng)：取狀態(tài)良好的復(fù)蘇第4代之后的細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1.0×105個(gè)，接種24 h后更換培養(yǎng)液，第1周隔天換液，1周后每天換液，培養(yǎng)21 d。細(xì)胞單層完整性的形成：將Caco-2細(xì)胞按上述接種密度接種到直徑為35 mm的培養(yǎng)皿，在接種后第1，3，7，12，21天使用倒置顯微鏡拍照。細(xì)胞單層致密性的形成：使用Millicell?-ERS跨膜電阻儀測(cè)定Caco-2細(xì)胞接種到小室后的第1，3，7，12，21天的電阻值。檢測(cè)細(xì)胞單層的滲透性：測(cè)定300μmol／L熒光黃AP-BL側(cè)的通透性。

2.5 給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

2.5.1 藥物的配制

給藥組：分別精密稱(chēng)取水飛薊賓102.04 mg和水飛薊賓葡甲胺119.83 mg于10 mL量瓶中，用DMSO溶液定容至刻度線即得10 mg／mL的母液。分別將給藥組母液用HBSS緩沖液稀釋成：水飛薊賓 HBSS（5，20，50μg／mL）；水飛薊賓葡甲胺 HBSS（28μg／mL，體系中的 DMSO含量最終不超過(guò)0.5%）。

陽(yáng)性對(duì)照組：分別精密稱(chēng)取鹽酸普萘洛爾148.00 mg和阿替洛爾133.20 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容到刻度線即得50 mmoL／L的母液，轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)取上述母液50μL于50 mL量瓶中，用HBSS緩沖液分別稀釋1 000倍即得所需實(shí)驗(yàn)濃度的普萘洛爾（50μmoL／L）和阿替洛爾（50μmoL／L）的HBSS溶液。

2.5.2 最大藥物濃度和溶劑對(duì)單層電阻值的影響

細(xì)胞在小室中培養(yǎng)21 d后，分別在給予50μg／mL水飛薊賓的1 h和2 h測(cè)定Caco-2細(xì)胞單層的電阻值。給藥2 h后將給藥孔兩側(cè)更換為細(xì)胞培養(yǎng)液，在更換培養(yǎng)基后24 h再次測(cè)定給藥孔的電阻。

2.5.3 正式轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 小室中細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，選取電阻合格的孔室進(jìn)行正式的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。取出細(xì)胞板后倒掉小室兩側(cè)的培養(yǎng)基，用HBSS清洗3次，第3次在培養(yǎng)箱中孵30 min。對(duì)AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)：AP側(cè)加含藥的HBSS緩沖液200μL，作為給藥側(cè)，BL側(cè)加入空白HBSS緩沖液1 000μL，作為接收側(cè)；對(duì)于BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)：BL側(cè)加入含藥的 HBSS緩沖液1 000μL，作為給藥側(cè)，AP側(cè)加入空白HBSS緩沖液200μL，作為接收側(cè)。給藥后將培養(yǎng)板置于37℃恒溫振蕩儀孵育，分別于30、60、90和120 min在接受側(cè)收取溶液100μL，取樣后同時(shí)加入空白預(yù)熱的HBSS液100μL。試驗(yàn)結(jié)束后收集兩側(cè)溶液，計(jì)算回收率。

2.6 數(shù)據(jù)的計(jì)算與處理

2.6.1 表觀通透系數(shù)（Papp）的計(jì)算

dQ／dt為單位時(shí)間內(nèi)藥物通過(guò)Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)量，以藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量（Q）對(duì)取樣時(shí)間（t）作圖后，該直線的斜率為 dQ／dt；A為小室的膜面積，0.3 cm2；C0為給藥測(cè)藥物的初始濃度。

