間苯三酚法快速測定玉米芯水解液中單糖含量1

高曉峰 ， 蘭 萌 ， 楊明琰 ,2*， 段 潔 ， 樊 成

（1. 長安大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710054；2. 旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室，陜西 西安 710054；3. 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710048）

近年來，隨著人口增長、土地資源緊張等問題日益嚴(yán)重，使得以玉米、木薯等糧食作物作為主要原料的第一代生物質(zhì)能源成本日益走高，同時面臨“與人爭糧，與糧爭地”困境，發(fā)展前景受到限制。木質(zhì)纖維素原料包括農(nóng)業(yè)秸稈、城市固體廢棄物、辦公廢紙、雜草、鋸末等，與糧食原料相比，其原料更豐富，價格更低廉，以其作為原料生產(chǎn)液體替代燃料的第二代生物質(zhì)能源極具發(fā)展前景，在美國、巴西及歐洲已形成新的可再生能源產(chǎn)業(yè)[1]。木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素、半纖維素、纖維素組成，其生物轉(zhuǎn)化包括預(yù)處理、酶解和發(fā)酵三個階段，木質(zhì)纖維素酶解液中含有大量的葡萄糖和木糖，其含量是衡量木質(zhì)纖維預(yù)處理方法有效性的重要指標(biāo)，因此在實驗室建立快速準(zhǔn)確的單糖測定方法十分重要。

目前實驗室測定單糖常用的方法有3,5-二硝基水楊酸比色（DNS）法[2]、酶標(biāo)法、高效液相色譜（HPLC）法[3-4]、間苯三酚法[5]等。其中DNS 法易受其它還原糖的干擾，選擇性不高，不能直接測定水解液中的單糖含量；現(xiàn)有的酶標(biāo)法只能用于測定葡萄糖含量；HPLC 法對檢測條件要求高，測定周期長，不便于實驗室快速測定；間苯三酚法是由Eberts T J[6]等提出的一種木糖測定方法，可用于臨床血液、尿液中木糖的快速檢測及發(fā)酵液中木糖的測定[7-10]，具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點。本實驗采用間苯三酚-濃硫酸顯色法建立雙波長分光光度法測定溶液中木糖和葡萄糖的含量，對該方法的最佳測定條件及溶液中木糖及葡萄糖的相互影響進(jìn)行了分析，探究其用于測定木質(zhì)纖維素酶解液中木糖和葡萄糖的可行性。

1 實驗

1.1 玉米芯水解液

1.1.1 玉米芯原料

玉米芯原料來自西安市長安區(qū)，自然干燥，用粉碎機(jī)粉碎后過20目篩備用。

1.1.2 酸-堿耦合處理酶解液制備

玉米芯原料用2%稀硫酸120℃處理60 min，得酸水解液，抽濾，殘渣用1%氫氧化鈉60℃處理2 h后，按15 FPU/g葡聚糖加入纖維素酶Cellic?CTec2，50℃，180 r/min酶解72 h得酸-堿耦合處理酶解液。

1.2 儀器與試劑

紫外可見分光光度計（L6S型，上海儀電分析儀器有限公司），電子天平（BS-224-S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

間苯三酚、無水乙醇、濃硫酸、D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，均為分析純。

纖維素酶Cellic?CTec2：由Novozymes North America（由丹麥諾維信酶制劑公司提供），酶活性147 FPU/mL。

1.3 溶液的配制

分別稱取0.030 0 g烘干至恒重的木糖和葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配制成300 μg/mL的木糖及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

顯色劑的配制：2%的間苯三酚的乙醇溶液與濃硫酸體積比為1∶1混合。

1.4 實驗方法

1.4.1 吸收光譜的測定

分別精確移取200 μL木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水至1 mL，再各加入5 mL顯色劑，混勻，100℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫后再加入10 mL蒸餾水混勻，在波長為380～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以蒸餾水為空白對照。