2.6.2 藥物外排率的計(jì)算

若藥物的ER大于2，說(shuō)明藥物的吸收過(guò)程可能有外排轉(zhuǎn)運(yùn)體參與。

2.6.3 回收率的計(jì)算［10］

計(jì)算公式中Mr-120是接受側(cè)120 min時(shí)藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量，包括取出樣品中的藥物量，Md-120給藥側(cè)剩余藥量，Md-0實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)給藥側(cè)的總藥量。

2.6.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。采用兩獨(dú)立樣本的雙側(cè)t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析對(duì)多組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表明差異有顯著性意義。

3 結(jié) 果

3.1 水飛薊賓HBSS緩沖液中方法學(xué)驗(yàn)證

特異性：在本試驗(yàn)的LC-MS／MS條件下，水飛薊賓的出峰時(shí)間為1.80 min，內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗的出峰時(shí)間為1.83 min。空白樣本、水飛薊賓以及內(nèi)標(biāo)的特異性色譜圖見(jiàn)圖2。

殘留效應(yīng)：在高濃度樣本ULOQ進(jìn)樣分析后，接著分析空白樣本，本方法未觀察到殘留效應(yīng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限：按“2.1.3”和“2.1.4”步驟處理標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品并同時(shí)制備空白樣本及含內(nèi)標(biāo)的空白樣本，進(jìn)行LC-MS／MS分析。以待測(cè)物峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f＝As／Ai），對(duì)待測(cè)物濃度c作權(quán)重回歸計(jì)算，選1／c2為權(quán)重因子得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，水飛薊賓：y＝0.012 5x＋0.006 29，r＝0.996 6（n＝8）。表明水飛薊賓在 1～1 500 ng／mL內(nèi)線性關(guān)系良好。水飛薊賓LLOQ為 1 ng／mL，準(zhǔn)確度為 83.7% ～118.0%，RSD為13.8%。

稀釋效應(yīng)：考察了超限樣品稀釋5，20，50倍，其中 RSD在2.7～5.7%之間，RE在 －5.1% ～－9%。

準(zhǔn)確度和精密度：按“2.2.3”和“2.2.4”步驟處理質(zhì)控樣品，2 d完成3個(gè)分析批，批間和批內(nèi)的RE在 －5.6%～2.9%，批間和批內(nèi) RSD在4.1%～14.5%。

水飛薊賓在HBSS緩沖液中的穩(wěn)定性：準(zhǔn)確度在±15%，RSD均小于15%。各項(xiàng)結(jié)果均符合要求FDA生物樣本分析方法學(xué)驗(yàn)證的要求［11］，表明此檢測(cè)方法穩(wěn)定可靠。

3.2 Caco-2細(xì)胞單層的生長(zhǎng)過(guò)程

倒置顯微鏡下觀察到的Caco-2細(xì)胞單層從接種到小室中的第1天到第21天的生長(zhǎng)過(guò)程見(jiàn)圖3。到第21天時(shí)，Caco-2細(xì)胞基本無(wú)間隙，形成緊密連接。

Figure 2 Representative MRM chromatograms of（A）silybin and（B）chlorzoxazone（IS）for（I）blank HBSS buffer and（II）blank sample spiked with silybin，chlorzoxazone.Arrows indicate retention time of silybin and IS

Figure 3 Growth process of Caco-2 cellmonolayermodel after seeding（×100）

3.3 Caco-2細(xì)胞單層形成過(guò)程中跨膜電阻值變化

Caco-2細(xì)胞接種到小室后，從第1周到第2周TEER隨著接種的時(shí)間逐漸增大，直到第3周時(shí)TEER增長(zhǎng)極其緩慢，幾乎達(dá)到飽和，不再增長(zhǎng)。到第21天時(shí)TEER已超過(guò)350Ω·cm2。TEER值易受多種因素的影響，一般Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)到15～21 d時(shí)，達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境會(huì)得到不同的TEER，有的低至150Ω·cm2，有的高至900Ω·cm2。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中TEER已達(dá)穩(wěn)定的趨勢(shì)以及熒光黃的Papp呈現(xiàn)低滲透性的特點(diǎn)，表明本實(shí)驗(yàn)中Caco-2細(xì)胞單層模型的致密性良好［12］。

3.4 熒光黃、阿替洛爾和普萘洛爾細(xì)胞單層的滲透性結(jié)果

Caco-2細(xì)胞在小室中培養(yǎng)21 d后，熒光黃（300μmoL／L）、阿替洛爾（50μmoL／L）、普萘洛爾（50μmoL／L）的細(xì)胞單層滲透性結(jié)果見(jiàn)表2。熒光黃的Papp在5.83～7.03×10－10cm／s之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1×10－7cm／s，表明此孔的緊密連接合格［7］。文獻(xiàn)中報(bào)道的阿替諾爾Papp約為2.01×10－7cm／s，普萘洛爾Papp約為 4.19×10－5cm／s［8，13］，本研究所得的阿替洛爾的Papp遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普萘洛爾，并且兩者的Papp與文獻(xiàn)中報(bào)道相接近。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功建立了Caco-2細(xì)胞單層模型。

Table 1 Change of TEER value during Caco-2 cellmonolayer formation

Table 1 Change of TEER value during Caco-2 cellmonolayer formation

TEER：Transepithelial eletrical resistance

Time of cultivation／d TEER／（Ω·cm2）11.5±3.12 3 25.3±1.25 7 168.1±3.30 12 335.4±4.25 1 21 366.4±7.67

Table 2 P app value of lucifer yellow and positive control drugsn＝3）

Table 2 P app value of lucifer yellow and positive control drugsn＝3）

AP：Apical；BL：Basal

Group Direction：AP-BL P appˉx±s Propranolol（50μmoL／L） 15.12×10－6 （13.85±1.53）×10－6 14.28×10－6 12.16×10－6 Atenolol（50μmoL／L） 0.79×10－6 （0.77±0.04）×10－6 0.73×10－6 0.81×10－6 Lucifer yellow（300μmoL／L） 5.88×10－10 （6.25±0.68）×10－10 5.83×10－10 7.03×10－10

3.5 水飛薊賓的最大濃度和溶劑對(duì)單層電阻值的影響

在Caco-2細(xì)胞單層的AP側(cè)給予50μg／mL水飛薊賓后，使用跨膜電阻儀檢測(cè)細(xì)胞單層的電阻值變化，見(jiàn)表3。TEER變化很小，表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞單層的完整性不受影響。

Table 3 TEER of Caco-2 monolayer was observed after adding50μg／mL silybin in apical side

Table 3 TEER of Caco-2 monolayer was observed after adding50μg／mL silybin in apical side

The time after silybin added to apical side／h TEER／（Ω·cm2）0 366.4±7.67 1 358.2±5.74 2 333.6±3.24 24 354.7±3.15

3.6 水飛薊賓雙向轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果

同一濃度水平的藥物，隨著時(shí)間的增加，藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量呈線性增加；同一時(shí)間點(diǎn)，隨著濃度的增加，藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量也增加，見(jiàn)圖4，說(shuō)明藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)量具有時(shí)間（r＞0.99）和濃度的相關(guān)性。低、中、高3個(gè)濃度水平的水飛薊賓和中濃度的水飛薊賓葡甲胺Papp（AP-BL）平均值分別為 2.01×10－6cm／s；2.93×10－6cm／s；3.81×10－6cm／s；2.70×10－6cm／s，Papp（BL-AP）平均值分別為 14.52×10－6cm／s；13.09×10－6cm／s；11.86×10－6cm／s；9.77×10－6cm／s（圖5）。由Papp（AP-BL）大于2×10－6cm／s，可判斷水飛薊賓有良好的通透性［14］，水飛薊賓溶解度低，在BSC系統(tǒng)中為Ⅱ類(lèi)藥物。結(jié)果顯示ER遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2（圖6），表明水飛薊賓的吸收過(guò)程中可能有外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的參與。低濃度組的Papp（AP－BL）與高濃度組的存在顯著性差異（P＜0.05），隨著水飛薊賓濃度的增加ER值有減少的趨勢(shì)，可能是由于藥物高濃度時(shí)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體被飽和，這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)中報(bào)道的水飛薊賓為P-gp底物，可抑制P-gp活性的結(jié)論相一致［15］。此外中濃度的水飛薊賓和水飛薊賓葡甲胺的Papp相近，表明水飛薊賓成鹽對(duì)于跨膜通透性沒(méi)有改變。