1.4.2 顯色時間對吸光度的影響

分別準(zhǔn)確吸取200 μL木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加蒸餾水至1 mL，再各加入5 mL顯色劑，混勻，100℃水浴顯色2、5、10、15、20、25 min，方法同“1.4.1”，分別在木糖和葡萄糖的最大吸收波長下測定吸光度值，確定最佳水浴加熱時間。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取300 μg/mL葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1～1.0 mL，其它方法同“1.4.1”，分別在葡萄糖和木糖最大吸收波長下測定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 顯色劑放置時間的影響

配制顯色劑，分別放置 0、24、48、72 h，按“1.4.1”方法分別測定木糖和葡萄糖含量，確定顯色劑放置時間對測定結(jié)果的影響。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗

分別移取200 μL木糖和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定方法同“1.4.1”，顯色后每隔10 min測定一次，測定至一個小時，檢驗顯色物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.4.6 回收率試驗

分別移取150 μL木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，再向其中分別加入10～90 μL的木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定方法同“1.4.1”，測定木糖和葡萄糖的含量，計算木糖和葡萄糖的回收率。

1.4.7 精密度試驗

分別精確移取木糖和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)液200 μL于試管中，測定方法同“1.4.1”，同時做5份平行樣品，測定木糖和葡萄糖的含量，并計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.8 葡萄糖和木糖之間相互的干擾

取600 μL木糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別精確加入0、50、100、150、200、250 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋10倍，測定方法同“1.4.1”，計算木糖的濃度，確定溶液中葡萄糖對木糖的影響。

同理，分別取600 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別精確加入0、50、100、150、200、250 μL木糖標(biāo)準(zhǔn)液稀釋10倍，測定方法同“1.4.1”，計算葡萄糖的濃度，確定溶液中木糖對葡萄糖的影響。

1.4.9 玉米芯水解樣品中葡萄糖和木糖含量的測定

將待測玉米芯酸水解液稀釋到合適的濃度，測定水解液中木糖的含量；將待測玉米芯酸堿耦合處理酶解液稀釋至合適的濃度，測定酶解液中葡萄糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜的測定

以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制木糖和葡萄糖的吸收光譜圖，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，木糖和葡萄糖分別與顯色劑反應(yīng)后，分別在波長為 444 nm、420 nm處有最大吸收峰，因此，選擇444 nm作為測定木糖的波長，選擇420 nm作為測定葡萄糖的波長。

圖1 葡萄糖和木糖顯色液的吸收光譜掃描

圖2 木糖葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 顯色時間對吸光度的影響

分別測定葡萄糖和木糖在不同顯色時間的吸光度，以確定顯色時間對吸光度的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，吸光度在顯色2～10 min內(nèi)上升較快，10 min以后變化趨于緩慢，綜合考慮，選10 min為最佳水浴時間。

2.3 木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖 3所示。由圖可知木糖和葡萄糖濃度在20～120 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系，其R2值分別為0.995 9、0.998 2，說明該方法具有良好的線性關(guān)系。

2.4 顯色劑放置時間的影響

顯色劑配制后放置0、24、48、72 h后再測定，研究其放置時間對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，顯色劑放置 72 h后，木糖和葡萄糖的測定結(jié)果分別為新配制的 95.48%、95.57%，說明顯色劑放置72 h后對兩者測定結(jié)果影響不大。

圖3 顯色時間對吸光度的影響

2.5 穩(wěn)定性試驗

木糖及葡萄糖溶液顯色后，每隔10 min測定一次直至1 h，確定顯色物質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，放置1 h后木糖和葡萄糖的吸光度分別為最初的102.92%、101.40%，表明在顯色后1 h范圍內(nèi)的測定數(shù)據(jù)都是準(zhǔn)確的。

2.6 回收率試驗

在標(biāo)準(zhǔn)木糖和葡萄糖溶液中分別加入一定量的木糖和葡萄糖，再分別測定其含量、計算回收率，結(jié)果如表1、2所示。由表1、2可知，木糖的平均回收率為100.82%，RSD為0.32%，葡萄糖的平均回收率為100.65%，RSD為0.46%。

表1 木糖回收率試驗結(jié)果

表2 葡萄糖回收率試驗結(jié)果

2.7 精密度試驗

對同一樣品的5份平行樣分別進(jìn)行測定，木糖測定結(jié)果如表3所示，木糖濃度的平均值為60.37 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.8432 μg/mL，RSD為 1.3967%，葡萄糖測定結(jié)果如表 4所示，葡萄糖濃度的平均值為60.39 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8430 μg/mL，RSD為1.3959%。表明這種方法的重復(fù)性高，準(zhǔn)確性高。

表3 木糖精密度試驗結(jié)果

表4 葡萄糖精密度試驗結(jié)果

2.8 木糖與葡萄糖的相互干擾試驗

由于玉米水解液中存在大量的木糖和葡萄糖，為了保證測定的精確性，對溶液中的葡萄糖和木糖之間是否存在干擾進(jìn)行了驗證，結(jié)果如表5、6所示。由表5、6可知，當(dāng)溶液中兩者濃度較接近時，如600 μg/mL的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入250 μg/mL的葡萄糖時，木糖的測定值是其標(biāo)準(zhǔn)值的129.13%，結(jié)果明顯偏大。而600 μg/mL的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入50 μg/mL的葡萄糖時，木糖的測定結(jié)果是其標(biāo)準(zhǔn)植的103.62%。同樣，600 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入250 μg/mL的木糖時，葡萄糖的測定值是其標(biāo)準(zhǔn)值的127.15%，結(jié)果明顯偏大。而600 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入50 μg/mL的木糖時，葡萄糖的測定結(jié)果是其標(biāo)準(zhǔn)植的102.02%。說明只有當(dāng)溶液中木糖和葡萄糖的濃度相差10倍以上時，該方法才能用于對溶液中木糖和葡萄糖的測定。

表5 葡萄糖對木糖測定的影響

表6 木糖對葡萄糖測定的影響

2.9 玉米芯水解樣品中葡萄糖和木糖含量的測定

玉米芯原料用2%稀硫酸120℃處理60 min后，大部分半纖維素水解，因此水解液中以木糖為主，存在少量的葡萄糖。而酸堿耦合處理后的酶解液中以葡萄糖為主，只有少量的木糖，因此可以用雙波長法對兩步水解液中的木糖及葡萄糖進(jìn)行測定。經(jīng)過測定，5 g絕干玉米芯原料中纖維素及半纖維素的含量分別為2.222 g、2.081 g，實驗測得5 g絕干玉米芯酸水解液及酶解液中木糖和葡萄糖的含量分別為1.799 g、1.987 g，由此計算酸水解中半纖維素的水解率為86.45%，酸堿耦合處理后纖維素的酶解率為89.43%。

3 結(jié)論

采用雙波長分光光度法測定玉米芯水解液中木糖和葡萄糖的含量，最佳測定條件是1 mL樣品中加入5 mL顯色劑，在100℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫，分別在波長為444 nm和420 nm下測定木糖和葡萄糖的吸光度。配置好的顯色劑放置在72 h內(nèi)可以用于測定，顯色后在1 h內(nèi)顯色物質(zhì)穩(wěn)定。

該方法操作簡單，精確度高，在實驗室可以快速方便地測定溶液中葡萄糖和木糖的濃度。但是由于葡萄糖和木糖之間存在相互影響，在測定木質(zhì)纖維素水解液中木糖和葡萄糖的含量時，特別是兩者濃度接近時會使測定數(shù)值偏高，只有當(dāng)兩者濃度相差較大時才可以用于測定木質(zhì)素水解液中木糖和葡萄糖的含量。

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