Figure 4 Relationship between cumulative transport amount and time of silybin and silybin-N-meglumine（AP-BL）

Figure5 P app valuesof silybin and silybin-N-meglumine（ˉx±s，n＝3）*P＜0.05

Figure 6 Efflux ratio of silybin and silybin-N-meglumine**P＜0.01，***P＜0.001

3.7 Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)回收率的計(jì)算

在Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)取給藥測(cè)和接受測(cè)的樣品，檢測(cè)給藥初始濃度和給藥測(cè)濃度，由表4可知平均回收率在80%～94%之間，說(shuō)明細(xì)胞單層對(duì)藥物的吸附和溶劑的蒸發(fā)基本對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響，實(shí)驗(yàn)中得到的Papp是準(zhǔn)確的［9］。

Table 4 Recovery of in transport in Caco-2 cell

Table 4 Recovery of in transport in Caco-2 cell

M d-120：Residue of silybin at120 min on the administration side；M r-120：Cumulative transportamountof silybin at120 min in receiving side；M d-0：Total amount of silybin at the beginning

Group Direction c／（μg／mL） M d-120／（ng） M r-120／（ng） M d-0／（ng）Recovery／%Silybin AP-BL 5 843±32 19±3 1 020±14 85±3 20 2 928±236 117±13 3812±7 80±6 50 8 597±1 480 365±81 10 700±11 84±13 Silybin-N-meglumine 28 2 590±139 103±9 3 342±6 81±4 Silybin BL-AP 5 4 480±160 144±12 5 100±69 91±3 20 16 880±216 475±7 19 060±37 91±1 50 44 733±2 380 1 062±153 53 500±57 86±4 Silybin-N-meglumine 28 15 340±1 588 372±16 16 710±30 94±9

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)在Caco-2模型中初步考察了水飛薊賓吸收機(jī)制，為改良已有的上市劑型，增加生物利用度，并同時(shí)減少變異提供理論依據(jù)。水飛薊賓雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)表明水飛薊賓的跨膜通透性良好，可判斷水飛薊賓在BSC系統(tǒng)中為Ⅱ類(lèi)藥物，水飛薊賓在胃腸道中的釋放是其吸收過(guò)程的重要影響因素，增加水飛薊賓的溶解度和溶出速率，可提高其口服生物利用度。市售的水飛薊賓卵磷脂復(fù)合物的膠囊劑和水飛薊賓成鹽片劑在比格犬體內(nèi)生物利用度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明膠囊劑和成鹽片劑的絕對(duì)生物利用度相比于原料藥均有極大的提高，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。為進(jìn)一步明確膠囊劑與成鹽片劑提高口服生物利用度的程度不同的原因，還需通過(guò)體外溶出實(shí)驗(yàn)考察藥物磷脂復(fù)合物的形成、成鹽、晶型、減小粒徑對(duì)藥物釋放的影響。此外，Caco-2細(xì)胞模型在研究由轉(zhuǎn)運(yùn)體參與和細(xì)胞旁介導(dǎo)的吸收時(shí)有其局限性［16］，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)可能有外排轉(zhuǎn)運(yùn)體參與水飛薊賓的吸收，因此除了Caco-2細(xì)胞模型外還需使用其他方法來(lái)進(jìn)一步研究水飛薊賓的吸收機(jī)制。

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